鄒滿鈺 陸永良 印麗萍 郭水良*

(1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234； 2.中國水稻研究所，杭州 311400； 3.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200234)

中國境內(nèi)稗(Echinochloacrus-galli)形態(tài)變異及其遺傳和地理背景分析

鄒滿鈺1陸永良2印麗萍3郭水良1*

(1.上海師范大學生命與環(huán)境科學學院，上海 200234； 2.中國水稻研究所，杭州 311400； 3.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200234)

采集了浙江、福建、江蘇、湖南、湖北、四川、重慶、黑龍江、河南9個省的稗(Echinochloacrus-galli(L.)P.Beauv.)及其變種的33份種子，分別播種在相同的環(huán)境下，獲得33個種群，測定了種群的16個形態(tài)性狀，篩選出重復性好的9條ISSR引物，從33個種群中擴增出了109個位點?；谶@些形態(tài)性狀和ISSR位點信息，對33個種群先進行主成分分析，在此基礎(chǔ)上再進行模糊均值聚類分析，探討了它們的形態(tài)和遺傳變化特點，及其與形態(tài)—遺傳—地理背景三者之間的關(guān)系。主要結(jié)論如下：(1)33個種群可以鑒別出形態(tài)性狀相對一致的4組，能夠識別出西來稗(E.crus-gallivar.zelayensis(Kunth) Farw.)、無芒稗(E.crus-gallivar.mitis(Pursh) Peterm.)、細葉旱稗(E.crus-gallivar.praticolaOhwi);(2)基于109個位點信息對33個種群進行聚類分析得到了6組，部分組與形態(tài)聚類分組有一定的對應性；(3)33個稗草種群的遺傳分化受地理背景因素的影響(r=0.684,n=33,P<0.001)；形態(tài)變異也有較明顯的遺傳背景因素(r=0.425,n=33,P<0.02)。在相對一致的稻田生境中，可能存在著形態(tài)上的趨同適應，使遺傳上分化的組間在形態(tài)上又往往有交叉過渡，致使稗原變種(E.crus-gallivar.crus-galli)、西來稗、無芒稗、短芒稗(E.crus-gallivar.breviseta(D?ll) Podp.)在形態(tài)上難以區(qū)別;(4)基于遺傳和形態(tài)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)細葉旱稗無論在形態(tài)上，還是遺傳上，均形成了明顯的一組，推測與該種長期適應于干旱生境有關(guān)，建議將細葉旱稗提升為種的水平，并將其命名為Echinochloapraticola(Ohwi) Guo S L,Lu Y L,Yin L P & Zou M Y。

稗；形態(tài)性狀；ISSR；地理背景；變異；模糊均值聚類分析

稗(Echinochloacrus-galli(L.)P.Beauv.)為一年生禾本科(Gramineae)植物，分布于世界熱帶至溫帶區(qū)域[1]，是一種世界性惡性雜草，也是我國稻田中分布最廣、危害最重的主要稻田雜草之一[2～3]。由于其超強的繁殖能力、種子的休眠特性以及其與作物的高度相似性，稗在田間非常難以防除。不同來源的稗對除草劑敏感性不同，不合理除草劑的使用，導致稗抗藥性逐漸增強，加大防除難度，所以確定稗的形態(tài)與遺傳變異特點，利于農(nóng)田稗的防除工作[4]。

目前，稗屬植物的鑒定和分類檢索主要是以形態(tài)性狀為主。但是，不同生境中的稗屬植物形態(tài)變異強烈。Gupta等研究了不同地理來源的194份湖南稗子(E.frumentacea(Roxb.) Link)發(fā)現(xiàn)，不同地理來源的種群在形態(tài)上存在著顯著差異[5]。稗屬植物在形態(tài)和生理甚至基因水平上的變異都非常顯著，喬麗雅等研究表明同一種的稗屬植物在花序和小穗的上的變異比較穩(wěn)定，是鑒定稗屬植物最主要的形態(tài)學特征[6]。但是，Ruiz-Santaella等的研究發(fā)現(xiàn)，作為區(qū)分稗屬植物重要的特征之一的小穗芒的長度也會隨著環(huán)境的不同而發(fā)生改變[7]。由于耕作方式的改變、除草劑的使用以及氣候的變化等原因，引起稗屬植物在形態(tài)方面甚至在基因水平上都發(fā)生了豐富的變化，這為稗屬植物的鑒定，分類以及后續(xù)的研究都帶來了非常大的困難[8～9]。

稗是稗屬中形態(tài)變異特別強烈的種類，種下有無芒稗(E.crus-gallivar.mitis(Pursh) Peter.)、西來稗(E.crus-gallivar.zelayensis(Kunth) Hitch.)、小旱稗(E.crus-gallivar.austrojaponensisOhwi)、短芒稗(E.crus-gallivar.brevisetaD?ll) Podp.)、細葉旱稗(E.crus-gallivar.praticolaOhwi)等變種。但是，根據(jù)最新的中國植物志英文版的記載，稗的種下類群在芒的長短、總狀花序的分枝程度、小穗長度、葉片寬度等性狀上存在過渡。因此，應用經(jīng)典分類學方法來鑒定形態(tài)差異極不一致的稗比較困難。Altop和Mennan也發(fā)現(xiàn)不同地理來源的稗在種子萌發(fā)率、開花時間、葉面積、植株高度、小穗長度、地上部分生物量、根干重、種子數(shù)量以及基因型均存在變異，推測可能與耕作方式、農(nóng)作物及除草劑使用有關(guān)[10]。目前對于田間常見的稗及其種下類群的研究主要集中在生物學特性，生理特性以及對除草劑的敏感性等方面，相關(guān)的分類研究較少，所以關(guān)于稗及其變種的分類標準難以確立一致，我國不同地理稻區(qū)的稗與其變種之間在形態(tài)和遺傳上的變異及其相關(guān)性，人們并不清楚。

本文通過系統(tǒng)地采集我國9個省區(qū)稻田的稗及其變種的材料，為消除不同生長環(huán)境對稗及其變種表型性狀的影響，將采集到的種群播種于相同的條件下，獲得他們的子代種群，通過對子代種群形態(tài)數(shù)據(jù)的采集以及遺傳數(shù)據(jù)的測定，借助于聚類分析、主成分分析方法，研究并明確我國不同地理來源的稻田稗及其變種的形態(tài)和遺傳的相互之間關(guān)系，為進一步正確地對稻田稗及其近緣種的分類鑒定提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

在2011年4～10月，從我國9省(區(qū))稻田中收集了33份不同地來源的稗及其變種的成熟種子，采集點的位置信息見表1。采集時每棵稗選取基本成熟的果穗，單采單袋單編。每份種子帶回后曬干，脫粒，去雜，放置在室內(nèi)干燥處常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

于2012年6月4日，將33份種子用常溫自來水浸種48 h，再放入培養(yǎng)箱35℃催芽48 h，部分不發(fā)芽種群增加24 h催芽。催芽后的種子，按地區(qū)編號順序撒播，每個種群種植小區(qū)面積寬1 m，長1.2 m，待稗草長至一葉一心時候，間苗定苗，確保每小區(qū)20株，分4行，行距為28 cm，每行5株，株距為24 cm，每小區(qū)間隔30 cm，大區(qū)與大區(qū)之間留60 cm操作溝。

1.2 對33個稗草種群形態(tài)特征的觀測及其賦值

根據(jù)中國植物志英文版[1]及戴水連[11]等關(guān)于稗屬植物的形態(tài)分類方法，測定了如表2所示的16個性狀，其中前9個為定量性狀，單位均為cm，從每個子代種群選擇5個樣本進行性狀測定；后7個為二態(tài)或多態(tài)性狀。

1.3 ISSR實驗

引物篩選和ISSR實驗方法參考陸永良等[12]。

表1 33個稗草樣本的地理信息

表2 稗草16個形態(tài)性狀的賦值

1.4 形態(tài)數(shù)據(jù)處理和分析

首先對形態(tài)性狀的數(shù)量數(shù)據(jù)進行最大值標準化處理，以16個形狀數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)對33個種群進行主成分分析，將它們在前6個主成分上的得分值作為指標進行模糊均值聚類，并在二維排序圖上展示分類結(jié)果，應用SPSS 16.0統(tǒng)計獲得各組效果的方差和差異顯著性檢驗值，從而選擇較優(yōu)的分組，探討各組的形態(tài)特點以及傳統(tǒng)的有關(guān)稗及種內(nèi)劃分的合理性。

1.5 遺傳數(shù)據(jù)處理和分析

電泳圖中，具有相同遷移距離的位點上，有條帶的標記1，沒有標記0。只統(tǒng)計清晰可辨、可重復的以及分子量在500 bp以上的條帶。根據(jù)9條引物的擴增結(jié)果，基于109個遺傳位點信息，應用R語言對33個樣本進行主成分分析，得到前6個主成分上的得分值，依此再進行模糊均值聚類分析，構(gòu)建33個子代種群親緣關(guān)系模糊均值聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)性狀的變異特點分析

33個樣本的稗草子代種群的形態(tài)性狀數(shù)據(jù)見表3。在數(shù)量性狀中，變異系數(shù)最大的是芒長，達274.25%，其次是主莖直徑(40.24%)、株高(37.16%)、葉長(33.19%)，而葉寬、圓錐花序長度、總狀花序長度、第1穎長/小穗長比的變異幅度相近，在23%～27%長穗狀的性狀穩(wěn)定，變異系數(shù)在16.65%。

2.2 基于形態(tài)數(shù)據(jù)分類

以16個形狀數(shù)據(jù)對33個種群進行主成分分析，基于33個樣本在前6個主成分上的得分值進行模糊均值聚類分析，發(fā)現(xiàn)分成四組時平均的輪廓圖值最大，因此將33個種群分成4組，再統(tǒng)計各組之間性狀差異，得到表4。

表3 33個子代種群的形態(tài)數(shù)據(jù)

表4 分類方法效果的統(tǒng)計檢驗

圖1 基于前6個主成分得分值的33個稗草種群的模糊均值聚類分析 A.形態(tài)；B.ISSRFig.1 Fuzzy C-means cluster analysis of thirty-three E.crus-galli samples on scores of the first six principal components A.Morphological data; B.ISSR

從表4可以看出，除了穗軸狀態(tài)和小穗長這2個性狀外，其余的14個性狀在四組之間存在顯著差異(多數(shù)達到了0.001水平)。通過各樣本對組的成員值，能夠了解該樣本分類的合理性(圖2)。

圖2 基于16個形態(tài)特征上33個樣本對各組的成員值Fig.2 Member values of four groups of thirty-three E.crus-galli samples based on their sixteen morphological traits

33個稗草種群分組如下：

第一組由第1、2、4、19、20、21、22、23號種群組成，特點是總狀花序硬，下稃無芒，株高在60～100 cm，小穗淺綠色，總狀花序不分枝，貼軸，穗軸直立。根據(jù)圖2中各種群隸屬于第一組的成員值大小，第22、23號種群代表著本組典型的形態(tài)特點。參照Chen等[13]有關(guān)稗及變種的分類標準，本組中的19、20、21、22、23與西來稗接近。

第二組包括第3、8、14、15、16、17、30、31、32、33號種群；這一組的成員值反映出分組的合理性相對較差，代表的形態(tài)上的中間過渡類型。例如，3號樣本與短芒稗比較相似；8、14、15、16、17、33與無芒稗更近一些；30號有西來稗的一些特點；31、32近于稗原變種。

第三組包括第5、6、7、9、10、11、12、13、18號種群，與無芒稗相近，但是第5號種群的隸屬于第1、2組的成員值也較高，從排序圖上也可以看出該種群與第三組的其他成員有較大差異。

第四組包括第24、25、26、27、28和29號種群。從成員值上看，本組各種群形態(tài)上變異相對小，分類的隸屬關(guān)系明顯。第四組種群在株高、葉長、葉寬、主莖直徑這四個指標上明顯大于其他組，植株基部開展，圓錐花序不或略彎曲總狀花序緊密不分枝，排列不整齊，谷粒不外露，總狀花序小穗無芒且紫色，第一穎長為小穗長度的1/3，統(tǒng)計上與樣本中的其他組有顯著或極顯著的差異。參照Chen等[13]有關(guān)稗及變種的分類標準，本組種類屬于細葉旱稗。從四組的成員值來分析，第4組的合理性最高。

2.3 基于ISSR位點信息的33個種群聚類分析

基于109個遺傳位點信息對33個種群進行主成分分析，得到前6個主成分上的得分值，再進行模糊均值聚類，取不同的分組策略，發(fā)現(xiàn)分成6組時平均輪廓值最高(圖1)。

圖3 33個稗草子代種群在遺傳上對各組的成員值Fig.3 Member values of six genetic groups of 33 Echinochloa populations

第一組包括第1、2、3、4、5號種群，其中2、3、4號遺傳上同質(zhì)程度高，形態(tài)上與西來稗近似；5號樣本的總狀花序有一定分枝，小穗略長。

第二組包括第6～13，31號共計9個種群，除12和31號種群外，其余的遺傳上隸屬于第2組的成員值較高，形態(tài)上與無芒稗有對應性。

第三組包括第14、32、33號共3個種群。14與33與無芒稗、32與稗原變種相近。

第四組包括第15、16、17、20、30號種群。這一組遺傳上高度同質(zhì)，但是形態(tài)上并不能夠?qū)趥鹘y(tǒng)的某個分類單位，其中15、16、17與無芒稗相近一些，20、30號有西來稗的一些特點。

第五組包括第18、19、21、22、23共5個種群，18號種群與短芒稗近似，其余4個與西來稗有較好的對應性。

第六組包括第24、25、26、27、28、29個種群，成員值均比較高，與細葉旱稗有很好的對應性。在葉長、葉寬、主莖直徑、小穗紫色、總狀花序不分枝、圓錐花序長度等性狀上與其他五組的差異達到顯著或極顯著的程度?；?3個稗草樣本ISSR遺傳位點信息的聚類分析結(jié)果(圖1)，同樣的這6個種群也聚成一組；基于形態(tài)的第4組和基于ISSR的第6組具均有很高的分組合理性，因為各種群所隸屬的對應組的成員值均很高(圖2～3)。

2.4稗及變種的形態(tài)、遺傳變異的關(guān)系及其與地理來源的關(guān)系

通過形態(tài)距離、遺傳距離和地理距離三者相關(guān)性的分析，發(fā)現(xiàn)33個種群的形態(tài)變異與遺傳背景因素有關(guān)(r=0.425,n=33,P<0.02)，而遺傳變異與地理來源關(guān)系極為密切，達到極顯著的水平(r=0.684,n=33,P<0.001)。

3 討論

戴水連[11]曾將中國的稗屬植物分成5個類群，在其類群3中包括了無芒稗和西來稗，類群4中包括短芒稗、細葉旱稗。該作者還將短芒稗、細葉旱稗、小旱稗從稗的變種改為孔雀稗(E.cruspavonis(Kunth) Schult)的變種，認為它們的圓錐花序狹窄、較柔輕軟彎曲，小穗也較小，小穗脈上無乳頭狀基毛。但是這種分類處理沒有提供遺傳上的證據(jù)。

在遺傳上，33個種群可以分成6組，無論從二維排序圖還是從反映各種群歸屬相應組的合理性的成員值上分析，遺傳上的這6組之間的過渡現(xiàn)象并不明顯?；贗SSR的6個分組中，第4、5組遺傳上高度同質(zhì)，但是對應的種群在形態(tài)上并不一致；其他的分組中，遺傳上同質(zhì)的組中或多或少與某個分類群在形態(tài)上能夠?qū)饋?，其中?組與細葉旱稗有很好的對應性，在葉長、葉寬、主莖直徑、小穗紫色、總狀花序不分枝、圓錐花序長度等性狀上與其他五組的差異達到顯著或極顯著的程度。

稗的總狀花序是否有二級分枝是一個相對比較穩(wěn)定的性狀，孔雀稗的總狀花序上有極明顯的二級分枝，芒長達15 mm；而細葉旱稗總狀花序幾無分枝，外稃芒一般短于5 mm，因而中國植物志英文版[1]中仍然將細葉旱稗作為稗下的一個變種。但是，從本文的研究結(jié)果看，在稗的種下變異類群中，細葉旱稗具有相對穩(wěn)定的遺傳背景，以及形態(tài)變異幅度也低，與稗的其他種下分類單位的形態(tài)和遺傳上的過渡現(xiàn)象也不明顯，是比較好的分類單位，該種又主要分布于干旱的生境，建議將細葉旱稗提升為種的水平，并將其命名為Echinochloapraticola(Ohwi) Guo S L,Lu Y L,Yin L P & Zou M Y。

稗種下存在著明顯的遺傳分化，這種遺傳分化又極顯著地受地理背景的影響。但是除了細葉旱稗能夠在形態(tài)上比較穩(wěn)定地表現(xiàn)外，其他的遺傳上有分化類群在形態(tài)上的過渡，或有某種趨同適應的表現(xiàn)。其原因可能是，稗原變種、西來稗、無芒稗、短芒稗主要分布于濕潤的稻田環(huán)境，使它們在形態(tài)上有趨同適應的現(xiàn)象，從而造成了遺傳分化的各組間的形態(tài)交叉現(xiàn)象。

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Rice Industry System project(nycytx-01)

introduction：ZOU Man-Yu(1992—),female,Master,mainly engaging in Echinochloa taxonomy and plant ecology.

date:2016-09-14

MorphologicalVariations,GeneticsandGeographicBackgroundofEchinochloacrus-galliinChina

ZOU Man-Yu1LU Yong-Liang2YIN Li-Ping3GUO Shui-Liang1*

(1.College of Life and Environmental Sciences,Shanghai Normal University,Shanghai 200234；2.China National Rice Research Institute,Hangzhou 311400；3.Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau,Shanghai 200234)

Thirty-three seeds ofEchinochloacrus-galli(L.) P. Beauv. from paddy regions of nine provinces(Autonomous Region) of China were sampled and sown in the same environment. Their offspring were obtained. Sixteen morphological traits of their offspring were measured. Nine ISSR primers with good repeatability were selected and 109 ISSR loci were amplified from thirty-threeE.crus-gallisamples. Based on morphological traits and locus information, cluster analysis and principal component analysis on these thirty-three populations were conducted. The main results are as follows:(1)Four morphological groups were identified from these populations, among them areE.crus-gallivar.zelayensis(Kunth) Farw.,E.crus-gallivar.mitis(Pursh) Peterm. andE.crus-gallivar.praticolaOhwi; (2)Six groups were also identified from these samples by using cluster analysis based on ISSR locus data, which corresponds well with the morphological groups, especially forE.crus-gallivar.praticola; (3)Obvious genetic differentiation existed among these thirty-three populations, which is obviously influenced by the geographical locations(r=0.684,n=33,P<0.001). Their morphological variation, however, is weakly affected by the geographical locations(r=0.245,n=33,P<0.2); (4)Both the morphological data and the ISSR data separated the populations ofE.crus-gallivar.praticolafrom the other populations. Therefore, the variety was suggested to elevate to species level:Echinochloapraticola(Ohwi) Guo S L, Lu Y L, Yin L P & Zou M Y.

Echinochloacrus-galli;morphological traits;ISSR;geographic background;variation;Fuzzy C-means cluster analysis

國家水稻產(chǎn)業(yè)體系項目(nycytx-01)

鄒滿鈺(1992—)，女，碩士研究生，主要從事研究稗屬植物分類學和植物生態(tài)學。

* 通信作者：E-mail:gsg@shnu.edu.cn

2016-09-14

* Corresponding author：E-mail:gsg@shnu.edu.cn

Q949.5

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.010