郝久程 賈 鑫 穆曉紅 張恒慶

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081)

大連地區(qū)島嶼與大陸玉竹種群遺傳多樣性的ISSR分析

郝久程 賈 鑫 穆曉紅 張恒慶*

(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116081)

選取大連地區(qū)大陸與海島共有植物玉竹為研究對象，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對來自5個海島和4個大陸種群的262個玉竹個體進(jìn)行遺傳多樣性的比較和分析。從10個篩選出的ISSR引物擴(kuò)增得到120個位點信息，其中多態(tài)性條帶百分率為91.67%，Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)為0.346 0，Shannon信息指數(shù)(I)為0.510 8。其遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.117 4，基因流(Nm)為3.758 5。研究結(jié)果表明玉竹天然種群的遺傳多樣性較為豐富，種群間基因交流較為頻繁，遺傳距離與地理距離具有一定的相關(guān)性。通過海島與大陸種群遺傳多樣性的比對發(fā)現(xiàn)，海島種群的遺傳多樣性略高于大陸種群，表明在孤立的生境和更為復(fù)雜的選擇壓力下，海島玉竹種群可能會積累更多的遺傳變異從而形成較高的遺傳多樣性水平。本文研究結(jié)果將為進(jìn)一步探討隔離生境中天然植物種群遺傳進(jìn)化規(guī)律提供證據(jù)。

ISSR-PCR；玉竹；遺傳多樣性；遺傳結(jié)構(gòu)

玉竹(Polygonatumodoratum)是百合科(Liliaceae)黃精屬(Polygonatum)多年生草本植物。野生玉竹生于涼爽、濕潤、無積水、土壤肥沃的林下或山野陰坡地，宜溫暖濕潤氣候，喜陰濕環(huán)境，較耐寒[1]。

大連位于遼寧省遼東半島南端，氣候適宜，植物資源豐富。玉竹在我國分布較廣，屬于歐亞大陸溫帶地區(qū)廣布種，在大連地區(qū)的分布范圍也比較廣泛，在采樣過程中發(fā)現(xiàn)北至莊河仙人洞國家級自然保護(hù)區(qū)南至旅順蛇島均有玉竹種群的分布。國內(nèi)外關(guān)于玉竹方面的研究很多，主要集中于易混種鑒定[2]、化學(xué)成分[3]、藥理作用[4]、栽培技術(shù)及應(yīng)用開發(fā)等方面。

簡單重復(fù)序列間擴(kuò)增即ISSR(inter-simple sequence repeat)是自加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等[5]于1994年創(chuàng)建的，它是一種建立在PCR反應(yīng)基礎(chǔ)上的新型的分子標(biāo)記，具有操作簡單、多態(tài)性豐富、試驗重復(fù)性好的特點。國外關(guān)于玉竹遺傳多樣性方面的研究還未見報道。國內(nèi)有對玉竹遺傳多樣性方面的研究，但全部集中于大陸間的不同省份之間或不同栽培品種間的玉竹遺傳多樣性比較，路放[6]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對吉林地區(qū)8個品系的栽培玉竹品種進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)不同品系玉竹種間存在較高的多態(tài)性，遺傳多樣性較為豐富；卜靜等[7]通過對我國5個省份共11個種群的野生玉竹和1個種群的栽培玉竹進(jìn)行了ISSR分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地野生玉竹種間遺傳多樣性較為豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力強(qiáng)，野生玉竹的遺傳多樣性高于栽培居群的遺傳多樣性。對于玉竹在海島隔離生境的遺傳多樣性研究還沒有報道，也沒有相關(guān)學(xué)者對遼寧省地區(qū)內(nèi)野生玉竹遺傳多樣性進(jìn)行研究。雖然我國玉竹分布廣泛，但是隨著人們不斷的采挖野生玉竹根莖進(jìn)行栽培，野生玉竹的資源也在減少，遺傳多樣性會逐漸喪失。

本實驗采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對遼寧省大連市的6個縣市(區(qū))共9個玉竹天然種群(其中5個為海島種群，4個為大陸種群)的遺傳多樣性進(jìn)行了比較和分析，獲取9個種群的遺傳學(xué)數(shù)據(jù)，在物種水平和種群水平上揭示玉竹種群遺傳多樣性的高低，揭示玉竹種群的遺傳結(jié)構(gòu)并探討其形成的原因。同時，比較研究海島和大陸玉竹種群的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳多樣性水平、遺傳分化的特點，其結(jié)果將為探討隔離生境中天然植物種群遺傳進(jìn)化規(guī)律提供證據(jù)。

1 實驗材料

實驗材料于2016年5～6月分別采自于大連地區(qū)9個不同的地點，分單株采集，樣品間距離不少于20 m，采樣時記錄周邊環(huán)境，折斷莖部整株采集，采集后帶回實驗室進(jìn)行二次鑒定，確保采集樣品的準(zhǔn)確性，然后將材料的嫩葉采集后用封口帶單株封裝，保存于實驗室-20℃冰柜中備用，詳細(xì)的采集信息見表1。

表1玉竹樣品數(shù)量及采集地

Table1ThesamplesizeandlocationofP.odoratumpopulation

種群編號Code樣品數(shù)No．ofsamples緯度Latitude(N)經(jīng)度Longitude(E)地理位置LocationSD3038°57．083′120°58．937′旅順，蛇島(海島)Lvshun，Snakeisland(Island)XS2638°55．513′121°29．283′甘井子，西山(大陸)Ganjingzi，Westmount(Land)XRD3439°59．020′122°57．450′莊河，仙人洞(大陸)Zhuanghe，Xianrendong(Land)GLD2939°38．752′123°02．032′莊河，蛤蜊島(海島)Zhuanghe，Clamsisland(Island)WJD2839°26．753′123°05．243′莊河，王家島(海島)Zhuanghe，Wangjiaisland(Island)SCD3039°31．175′122°59．561′莊河，石城島(海島)Zhuanghe，Shichengisland(Island)XHS2539°18．276′121°54．449′金州，小黑山(大陸)Jinzhou，Xiaoheishan(Land)XPD2938°50．640′121°28．920′高新區(qū)，小平島(大陸)High?techzone，Xiaopingisland(Island)DCS3139°15．051′122°34．925′長海，大長山島(海島)Changhai，Dachangshanisland(Island)

2 實驗方法

2.1 DNA的提取

玉竹DNA的提取采取張恒慶等[8]改良的CTAB法。粗提DNA樣品進(jìn)一步純化處理后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，用美國冷泉港P41G型凝膠成像系統(tǒng)照相。采用Gel Pro1.1軟件對比樣品條帶與DL15000分子量標(biāo)準(zhǔn)的含量，確定DNA的含量和分子量，用雙蒸水稀釋成統(tǒng)一濃度后作為PCR反應(yīng)的模板。

2.2 引物的篩選

ISSR引物為上海生工生物工程公司合成，稀釋成10 μmol·L-1備用。在合成的27個引物中進(jìn)行了篩選，選取擴(kuò)增條帶穩(wěn)定、清晰、數(shù)量適中的10個引物作為本研究的引物，對全部樣品進(jìn)行擴(kuò)增。具體引物名稱及退火溫度見表2。

表2引物名稱、擴(kuò)增位點數(shù)及最佳退火溫度

Table2NumberofpolymorphiclociandoptimalannealingtemperatureofISSRprimer

引物Primer序列Sequence擴(kuò)增位點數(shù)Locus退火溫度Annealingtemperature(℃)UBC817(CA)8A1152．0UBC818(CA)8G1451．3UBC841(GA)8YC1252．5UBC843(CT)8RA1150．3UBC844(CT)8RC1252．0UBC845(CT)8RG948．5UBC853(TC)8RT1152．5UBC855(AC)8YT1353．0UBC856(AC)8YA1253．0UBC857(AC)8YG1550．8

2.3 ISSR反應(yīng)體系及PCR擴(kuò)增

本實驗參考陳玉秀等[9]的優(yōu)化結(jié)果，并通過各組成成分的梯度實驗，最終確定反應(yīng)體系如下：總體積25 μL，包括10 ng模板DNA，0.4 μmol·L-1ISSR引物，10×PCR buffer 2.5 μL，0.2 mmol·L-1dNTP混合物，2.0 mmol·L-1MgCl2,1.0 UTaqDNA聚合酶，最后加ddH2O補(bǔ)齊至25 μL。

使用英國TECHNE TC-512型PCR循環(huán)儀進(jìn)行PCR擴(kuò)增，玉竹的ISSR-PCR反應(yīng)程序為:94℃ 5 min進(jìn)行預(yù)變性，35個循環(huán)，條件為94℃變性45 s，48.5～53.0℃退火45 s(退火溫度因引物不同)，72℃延伸90 s，最后在72℃保持7 min使擴(kuò)增的片段充分延伸。

2.4 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測及數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

PCR反應(yīng)結(jié)束后，采用水平板瓊脂糖凝膠電泳來檢測擴(kuò)增結(jié)果。具體操作為：1×TBE電泳緩沖液，凝膠濃度為1.2%，以DL2000作為分子量標(biāo)準(zhǔn)，80 V穩(wěn)壓電泳2.5 h。電泳結(jié)束后用凝膠成像系統(tǒng)照相，記錄電泳結(jié)果。

根據(jù)電泳結(jié)果，選取多個位點記錄不同物種的同一位點上的條帶分布情況。記錄時只記錄那些電泳條帶清晰，并能在重復(fù)實驗中穩(wěn)定出現(xiàn)的位點，有帶的記為“1”，無帶的記為“0”，不確定的記為“.”，最后形成數(shù)據(jù)庫，經(jīng)POPGENE1.32軟件[10]進(jìn)行遺傳多樣性分析，得出多態(tài)性條帶百分率(PPB)、Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)、Shannon信息指數(shù)(I)、群體總基因多樣性(Ht)、群體內(nèi)基因多樣性(Hs)、遺傳分化系數(shù)(Gst)和基因流(Nm)等，同時利用軟件對玉竹種群進(jìn)行聚類分析。

3 實驗結(jié)果

3.1 玉竹ISSR-PCR擴(kuò)增結(jié)果及遺傳多樣性分析

本實驗用篩選出的10個引物對大連地區(qū)的9個玉竹天然種群共262個個體進(jìn)行了PCR擴(kuò)增，選出的10個引物共檢測到120個位點，每個引物檢測到的位點數(shù)介于9～15個，擴(kuò)增的DNA片段長度在150～2 000 bp，平均每個引物檢測到12個位點。在檢測到的120個位點中多態(tài)位點為110個，其種內(nèi)多態(tài)位點比率為91.67%，9個種群內(nèi)多態(tài)位點比率在69.17%～87.50%，其中多態(tài)位點比率最高的是SCD(石城島)種群，最低的是XHS(小黑山)種群(表3)，引物UBC845的部分?jǐn)U增結(jié)果見圖1。

表3在種群和物種水平上玉竹遺傳多樣性ISSR分析結(jié)果

Table3GeneticdiversityinP.odoratumdeterminedbyISSRmarkersatpopulationandspecieslevel

種群名稱Population擴(kuò)增位點數(shù)Locus多態(tài)位點比率PercentageofpolymorphismlociNei’s指數(shù)Nei’sgenediversity(h)Shannon指數(shù)Shannon’sinformationindex(I)WJD9680．000．3163(0．1853)0．4625(0．2583)XHS8369．170．2524(0．1987)0．3746(0．2809)XS8974．170．2771(0．1972)0．4085(0．2765)SCD10587．500．3308(0．1673)0．4880(0．2270)SD9579．170．3011(0．1814)0．4448(0．2546)XPD10184．170．3215(0．1748)0．4737(0．2402)GLD9982．500．3103(0．1767)0．4585(0．2463)DCS9780．830．3120(0．1816)0．4589(0．2525)XRD10184．170．3206(0．1754)0．4718(0．2427)Specieslevel11091．670．3460(0．1532)0．5108(0．2039)

圖1 部分玉竹種群ISSR電泳圖譜 M. DL2000Fig.1 ISSR electrophorogram of P.odoratum populations M. DL2000

3.2 玉竹種群間的遺傳分化

根據(jù)POPGENE1.32軟件計算，9個玉竹種群的遺傳分化計算結(jié)果為玉竹種群的Ht為0.345 2，Hs為0.304 7，遺傳分化系數(shù)Gst=0.117 4，說明有11.74%的遺傳變異發(fā)生在種群間，玉竹的遺傳變異主要發(fā)生在種群內(nèi)，占總的遺傳變異的88.26%?；蛄?Nm)較大為3.758 5，說明種群間基因交流比較頻繁。

3.3 玉竹的種群遺傳距離和聚類分析

遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)是衡量玉竹種群間的遺傳差異和遺傳相似性的重要指標(biāo)，本研究運用POPGENE1.32軟件進(jìn)行計算，得到9個玉竹種群間的遺傳距離(D)和遺傳一致度(I)，如表4所示，我們可以看到，GLD與XRD的遺傳一致度最高，為0.978 2；XHS與SD的遺傳一致度最低，為0.887 0。

根據(jù)所得到的Nei’s遺傳距離(D)的數(shù)據(jù)，利用POPGENE1.32軟件，采用非加權(quán)組平均法(unweighted pair-group method with arithmetic means,UPGMA)，對9個玉竹種群的進(jìn)行聚類分析，從而得到種群間的遺傳關(guān)系聚類圖(圖2)。從圖2中可以看出，9個玉竹種群被分為4個主要集群，其中SD和XHS種群為獨立的兩個集群，XS和XPD聚為一個集群，其他種群構(gòu)成一個集群。

圖2 玉竹種群的UPGMA聚類圖Fig.2 Dendrogram obtained by UPGMA cluster analysis based on Nei’s genetic distance(D) among P.odoratum populations

表4玉竹種群的遺傳距離(斜線下)與遺傳一致度(斜線上)

Table4Geneticdistance(undertheobliqueline)andgeneticidentity(ontheobliqueline)amongP.odoratumpopulations

WJDXHSXSSCDSDXPDGLDDCSXRDWJD????0．91340．93290．97310．91410．94980．95880．95330．9549XHS0．0906????0．93170．91680．88700．93270．91910．92470．9327XS0．06950．0707????0．93990．88760．96950．94560．95560．9474SCD0．02720．08690．0620????0．93770．95870．97030．95410．9662SD0．08980．11990．11920．0643????0．93030．92460．91680．9343XPD0．05150．06970．03100．04210．0723????0．96680．96390．9718GLD0．04210．08440．05590．03020．07840．0337????0．97020．9782DCS0．04780．07820．04540．04700．08690．03680．0303????0．9664XRD0．04620．06960．05400．03430．06790．02860．02200．0342????

4 討論

4.1 玉竹種群遺傳多樣性水平

遺傳變異的程度直接表達(dá)了遺傳多樣性水平的高低，高水平的遺傳多樣性是維持物種長期生存和進(jìn)化的基礎(chǔ)條件。遺傳多樣性越高或遺傳變異越豐富，植物適應(yīng)生存環(huán)境變化的能力就越強(qiáng)，而遺傳多樣性的降低將會導(dǎo)致植物的適應(yīng)能力下降，甚至?xí)袦缃^的風(fēng)險。本研究利用ISSR分子標(biāo)記揭示了大連地區(qū)9個野生玉竹種群的在物種水平上的多態(tài)性條帶比率(PPB)為91.67%，Nei’s基因多樣性指數(shù)(h)為0.346 0，Shannon信息指數(shù)(I)為0.510 8。說明了玉竹種群的遺傳多樣性較為豐富，這與卜靜等[6]通過對我國5個省份共11個種群的野生玉竹和1個種群的栽培玉竹進(jìn)行ISSR分析(PPB=94.13%，h=0.432 1，I=0.619 7)所得到的結(jié)論基本一致。

本研究得到的玉竹遺傳多樣性較高的原因可能與玉竹自身的繁育系統(tǒng)有關(guān)，植物的繁育系統(tǒng)是決定植物遺傳多樣性的最主要的因素[11]。玉竹的繁殖方式為有性繁殖和無性繁殖兩種方式并存。有性繁殖的遺傳信息來源于親本雙方，這樣更有利于基因的重組和突變，從而加大遺傳變異幾率，人們也普遍接受這一觀點，但近年來研究[12]表明無性繁殖的種群也可以保持較高水平的遺傳多樣性。因而玉竹的兩種繁殖方式使得其遺傳多樣性水平較高。通過結(jié)果我們也可以看到XHS種群的多態(tài)性條帶比率(PPB)最低，為69.17%。這可能與強(qiáng)烈的人為干擾有關(guān)，XHS種群采集地位于森林公園的人行道旁，經(jīng)常會有人在其種群分布范圍內(nèi)活動，強(qiáng)烈的人為干擾可能會導(dǎo)致其遺傳多樣性下降。人為干擾等外部因素通過某種間接方式(如影響植物的交配系統(tǒng)、瓶頸效應(yīng)等)使等位基因數(shù)目或頻率發(fā)生改變，最終使植物群體的遺傳多樣性水平和遺傳結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[13]。

4.2 玉竹種群的遺傳結(jié)構(gòu)

本研究得到玉竹種群總體的遺傳分化系數(shù)為0.117 4，基因流為3.758 5。表明了玉竹種群間基因交流較為頻繁，種群間的分化程度較低?；蛄髦饕ㄟ^花粉擴(kuò)散和種子傳播兩種形式來實現(xiàn)，玉竹種群之所以基因流較大，這可能與玉竹種群在大連地區(qū)分布較廣以及大陸種群及個別海島種群間地理距離較近有關(guān)，XS與XPD種群地理距離較近，XRD和GLD之間，GLD與SCD、WJD之間的地理距離也較近，各島嶼間的人員流動增大了基因交流的可能性，島嶼一般在玉竹的開花期風(fēng)比較大，加速了花粉的傳播，間接的促進(jìn)了基因的交流，島嶼的片段化生境并沒有完全阻止基因流。同時玉竹又是歐亞地區(qū)廣布種，在大連地區(qū)分布也較廣，也是導(dǎo)致玉竹具有較大基因流的原因。

通過對遺傳距離和UPGMA聚類分析的對比可以發(fā)現(xiàn)，XRD和GLD的遺傳距離為0.022 0，說明二者的親緣關(guān)系最近，而這兩個種群的地理距離較近，可以進(jìn)行基因交流，GLD雖然是一個島嶼，但其離岸距離很近，且有一條大壩與大陸相連，海水的隔離并不會對基因交流產(chǎn)生影響。SD與XHS的遺傳距離最大，為0.119 9，說明了二者的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，有較大的遺傳背景差異，SD種群位于渤海海域，其它島嶼種群均來自黃海海域，較遠(yuǎn)的地理距離以及海水的阻隔阻止了與其他種群的基因交流，從而導(dǎo)致SD與其他種群的遺傳差異較大。

UPGMA聚類圖可以直接反映出各種群的親緣關(guān)系，聚類結(jié)果與地理分布上具有一定的相關(guān)性，DCS種群與XRD、GLD的地理距離較遠(yuǎn)，但也聚為一類，表明地理距離在玉竹天然種群的遺傳分化中可能并非唯一的主導(dǎo)因素，可能還受到周邊生境及人為干擾等影響，具體原因還有待于更多島嶼種群并結(jié)合玉竹的生殖生物學(xué)與生態(tài)學(xué)方面的研究作出科學(xué)的評價。

4.3 玉竹海島種群與大陸種群遺傳多樣性的比較

一般來說，一個物種的海島種群遺傳多樣性由于奠基者效應(yīng)或自然選擇等原因會低于大陸種群的遺傳多樣性[14]。分析本研究所得結(jié)果，發(fā)現(xiàn)在玉竹的9個種群中，從總體上看海島種群的遺傳多樣性略高于大陸種群。李麗等[15]利用SSR標(biāo)記技術(shù)對來自海南、廣東、廣西的19個美麗雞血藤野生種群的遺傳多樣性進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)海南種質(zhì)較內(nèi)陸種質(zhì)擁有更高的遺傳變異，推測可能由于美麗雞血藤在島嶼生存面臨較之大陸更為復(fù)雜的環(huán)境，而進(jìn)化了較高的遺傳多樣性。分析玉竹形成海島種群的遺傳多樣性略高于大陸種群的原因，一方面可能與種群規(guī)模和人為干擾有關(guān)，大陸種群中XRD種群采集地建有國家級自然保護(hù)區(qū)，XPD種群位于密林深處，很少受到人為干擾，玉竹的棲息地也保存的較好，使得這兩個種群的遺傳多樣性相對較高；XHS種群受到人為干擾程度較大，在野外調(diào)查時還發(fā)現(xiàn)有人直接采挖玉竹根莖，對種群的破壞較大；XS種群規(guī)模較小。而海島種群雖然會受到地理隔離和生境片段化的影響，但是其種群規(guī)模較大，同時海島種群受到的人為干擾程度適中。導(dǎo)致大陸種群的遺傳多樣性差異較大且略低于海島種群。另一方面，海島種群也面臨著海島上更為復(fù)雜多樣的氣候及生存環(huán)境，多變的環(huán)境和孤立的生境使玉竹面臨更為復(fù)雜的選擇壓力，可能會影響玉竹進(jìn)化，導(dǎo)致海島玉竹種群可能會積累更多的遺傳變異從而形成較高的遺傳多樣性水平，用以適應(yīng)復(fù)雜的生態(tài)環(huán)境。

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introduction：HAO Jiu-Cheng(1992—),male,Master,mainly engaged in population genetics.

date:2017-03-04

GeneticDiversitybetweenIslandandMainlandNaturalPopulationsofPolygonatumodoratuminDalianAreabyISSR

HAO Jiu-Cheng JIA Xin MU Xiao-Hong ZHANG Heng-Qing*

(College of Life Sciences,Liaoning Normal University,Dalian 116081)

WithPolygonatumodoratum, a plant on both the mainland and islands in Dalian, we studied the genetic diversity of 262P.odoratumfrom 5 islands and 4 mainland populations by ISSR molecular marker technology. Information of 120 loci was obtained by amplification of 10 ISSR primers that were screened out, where the percentage of polymorphic bands was 91.67%, the gene diversity index of Nei’s was 0.346 0, and Shannon information index was 0.510 8. Its genetic differentiation coefficient was 0.117 4, and its gene flow was 3.758 5. The genetic diversity of natural populations ofP.odoratumwas relatively rich with relatively frequent gene exchange among different populations, and its genetic distance had certain correlation with its geographic distance. By comparison between genetic diversity of populations from the mainland and islands, the genetic diversity of populations from islands was slightly higher than that from the mainland, indicating that under a more isolated ecological environment and more complicated selection pressure, populations ofP.odoratumon islands might accumulate more genetic variation to form high levels of genetic diversity. Our results would provide evidence for further discussion on laws of genetic evolution of populations of natural plants in isolated ecological environments.

ISS-PCR;Polygonatumodoratum;genetic diversity;genetic structure

郝久程(1992—)，男，碩士研究生，主要從事種群遺傳學(xué)方面的研究。

* 通信作者：E-mail：hengqingzhang@163.com

2017-03-04

* Corresponding author：E-mail：hengqingzhang@163.com

Q949.71+8.23

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.05.010