馬衛(wèi)　劉誠　邵闖　陳玲　倪紅

摘要：從富磷礦區(qū)的土壤中，篩選出高效的溶磷真菌，并對其進行了分子生物學鑒定以及溶磷條件的優(yōu)化。通過溶磷圈法分離、鉬銻抗比色法測定菌株對不同難溶性磷酸鹽的溶解效果，結(jié)合菌落形態(tài)特征及ITS rDNA 序列分析對目標菌株進行了鑒定，采用正交試驗優(yōu)化了其溶解磷酸鈣的條件。結(jié)果表明：溶磷真菌MEM07鑒定為黑曲霉（Aspergillus niger）。液體搖瓶培養(yǎng)條件下，真菌MEM07對磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁、磷礦粉均有較強的溶解能力，溶磷量分別為1242.49 mg/L、1350.05 mg/L、712.03 mg/L、827.29 mg/L。菌株MEM07溶解磷酸鈣的最優(yōu)條件為：碳源葡萄糖，氮源尿素，當28 ℃、初始pH為7.0時，溶磷量達到1489.71 mg/L。

關(guān)鍵詞：溶磷真菌；難溶性磷酸鹽；篩選；鑒定；發(fā)酵條件優(yōu)化

中圖分類號：S154.3

文獻標識碼：A文章編號：16749944（2017）20019303

1引言

磷是植物體內(nèi)蛋白質(zhì)、核酸、脂類等有機化合物合成的主要元素，是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素之一[1]。我國約74%的耕地土壤缺磷，且大部分磷素是不為植物吸收利用的固化磷，因此在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中往往通過施加磷肥提高作物產(chǎn)量，改善土壤缺磷問題。但施入土壤中的磷肥當季作物利用率比較低，導致土壤中磷不斷積累，進而土壤板結(jié)、品質(zhì)退化，污染了生態(tài)環(huán)境。因此，提高土壤中磷的利用率對改善土壤結(jié)構(gòu)、保護生態(tài)環(huán)境等方面的研究具有重要意義[2～4]。近年來，從植物根際土壤中篩選得到高效溶解難溶性磷的溶磷菌，來改善土壤品質(zhì)，已成為提高土壤有效磷含量的研究熱點[5]，研究證明：土壤中含有大量的溶磷微生物，包括細菌、真菌和放線菌等，可以將難溶性的磷轉(zhuǎn)變成植物可以吸收利用的磷，其中溶磷細菌的數(shù)量和種類遠多于溶磷真菌，但溶磷真菌的溶磷能力遠高于溶磷細菌，并且遺傳性狀更加穩(wěn)定[6～8]。已報道的溶磷真菌主要有青霉菌（Penicillium） 、曲霉菌（Aspergillus） 、根霉（Rhizopus） 、鐮刀菌（Fusarium） 、小菌核菌（Sclerotium）等[9]。磷化工生產(chǎn)的過程中會產(chǎn)生大量的難以利用的磷尾礦和磷礦石，為了對其加以綜合利用提高土壤肥力，減少環(huán)境污染，筆者在富磷礦區(qū)的土壤中，分離、篩選出高效的溶磷真菌，探究其溶磷特性，為加快土壤生態(tài)恢復及研制生物菌肥提供實驗依據(jù)。

2材料與方法

2.1材料

2.1.1篩選溶磷真菌MEM07的土壤

采自湖北省鐘祥富磷礦區(qū)。

2.1.2無機磷培養(yǎng)基

葡萄糖 10.0 g、（NH4）2SO4 0.5 g、酵母粉0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、FeSO4·7H2O 0.03 g、MgSO4·7H2O 0.3 g、MnSO4·4H2O 0.03 g、Ca3（PO4）2 5.0 g、去離子水1000 mL、pH值7.0～7.2。

2.1.3馬鈴薯液體培養(yǎng)基（PDA培養(yǎng)基）

馬鈴薯200 g切成小塊與1000 mL水混合煮沸30 min，過濾后取濾液加去離子水至1000 mL，加入葡萄糖20 g，瓊脂20 g，自然pH值。

2.1.4酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（YPD培養(yǎng)基）

酵母膏10 g，蛋白胨20 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，去離子水1000 mL。

2.2方法

2.2.1溶磷真菌MEM07的富集、篩選鑒定和純化

稱取10 g 土壤樣品放入裝有100 mL 無機磷液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，置于振蕩培養(yǎng)箱中28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)2 d。取富集培養(yǎng)后的土壤懸液0.2 mL，涂布于無機磷固體培養(yǎng)基上，每個處理重復3次，28 ℃倒置培養(yǎng)7 d，對出現(xiàn)溶磷圈的菌株進行純化，4 ℃保藏。

2.2.2溶磷真菌MEM07的搖瓶復篩

將初篩得到的真菌接種到PDA平板上，待菌落長滿后用直徑0.6 cm打孔器取一片菌塊接種到裝有200 mL 無機磷液體培養(yǎng)基的500 mL錐形瓶中，設(shè)置空白對照，每個處理重復3次，28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，采用鉬銻抗比色法測定上清液液中有效磷含量，連續(xù)測量7 d[10]。

2.2.3溶磷真菌MEM07的形態(tài)學和分子生物學鑒定

依據(jù)菌落形態(tài)特征，對菌株進行形態(tài)學鑒定[11]，同時提取真菌的總DNA為模板，以真菌ITS通用引物ITSl：5—TCCGTAGGTGAACCTGCGG—3；ITS4：5—TCCTCCGCTTATTGATATGC—3為上下游引物擴增ITS序列[12]。PCR擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測，送至武漢擎科生物科技公司進行序列分析，測序結(jié)果在NCBI上進行Blast對比分析，利用MEGA 6.0 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建。

2.2.4溶磷真菌MEM07對磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁及磷礦粉溶解能力的實驗

將待測真菌接種到PDA平板上，待菌落長滿后用直徑0.6 cm打孔器取菌塊，分別接種到裝有200mL難溶性磷酸鹽（磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁及鐘祥磷礦粉的濃度為5 g/L）的500 mL錐形瓶中，每個處理重復3次，同時設(shè)置空白對照，在28 ℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，采用鉬銻抗比色法測定上清液中有效磷含量，連續(xù)測量7 d。

2.2.5溶磷真菌MEM07溶磷條件優(yōu)化

以無機磷培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別對氮源、碳源、溫度和初始pH值進行優(yōu)化。碳源分別為為可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖、蔗糖、果糖和葡萄糖；氮源分別為牛肉膏、硝酸鎂、硝酸鉀、硝酸鈉、尿素、硫酸銨、氯化銨；初始pH值分別為4、5、6、7、8、9；培養(yǎng)溫度分別為25 ℃、28 ℃、31 ℃、34 ℃、37 ℃和40 ℃，參照2.2.4中的操作方法，培養(yǎng)5 d后測定可溶性磷含量。endprint

以單因素優(yōu)化結(jié)果為基礎(chǔ)，采用L9（34）正交試驗進一步優(yōu)化培養(yǎng)基組分（表1），按照2.2.4中的操作方法，培養(yǎng)5 d后測定可溶性磷含量。

馬衛(wèi)，等：一株高效溶磷真菌MEM07的篩選鑒定及其溶磷條件優(yōu)化

生物與化工

3結(jié)果與分析

3.1溶磷真菌MEM07的的富集、篩選鑒定和純化

真菌MEM 07菌落呈橢圓形，表面凸起，菌落周圍有明顯水解圈，初期菌絲為白色，后期著生大量黑色孢子，分布均勻（圖1）；將測序結(jié)果在NCBI上進行Blast 對比分析，并利用MEGA 6.0 進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建（圖2）。結(jié)合形態(tài)學特征、系統(tǒng)發(fā)育分析，將真菌MEM07鑒定為黑曲霉。

3.2溶磷菌株MEM07對磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁及磷礦粉溶解能力的實驗

將真菌MEM07，分別接種在4種難溶性磷源，即磷酸鈣、磷酸鎂、磷酸鋁及磷礦粉的培養(yǎng)液中，隨著時間的延長，培養(yǎng)液中的有效磷含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，且在第5 d時有效磷含量均達到最大，它們的溶磷量分別為1242.49 mg/L、1350.05 mg/L、712.03 mg/L、827.29 mg/L（圖3）。

3.3真菌MEM07溶磷條件優(yōu)化

由單因素試驗（圖4）和正交試驗（表2）結(jié)果表明，4個因素對菌株溶磷影響的主次順序為：pH>氮源>溫度>碳源。試驗得到的最優(yōu)溶磷條件組合為葡萄糖、尿素、pH值為7.0、溫度28 ℃，此時，溶磷量最高為1489.71 mg/L。

圖4（a）碳源、（b）氮源、（c）溫度、（d） pH值對菌株MEM07溶磷能力的影響

2017年10月綠色科技第20期

4結(jié)論

研究表明不同溶磷菌溶磷能力不同，本研究篩選得到的溶磷真菌MEM07在以磷酸鈣為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中，溶磷能力可達1242.49 mg/L，優(yōu)化后溶磷量高達1489.71 mg/L溶磷能力遠高于大多數(shù)真菌59.64～145.36 μg/mL的溶磷量[13]。菌株MEM07對不同難溶性磷酸鹽的溶解能力分別為磷酸鎂>磷酸鈣>磷礦粉>磷酸鋁，是由于微生物的溶磷能力與自身溶磷機理有關(guān)，如分泌有機酸、H2S作用、釋放質(zhì)子、CO2作用和產(chǎn)生磷酸酶[14]。本研究篩選得到的黑曲霉MEM07對不同難溶性磷酸鹽均有較強的溶解效果。條件優(yōu)化后溶磷量最高可達1489.71 mg/L，具有廣闊的應用前景。

參考文獻：

[1]

李林軒. 溶磷真菌對礦區(qū)復墾土壤磷形態(tài)、酶活性及油菜產(chǎn)量的影響[D].晉中：山西農(nóng)業(yè)大學，2014.

[2]胡山，牛世全，龍洋，等.河西走廊鹽堿土壤中一株高效溶磷菌的鑒定及條件優(yōu)化[J].微生物學通報，2017，44（2）：358～365.

[3]趙小蓉，林啟美.微生物解磷的研究進展[J].土壤肥料，2001，（3）：7～11.

[4]范延輝，王君，劉雪紅，等. 一株耐鹽解磷真菌的篩選、鑒定及其發(fā)酵優(yōu)化[J].土壤通報，2015，46（2）：362～367.

[5]馮宏，李永濤，張志紅，等. 類蘆根際溶磷真菌的篩選、鑒定及其溶磷能力分析[J].微生物通報，2010，37（5）：677～681.

[6]王雪，劉穎，辛雨，等. 無機解磷真菌A2的分離鑒定及解磷條件的響應面優(yōu)化[J].曲阜師范大學學報（自然科學版），2016（4）：73～78.

[7]吳鵬飛，張冬明，郝麗虹，等.解磷微生物研究現(xiàn)狀及展望[J].中國農(nóng)業(yè)科技導報，2008（3）：40～46.

[8]戴沈艷，申衛(wèi)收，賀云舉，等.一株高效解磷細菌的篩選及其在紅壤性水稻土中的施用效果[J].應用與環(huán)境生物學報，2011，17（5）：678～683.

[9]楊慧.溶磷高效菌株篩選鑒定及其溶磷作用研究[D].武漢：中國農(nóng)業(yè)科學院，2007.

[10]周暢，鄭超.不同環(huán)境因素對磚紅壤解磷菌解磷能力的影響[J].南方農(nóng)業(yè)，2014，8（9）：124～128.

[11]李學平，劉萍，李甲亮.一株耐鹽解磷真菌的篩選及生物學特性研究[J].環(huán)境污染與防治，2014，36（12）：50～53，58.

[12]魏景超. 真菌鑒定手冊[M] .上海：上?？茖W技術(shù)出版社，1979：501～512.

[13]潘力，崔翠，王斌.一種用于PCR擴增的絲狀真菌DNA快速提取方法[J].微生物學通報，2010（3）：450～453.

[14]林啟美，王華，趙小蓉，等.一些細菌和真菌的解磷能力及其機理初探[J].微生物學通報，2001（2）：26～30.endprint