霍晉華，張 霞，王 配*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201）

版納微型豬近交系FANK1基因CDS克隆、qPCR表達及功能生物信息學分析

霍晉華1，張 霞2，王 配2*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，武漢 430070；2.云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，昆明 650201）

【目的】獲得豬FANK1基因CDS序列、組織表達和蛋白質(zhì)功能信息?！痉椒ā恳訥enBank下載的豬及近緣物種的FANK1 mRNA序列為參考序列，設計特異引物從版納微型豬近交系（BMI）睪丸組織中擴增FANK1基因完全編碼序列及部分側翼序列。應用實時熒光定量PCR技術檢測BMI 15個重要組織的FANK1 mRNA轉錄表達水平，并對FANK1翻譯的蛋白質(zhì)序列進行多種功能生物信息學分析，預測FANK1蛋白質(zhì)的功能，最后構建FANK1多物種氨基酸系統(tǒng)進化樹?！窘Y果】獲得了BMI FANK1編碼區(qū)序列長1041 bp，編碼346個氨基酸，序列已提交GenBank，基因登錄號為KU705617和KU705618，對應的氨基酸登錄號為AOC89035和AOC89036?；蚪M結構分析表明FANK1基因定位于豬14號染色體，有11個外顯子和10個內(nèi)含子。多組織相對熒光定量表達分析表明FANK1基因在睪丸、尿道球腺和精囊腺中呈高表達水平；在其他組織中呈中低表達水平。功能生物信息學分析表明FANK1蛋白質(zhì)含有2種保守結構域FN3和ANK，無跨膜螺旋結構，無N端信號肽序列，二級結構以無規(guī)卷曲為主，N末端和C末端均親水，有4類功能活性位點。系統(tǒng)進化分析表明，F(xiàn)ANK1基因在進化中高度保守，且與牛、羊的親緣關系最近，符合物種的系統(tǒng)分類學?！窘Y論】成功克隆了版納微型豬近交系FANK1基因的CDS序列并進行了多種組織表達分析，為后續(xù)研究FANK1基因在小型豬精細胞分裂及調(diào)節(jié)信號通路方面的作用及功能奠定基礎。

纖連蛋白3（FN3）；錨蛋白重復（ANK）；版納微型豬近交系；組織表達；生物信息學

據(jù)報道非細胞凋亡蛋白FANK1基因在睪丸中特異性表達[1-3]，通過多物種比對，同源性較高，是高度保守的基因[4]。FANK1由FN3和ANK兩種保守結構域組成[5]。有研究證明，F(xiàn)ANK1是一種非細胞凋亡蛋白，它是通過激活AP-1（activator protein 1）信號通路來抑制細胞凋亡的[4，6]，而且FN3和ANK都有增強AP-1通路活性的作用[7]。Wang H.等通過酵母雙雜交的方法，發(fā)現(xiàn)FANK1與Jab1（Jun活化結構域結合蛋白1）可以相互作用[7]。研究發(fā)現(xiàn)，Jab1是AP-1信號通路的共同激活蛋白[8]。通過構建敲除FANK1基因的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)敲除FANK1基因的小鼠細胞凋亡數(shù)目高于正常小鼠[9]。通過RT-PCR和Western Blot證明，F(xiàn)ANK1基因在精細胞減數(shù)分裂過程中以及不同日齡的小鼠睪丸中的表達量不同[9]。

版納微型豬近交系（Bannamini-pig inbred line，BMI）是全球第一個培育成功的大型哺乳動物近交系，因其基因高度純合、遺傳背景清楚，生理學、疾病發(fā)生機理和解剖學等方面與人類極為相似，從而可為新藥臨床前安全性評價、豬基因組計劃中的功能基因研究、人類疾病動物模型制作和人類異種器官移植等眾多領域提供實驗材料和器官供體，具有重要的研究應用價值[10-13]。但是在正常繁育BMI的37年來，有多個亞系斷代，前期研究發(fā)現(xiàn)是部分公豬不育造成的，這些不育公豬已成為阻礙其群體進一步擴大的障礙，故版納微型豬近交系雄性不育方面的基礎研究是亟待開展的重要研究方向。鑒于FANK1基因在雄性哺乳動物精子生成和睪丸功能中的重要作用，本研究通過克隆版納微型豬近交系FANK1基因，確定其序列特征；通過mRNA的多組織表達譜確定其發(fā)揮功能的重要組織；通過對蛋白質(zhì)進行功能生物信息學分析預測其功能，為今后進一步深入研究FANK1基因在BMI公豬繁殖力方面的功能奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

屠宰BMI成年公豬，取睪丸和附睪（性腺），前列腺、精囊腺和尿道球腺（副性腺），5種雄性生殖重要相關組織；取心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟、胃臟、腦、肌肉、十二指腸（小腸）、結腸（大腸）等常規(guī)組織；共15種組織樣品。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取和第一鏈cDNA合成

參照說明書利用柱式RNA提取試劑盒（TaKaRa：9767）分別提取各組織總RNA，用核酸蛋白測定儀檢測所提RNA的濃度及純度，用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提RNA的完整性，合格樣品按反轉錄試劑盒（TaKaRa：6210A）操作說明書反轉錄為第一鏈cDNA保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計及合成

根據(jù) GenBank下載的牛（NM_001003904）、貓（XM_006938270）、羊（XM_012108577）、人（NM_145235）、馬（XM_001490071）等物種的 FANK1 mRNA序列，結合豬表達序列標簽EST序列（CV865262和CX063842），再參照GenBank下載的預測的豬FANK1 mRNA 序列（XM_001924803、XM_005671566、XM_005671567、XM_005671568），利用 Oligo 7 軟件設計F1/R1特異引物（F1：CGGCCTGGGAGCAGCTGAC，R1：AATGTCTGGCCTCAGGAATGC）來擴增 FANK1基因全長CDS序列及部分5'和3'側翼序列，設計F2/R2特異引物（F2:AACGACCCGAGAGCCCAT，R2:AACGACCCGAGAGCCCAT）擴增 97bp，并以 GAPDH基因為內(nèi)參（F：CCTTCATTGACCTCCACTACATGGT，R：CCACAACATACGTAGCACCAGCATC）擴增183bp，利用熒光定量法分析各組織的表達水平。

1.2.3 RT-PCR分離FANK1基因

PCR反應總體系25μL，以睪丸cDNA為模板，采用TaKaRa Ex TaqE體系，瓊脂糖凝膠電泳確定擴增的FANK1基因片段與引物設計時預期的片段大小吻合，膠回收后送公司測序。

1.2.4 FANK1基因多組織表達分析

以50 ng/μL起始濃度的睪丸cDNA為模板，5倍倍比連續(xù)稀釋獲得7個標準品，以F2/R2為引物，制作標準曲線。以各組織cDNA為模板，以GAPDH為內(nèi)參進行多組織qPCR表達水平檢測。

1.2.5 序列確定和數(shù)據(jù)分析

利用Lasergene軟件中的SeqMan程序進行組裝、拼接、并人工校對，確定FANK1基因編碼區(qū)序列并提交GenBank數(shù)據(jù)庫，同時推導出其編碼的氨基酸序列。計算15個組織的mRNA表達水平。最后進行FANK1蛋白質(zhì)的功能生物信息學分析，并構建多物種FANK1氨基酸序列系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 FANK1基因RT-PCR擴增結果

以BMI睪丸組織cDNA為模板，擴增的FANK1基因長度為1152 bp，見圖1。

2.2 FANK1基因序列及其編碼的氨基酸序列

利用F1/R1擴增產(chǎn)物測序，結果使用DNAStar軟件中的SeqMan程序進行組裝，獲得BMI FANK1全長編碼序列1041 bp，因為BMI FANK1基因的CDS第939位堿基C/T雜合，是第313個氨基酸的第三位，編碼的氨基酸不變，均為甘氨酸。獲得兩條mRNA GenBank登錄號，分別為：KU705617和KU705618，其對應的氨基酸登錄號分別為：AOC89035和AOC 89036。編碼346個AA，含有2種保守結構域FN3、ANK，見圖2。

2.3 FANK1基因組結構分析

為了獲得BMI FANK1基因座的基因組DNA，在ensembl數(shù)據(jù)庫中進行搜索，發(fā)現(xiàn)該基因位于豬14號染色體NC_010456.4的146827125-146928694位置，其全長101569 bp，包含11個外顯子和10個內(nèi)含子，見圖3。

圖1 FANK1基因反轉錄PCR擴增產(chǎn)物Figure 1 The RT-PCR product of FANK1 gene

2.4 多組織熒光定量表達分析

以GAPDH為內(nèi)參基因，實時熒光定量檢測FANK1基因15種組織的mRNA表達量，用2-ΔΔCt法分析各組織中的qPCR相對表達水平繪制出柱狀圖，結果表明FANK1基因mRNA在睪丸、尿道球腺、精囊腺、腦、脾中高表達（由高到低）；在結腸、十二指腸、前列腺、附睪中中度表達（由高到低）；在肺、腎、肝、心、胃中低表達（由高到低）；在肌肉中幾乎不表達，見圖4。

2.5 FNAK1蛋白質(zhì)一級結構信息

利用ProtParam tool程序獲悉BMI FANK1蛋白質(zhì)的一級結構和部分理化性質(zhì)，結果見表1。

2.6 FANK1蛋白質(zhì)二級結構

利用SOPMA程序預測的BMI FANK1蛋白質(zhì)二級結構為：33.53%的無規(guī)則卷曲（含116個氨基酸），30.64%的α-螺旋（含106個氨基酸），24.86%的延伸鏈結構（含86個氨基酸），10.98%的β-轉角（含38個氨基酸）。

2.7 FANK1蛋白質(zhì)功能域

利用SMART程序預測BMI FANK1蛋白質(zhì)功能域，發(fā)現(xiàn)其在9-94 AA、109-139 AA、143-172 AA、176-205 AA、209-238 AA、243-273 AA、334-343 AA是蛋白功能域，見圖5。

2.8 FANK1蛋白質(zhì)的疏水性

利用ProtScale程序預測BMI FANK1蛋白質(zhì)的疏水、親水性，結果表明其N末端和C末端均親水，且第147位置有最大疏水值2.000，第337位置有最小疏水值-3.022。

圖2 FANK1基因CDS核酸序列與對應的氨基酸序列Figure 2 The coding sequence and corresponding amino acids sequence of FANK1 gene

圖3 BMI FANK1基因組、mRNA和蛋白結構Figure 3 Genomic organization,mRNA and protein domain structure of BMI FANK1 gene

2.9 FANK1蛋白質(zhì)功能位點分析

利用Prosite程序預測BMI FANK1蛋白質(zhì)功能位點，發(fā)現(xiàn)共含有4類功能活性位點，包括cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶、蛋白酶C、酪蛋白激酶II等磷酸化位點以及N-十四?；稽c，見表2。

2.10 FANK1蛋白質(zhì)信號肽及跨膜結構分析

利用SignalP 4.1程序預測FANK1蛋白質(zhì)是否含有信號肽，顯示不包含N端信號肽序列。利用TMHMM 2.0程序預測FANK1蛋白質(zhì)的跨膜螺旋，顯示不存在跨膜螺旋，是非跨膜蛋白。

圖4 FANK1基因多組織相對表達水平Figure 4 The multi-tissues relative expression lever of FANK1 gene

表1 FANK1蛋白質(zhì)的基本信息Table 1 Primary information of FANK1 protein

圖5 FANK1蛋白質(zhì)功能域Figure 5 Protein function domain of FANK1 protein

表2 FANK1蛋白質(zhì)的功能活性位點Table 2 Functional active site of FANK1 protein

2.11 FANK1蛋白質(zhì)序列多物種系統(tǒng)進化分析

利用MEGA7.0軟件將BMI FANK1的蛋白質(zhì)序列與牛（XP_010818432）、貓（XP_006938332）、羊（XP_004020311）、人（NP_660278）、狗（XP_005637948）等5個物種的蛋白質(zhì)序列進行比對并計算相似度，相似度分別為：92.5%，92.2%，91.9%，91.6%，91.5%。并構建6個物種的分子系統(tǒng)進化樹，見圖6。

3 討論和結論

近年來對于FANK1基因的結構與功能的研究越來越深入，F(xiàn)ANK1基因具有DNA結合活性[9]，在雄性配子形成的過程中，可能作為轉錄因子控制分子信號通路[4，7]。到目前為止，F(xiàn)ANK1基因已在小鼠[9]以及人[4]等生物中被分離鑒定。本研究首先把從GenBank數(shù)據(jù)庫中獲取的人、牛、羊、狗、貓等物種的FANK1 mRNA序列進行比對，設計特異性保守引物，然后以BMI為實驗材料進行擴增，獲得了預期片段。通過對擴增產(chǎn)物測序并拼接，得到BMI FANK1基因的cDNA序列。

圖6 FANK1氨基酸序列進化樹Figure 6 The amino acids sequences phylogenetic tree of FANK1

以GAPDH為內(nèi)參對照校正的實時熒光定量多組織表達譜分析表明BMI FANK1基因在睪丸、尿道球腺、精囊腺中高表達，由此推斷該基因主要在豬的性腺和副性腺中發(fā)揮功能。據(jù)報道小鼠及人FANK1基因主要在睪丸和卵巢中高表達，在肝中幾乎不表達[14]，而我們研究發(fā)現(xiàn)FANK1基因在豬的睪丸和尿道球腺中高表達，在肝中也是低度表達，這可能由于前人未檢測尿道球腺樣品，也可能與物種差異有關，也可能與其他因素有關。

蛋白質(zhì)的結構與功能之間存在必然聯(lián)系[15]，功能生物信息學分析顯示BMI FANK1蛋白質(zhì)二級結構中無規(guī)則卷曲和α螺旋含量較高，分別為33.53%和30.64%，無規(guī)卷曲是構成酶重要活性部位和蛋白質(zhì)特異功能部位的二級結構元件，而α螺旋是蛋白質(zhì)二級結構中最常見、最典型、含量也較為豐富的二級結構元件[15]。FANK1蛋白含有FN3結構域和5個重復的ANK結構域[4]。FN3是纖連蛋白中發(fā)現(xiàn)的三種類型的內(nèi)部重復之一，廣泛存在于動植物組織中，在細胞內(nèi)外蛋白質(zhì)、跨膜細胞因子受體、生長激素受體、酪氨酸磷酸酶受體和黏附分子等中均含有該結構域，在細菌糖基水解酶也有發(fā)現(xiàn)[16-17]。ANK即錨蛋白，該結構域可介導蛋白質(zhì)之間的相互作用，ANK重復可以與其他類型的結構域組合發(fā)生作用[18-19]，該基因5個ANK結構域銜接，具有轉錄起始因子、細胞周期調(diào)控、細胞骨架、離子轉運蛋白、信號轉換器等功能[4-5]。BMI FANK1蛋白無N端信號肽序列，表明其屬于非分泌蛋白，可直接進入到細胞質(zhì)基質(zhì)中發(fā)揮其功能。FANK1蛋白無跨膜螺旋表明其屬于非跨膜蛋白?；瘜W修飾是蛋白質(zhì)翻譯后加工的重要內(nèi)容，蛋白質(zhì)磷酸化可以大大提高酶蛋白的活性，蛋白質(zhì)酰胺化可防止羧基端被羧肽酶降解，它們是蛋白質(zhì)化學修飾的兩種重要方式，發(fā)現(xiàn)FANK1蛋白存在cAMP和cGMP依賴性蛋白激酶磷酸化、蛋白酶C磷酸化、酪蛋白激酶II磷酸化3類磷酸化位點和1類酰胺化位點，為今后深入進行FANK1蛋白的功能研究奠定了基礎。

BMI豬、牛、貓、羊、人和狗等6個物種間FANK1蛋白質(zhì)序列兩兩間相似性均在91%以上，說明FANK1基因在進化中高度保守。6個物種FANK1蛋白質(zhì)序列構建的系統(tǒng)進化樹表明，牛和羊聚在一起，然后再與豬聚為一大類，牛和羊均屬于偶蹄目?？苿游?，豬為偶蹄目豬科動物，它們均為哺乳綱動物，豬、牛、羊是重要的家畜，是人類馴化較早的家養(yǎng)動物；貓和狗聚在一起，然后再與人聚為一大類，貓為食肉目貓科，狗為食肉目犬科，貓和狗也是人類馴化較早的家養(yǎng)動物，是人類的伴侶，符合物種的系統(tǒng)分類學。

綜上所述，該研究利用RT-PCR方法成功分離了BMI FANK1基因的全長編碼區(qū)序列，采用qPCR確定了其在BMI 15種組織中的表達情況，并進一步對其編碼的蛋白質(zhì)進行了功能生物信息學分析，研究結果將為深入研究FANK1基因在豬中的功能奠定基礎。

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CDS Cloning，qPCR Expression and Functional Bioinformatics Analysis of FANK1 Gene from Banna Mini-pig Inbred Line

HUO Jin-hua1，ZHANG Xia2,WANG Pei2*
（1.Faculty of Life Science and Technology，Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China；2.Faculty of Animal Science and Technology，Yunnan Agricultural University，Kunming 650201，China）

【Objective】In order to obtain the CDS sequence,tissue expression profile and protein function information of swine FANK1 gene.【Methods】 The FANK1 mRNA sequences of pig and related species from GenBank were used as reference sequences，we designed specific primers and amplified the coding sequences and flanking sequence of FANK1 gene from Bannamini-pig inbred line（BMI）testis tissues.Real-time quatitative PCR was applied to analyse the FANK1 gene expression profiles of 15 important tissues.FANK1 protein sequence was used to carry out functional bioinformatics analysis and construct multiple species phylogenetic tree.【Results】A coding sequence of 1041 bp of BMI FANK1 gene was obtained with GenBank accession number KU705617 and KU705618，which encoded a pro－tein of 346 amino acids，with GenBank accession number AOC89035 and AOC89036.Genomic structural analysis revealed that the FANK1 gene was located on porcine chromosome 14 and consisted of 11 exons and 10 introns.Real-time quantitative PCR in multi-tissues indicated that FANK1 gene expressed highly in the testis，urethral gland and seminal vesicle，middle or low expression in the other tissues.Further functional bioinformatics analysis indicated that FANK1 protein contained two conserved domains FN3 and ANK without transmembrane region and signal peptide sequences.Its secondary structure was predominantly random coils and its N-terminal and C-terminal were hydrophilic.FANK1 protein had four kinds functional active sites.Phylogenetic analysis demonstrated that BMI had the closest relationship with cattle and sheep，which was coincident with classical taxonomy.【Conclusion】We have successfully cloned the FANK1 gene of Bannamini-pig inbred line，and detected this gene expression in 15 pigs'tissues.The results of this article would lay a foundation for further study of the gene functions in the process of spermatocyte division and regulation of signal pathway.

fibronectin type Ⅲ（FN3）；ankyrin repeats（ANK）；bannamini-pig inbred line（BMI）；tissue expression；bioinformatics

Q78

A

1000-2650（2017）03-0408-06

10.16036/j.issn.1000-2650.2017.03.019

2017-02-24

國家自然科學基金項目（31660637；31460580；31660650）。

霍晉華，本科，主要從事生物技術研究，E-mail:jinhuahuo2016@163.com；*責任作者：王配，博士，實驗師，主要從事動物分子遺傳學研究，E-mail：peipei99999@126.com。

（本文審稿：朱 礪；責任編輯：秦碧雯；英文編輯：劉益平）