杜 馳 張 冀 張富春*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046； 2.新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

鹽脅迫誘導(dǎo)鹽穗木Rev1、Rev3基因的表達(dá)分析

杜 馳1,2張 冀1,2張富春1,2*

(1.新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，烏魯木齊 830046； 2.新疆生物資源基因工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，烏魯木齊 830046)

根據(jù)鹽穗木鹽脅迫下響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，參考鹽穗木HcRev1、HcRev3基因的ESTs序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物，建立檢測鹽穗木Revs基因相對表達(dá)量的熒光定量PCR方法，分析Rev1和Rev3基因在鹽穗木不同濃度鹽脅迫處理不同時(shí)間的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明，HcRev1、HcRev3基因具有相似的表達(dá)模式，在100 mmol·L-1NaCl低鹽脅迫下表達(dá)穩(wěn)定，在300、500、700 mmol·L-1NaCl脅迫下，隨脅迫濃度增高、脅迫時(shí)間延長，表達(dá)量升高。其中HcRev1在700 mmol·L-1NaCl脅迫14 d后達(dá)到峰值，是對照組的4.63倍。HcRev3基因在300 mmol·L-1NaCl脅迫14 d時(shí)，表達(dá)量迅速升高，是對照組的15.55倍，表達(dá)差異極顯著。研究結(jié)果說明HcRev1、HcRev3基因都受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，提示HcRev1、HcRev3基因雖然表達(dá)量存在差異，但在鹽脅迫過程中參與了DNA損傷修復(fù)。研究有助于闡明Rev1、Rev3基因在DNA損傷修復(fù)和植物耐鹽性間的調(diào)控功能作用。

鹽穗木；HcRev1基因；HcRev3基因；鹽脅迫；表達(dá)分析

植物在外界逆境脅迫條件下，DNA會造成不同程度損傷變異甚至斷裂[1]，細(xì)胞除了直接切除和逆轉(zhuǎn)修復(fù)，對DNA損傷進(jìn)行直接修復(fù)[2]，還可以通過避開、跨越損傷這種間接修復(fù)方式補(bǔ)救DNA損傷[3]。跨損傷DNA合成修復(fù)(Translesion synthesis,TLS)，其中一條重要途徑是易錯(cuò)旁路(error-prone by-pass)，在受損傷的DNA鏈上，為保證遺傳物質(zhì)穩(wěn)定遺傳，損傷修復(fù)途徑無法閱讀DNA損傷區(qū)域，但仍然會“將錯(cuò)就錯(cuò)”的根據(jù)錯(cuò)誤位點(diǎn)進(jìn)行復(fù)制，避免產(chǎn)生缺口[4]。這種修復(fù)機(jī)制是通過降低復(fù)制的保真度，允許損傷及錯(cuò)誤的DNA模板存在，而使復(fù)制得以繼續(xù)進(jìn)行，其本質(zhì)就是利用DNA鏈上錯(cuò)誤的堿基使子代得以完成復(fù)制，避免細(xì)胞的死亡[5]。

DNA聚合酶分為4類：A類，由γ、θ聚合酶組成；B類，包括α、δ、ε和ζ，主要參與DNA復(fù)制和修復(fù)，DNApolα參與DNA的半保留復(fù)制，DNApolδ和ε參與核苷酸切除修復(fù)途徑；X類，β、λ、μ和σ，DNApolβ參與堿基切除修復(fù)途徑；Y類是一類跨損傷修復(fù)聚合酶，有η、ι、κ和Rev1，DNA Polζ與這類聚合酶具有相同的修復(fù)功能[6]。DNA Polζ就是一種易誤性跨損傷修復(fù)聚合酶，Rev1蛋白具有末端脫氧轉(zhuǎn)移酶活性，可與Polζ配合跨越胸腺嘧啶二聚體及其他類型的DNA損傷。Rev1指導(dǎo)dCMP特異的插入到模板無堿基位置的對應(yīng)間隙上，Rev1在模板無堿基位置的對應(yīng)部位上插入1個(gè)C殘基而后DNA Polζ才能進(jìn)行有效延伸。Rev3和Rev7蛋白相結(jié)合形成具跨損傷合成能力的Polζ。Rev3是其催化亞基，Rev7是Polζ的輔因子，Rev7可增強(qiáng)Rev3蛋白穩(wěn)定性及其跨損傷合成效率[7～11]。

新疆干旱荒漠鹽堿地生長的鹽穗木(Halostachyscaspica)隸屬于藜科(Chenopodiaceae)鹽穗木屬(Halostachys)，對鹽分適應(yīng)性極強(qiáng)，是新疆典型的耐鹽植物[12～13]。本實(shí)驗(yàn)前期通過RNA-seq測序技術(shù)對鹽穗木鹽脅迫響應(yīng)的轉(zhuǎn)錄組測序[14]分析，發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫條件下，鹽穗木同化枝和根中DNA損傷應(yīng)激通路中相關(guān)基因的表達(dá)差異明顯。由于DNA損傷修復(fù)是植物抵御各種脅迫傷害的基本應(yīng)答形式，因此，探討鹽脅迫下鹽穗木DNA損傷應(yīng)激通路相關(guān)基因的表達(dá)，對于分析鹽生植物DNA損傷應(yīng)激作用機(jī)理具有重要的理論意義。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

鹽穗木種子采于新疆五家渠103團(tuán)野外鹽堿地(東經(jīng)87.31°北緯44.29°)。播種于鋪有基質(zhì)(珍珠巖∶蛭石∶花土=1∶1∶3，用雙子葉植物營養(yǎng)液拌濕)花盆中，在24±2℃，光照3 000 lux(350 μmol·m-2·s-1,16 h/8 h：晝/夜)，相對濕度為40%～60%條件下，并施以1/4 MS(Murashige and Skoog)培養(yǎng)液培養(yǎng)120 d左右。

1.2 主要儀器與試劑

普通PCR儀是Bio-Rad公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀采用美國ABI Prism? 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)；總提取RNA使用百泰克試劑盒(北京百泰克公司)；cDNA反轉(zhuǎn)錄使用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(2641A,TaKaRa)；熒光染料SYBR? Green使用(204054,QIAGEN)；質(zhì)粒提取及膠回收試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.3 鹽穗木的鹽脅迫處理

選取100、300、500和700 mmol·L-1NaCl處理，處理前48～72 h在托盤中加入自來水，去除干旱脅迫因素。待托盤中自來水吸凈無多余水分，將脅迫所用不同濃度NaCl溶液分別淋澆在基質(zhì)上，直至溶液充滿基質(zhì)，淋出于托盤中。將花盆置于處理前的培養(yǎng)環(huán)境中。各處理濃度下0 h、24 h、72 h、7 d和14 d采集樣品。

1.4 Total RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

稱量NaCl各脅迫處理后的鹽穗木根組織200 mg，用總RNA提取試劑盒(北京百泰克公司)提取總RNA，方法參照試劑盒說明書。用ND-2000和15%變性PAGE膠檢測RNA濃度和質(zhì)量，每份3個(gè)重復(fù)。以1 μg總RNA為模板進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(20 μL反應(yīng)體系)，以Takara Oligo(dT)作為引物用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA。反應(yīng)程序：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液30℃靜置10 min；移至42℃水浴鍋孵育60 min；70℃熱擊15 min；冰浴2 min。以此cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.5 引物設(shè)計(jì)與片段擴(kuò)增

根據(jù)本課題組前期對鹽脅迫下鹽穗木的轉(zhuǎn)錄組的測序結(jié)果，調(diào)取鹽穗木DNA損傷修復(fù)基因HcRev1、HcRev3的開放閱讀框序列，依據(jù)實(shí)時(shí)定量引物設(shè)計(jì)原則，設(shè)計(jì)引物，普通PCR摸索擴(kuò)增條件，檢測引物特異性，引物序列與預(yù)期擴(kuò)增片段長度見表1，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR反應(yīng)擴(kuò)增參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s；72℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

表1 qRT-PCR引物

按PCR產(chǎn)物純化試劑盒(Omega公司)說明書進(jìn)行PCR產(chǎn)物的回收?；厥盏钠闻cpEASY-T5載體(北京全式金公司)連接，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞(北京全式金公司)，酶切鑒定出陽性克隆后，送上海生工生物工程股份有限公司測序。

1.6HcRev1、HcRev3及HcActin基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

選取測序正確的陽性克隆，提取質(zhì)粒，測定濃度，以質(zhì)粒為模板，用Elution Buffer將質(zhì)粒進(jìn)行10倍倍比稀釋，置于-20℃保存?zhèn)溆谩舛纫来蜗♂尀椋?0，1，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6ng·μL-1，以此為模板進(jìn)行定量PCR反應(yīng)，并制作各基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7熒光定量PCR檢測鹽脅迫下HcRev1、HcRev3基因的表達(dá)分析

以100、300、500和700 mmol·L-1NaCl脅迫0、24、72 h，以及7和14 d后鹽穗木根的cDNA為模板，采用三步法進(jìn)行定量反應(yīng)，參照QIAGEN(Invitrogen公司)試劑盒說明書進(jìn)行qRT-PCR，使用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測。以普通PCR確定最佳退火溫度為58℃，Real-time PCR反應(yīng)體系為25 μL：SYBR Green PCR Master Mix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，模板cDNA 1.0 μL，RNase-free ddH2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s；58℃退火30 s；72℃延伸40 s(實(shí)時(shí)熒光信號采集)；40個(gè)循環(huán)；添加熔解曲線；3份生物樣品，每份組織樣品添加3個(gè)技術(shù)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)同時(shí)添加一個(gè)沒有RNase的雙蒸餾水(ddH2O)為模板的陰性對照。數(shù)據(jù)采用2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[15]，應(yīng)用GraphPad Prism 5.0軟件計(jì)算重復(fù)樣品之間Ct均值以及標(biāo)準(zhǔn)偏差，最后使用制圖功能繪制出基因在鹽穗木各濃度脅迫處理組織中的相對表達(dá)柱狀圖。

式中：Eftarget為目的基因的擴(kuò)增效率；Ef reference為內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率；Control為對照組；Experiment為實(shí)驗(yàn)組。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物特異性檢驗(yàn)

以鹽脅迫下鹽穗木根組織cDNA為模板，HcRev1qF、HcRev1qR、HcRev3qF、HcRev3qR、HcActinqF、HcActinqR為引物進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。從目的基因的熔解曲線相關(guān)數(shù)據(jù)表2可以看出，HcActin基因的Tm=(82.73±0.5)℃，HcRev1的Tm=(81.18±0.5)℃，HcRev3的Tm=(80.64±0.5)℃，熔解曲線所得的Tm值都很穩(wěn)定，在熔解溫度時(shí)出現(xiàn)單一的特異性峰，說明引物的特異性良好，沒有引物二聚體和非特異性條帶。

表2 目的基因片段擴(kuò)增標(biāo)準(zhǔn)曲線及熔解曲線相關(guān)數(shù)據(jù)

2.2 基因標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

對兩對基因的陽性標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒做10-n倍梯度稀釋,按照各基因不同稀釋度的Ct值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。HcRev1的擴(kuò)增效率為91.275%，相關(guān)系數(shù)為0.997，HcRev3的擴(kuò)增效率為98.241%，相關(guān)系數(shù)為0.998，HcActin基因的擴(kuò)增效率為90.733%，相關(guān)系數(shù)為0.997。

2.3熒光定量PCR檢測鹽脅迫下HcRev1、HcRev3基因的表達(dá)分析

以HcActin基因作為內(nèi)參基因，采用NaCl模擬鹽脅迫，分析HcRev1、HcRev3基因在不同鹽濃度脅迫處理不同時(shí)間后的表達(dá)量水平變化(圖1)。結(jié)果顯示HcRev1、HcRev3兩個(gè)基因具有相似的表達(dá)模式，在低鹽濃度100 mmol·L-1NaCl 脅迫下表達(dá)穩(wěn)定，在300、500、700 mmol·L-1NaCl脅迫下，隨脅迫濃度增高、脅迫時(shí)間延長，表達(dá)量呈升高趨勢。由圖1A可見，HcRev1在700 mmol·L-1NaCl脅迫14 d后達(dá)到峰值，是對照組的4.63倍。圖1B顯示HcRev3基因在300 mmol·L-1NaCl脅迫14 d時(shí)，表達(dá)量迅速升高，是對照組的15.55倍，差異表達(dá)極顯著，在500、700 mmol·L-1NaCl脅迫14 d后，表達(dá)略有下降，但仍然維持在較高水平。

圖1 鹽穗木HcRev1(A)和HcRev3(B)基因鹽脅迫下表達(dá)分析Fig.1 Relative expression of HcRev1(A)and HcRev3(B)response to salt-stress

3 討論

由于相對定量是將目的基因PCR擴(kuò)增效率看作為100%，但實(shí)際實(shí)驗(yàn)過程中，未經(jīng)條件優(yōu)化的PCR擴(kuò)增效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到理論值，致使定量結(jié)果不準(zhǔn)確[16～17]。因此，在相對定量以前進(jìn)行絕對定量實(shí)驗(yàn)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]，優(yōu)化擴(kuò)增條件，使目標(biāo)基因的實(shí)際擴(kuò)增效率在80%～120%[19]，得到更為可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。但這也降低了定量實(shí)驗(yàn)的效率，增加了實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和難度，是一種耗時(shí)費(fèi)力的工作，使得絕對定量和相對定量結(jié)合使用的文獻(xiàn)少見報(bào)道。

研究表明在DNA跨損傷修復(fù)通路檢測中發(fā)現(xiàn)，哺乳動物的DNApolλ、DNA polζ、Rev1、Rev3、Polη、Polι和Polκ基因表達(dá)量與腫瘤病理分級呈正相關(guān)[20]。說明DNA聚合酶相關(guān)基因的表達(dá)與生物應(yīng)對外界的脅迫密切相關(guān)[21～23]。酵母研究發(fā)現(xiàn)，rev3突變體降低紫外及離子輻射引發(fā)的DNA損傷突變，并且可降低20%真菌的自發(fā)突變率[24]，同時(shí)說明，Rev3對polζ影響真菌的自發(fā)突變起著決定性作用；1996年克隆得到小鼠Rev3基因[25]，敲除該基因?qū)π∈罂僧a(chǎn)生致死性損傷；1998年人Rev3基因得以克隆[26]，證實(shí)該基因表達(dá)與腫瘤組織密切相關(guān)，polζ與酵母該聚合酶具有相似性[27]，而在植物中DNA聚合酶相關(guān)基因應(yīng)對逆境損傷方面鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽穗木Rev1、Rev3基因受到鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，說明植物在鹽脅迫下啟動了DNA損傷修復(fù)通路中的易誤性跨損傷修復(fù)途徑。HcRev1和HcRev3基因在鹽脅迫下表達(dá)模式相似，在低鹽鹽濃度脅迫下二者表達(dá)量均很穩(wěn)定，但二者在高鹽濃度脅迫下表達(dá)量升高倍數(shù)存在差異性，這可能與兩個(gè)基因的功能及基因作用機(jī)理相關(guān)。同時(shí)說明HcRev3對鹽脅迫更為敏感，并在長時(shí)間高鹽脅迫下維持較高的表達(dá)水平，暗示其在易誤性聚合酶DNA Polζ進(jìn)行跨損傷修復(fù)過程中的作用更為重要，該基因的重要性在酵母、小鼠和人的同源基因研究中都得以證實(shí)。在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)研究中發(fā)現(xiàn)，在缺乏Rev1蛋白條件下，DNA Polζ仍舊可以通過插入錯(cuò)誤堿基有效跨越模板上的胸腺嘧啶二聚體[28～30]，與本研究HcRev3表達(dá)倍數(shù)顯著高于HcRev1相一致。

4 結(jié)論

本研究建立了檢測鹽穗木HcRev1和HcRev3基因相對表達(dá)量的熒光定量方法，分析了不同鹽濃度脅迫不同時(shí)間下HcRev1和HcRev3基因在鹽穗木根中的轉(zhuǎn)錄水平，探討了二者響應(yīng)鹽脅迫的表達(dá)變化規(guī)律。結(jié)果表明HcRev1、HcRev3基因具有相似的表達(dá)模式，隨鹽脅迫濃度增高和脅迫時(shí)間的延長，表達(dá)量升高。證明HcRev1、HcRev3兩個(gè)基因都受鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，參與了鹽穗木鹽脅迫應(yīng)答過程。而Rev1、Rev3基因在DNA損傷修復(fù)和植物耐鹽性間的調(diào)控功能有待進(jìn)一步研究。

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Supported by Special Funds of Xinjiang Key Laboratory(2014KL001)

introduction：DU Chi(1990—)，female，master student，mainly engages in research of molecular biology of plant.

date:2016-11-03

ExpressionAnalysisofRev1andRev3ofHalostachyscaspicaunderSaltStress

DU Chi1,2ZHANG Ji1,2ZHANG Fu-Chun1,2*

(1.College of Life Science and Technology,Xinjiang University,Urumqi 830046；2.Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering,Urumqi 830046)

According to the transcriptome ofHalostachyscaspicaunder salt stress, the real-time PCR primers designed aboutRev1 andRev3 were referred to the ESTs of transcriptome sequencing. We established a method for detecting of mRNA transcription ofRevs by Real-time PCR, and the transcription level ofRevs in different concentration of NaCl present. Two genes have similar expression pattern, the expression levels remain stable under 100 mmol·L-1NaCl treatment. As the concentration of NaCl was increased and the stress time was prolonged, the genes relative expression levels were also gradually increased.HcRev1 gene in 700 mmol·L-1NaCl stress for 14 d was rapidly up-regulated and reached the peak level, which was 4.63-fold of the control.HcRev3 gene in 300 mmol·L-1NaCl stress for 14 d was 15.55-fold of the control with significant differences. BothHcRev1 andHcRev3 genes were induced by salt stress, although there were different expression levels ofHcRev1 andHcRev3 genes, which were involved in the DNA damage repair during salt stress.Our study could be used to clarify the regulatory function ofHcRev1 andHcRev3 genes between DNA damage-repair and salt resistance in plants.

Halostachyscaspica;HcRev1 gene;HcRev3 gene;salt stress;expression analysis

新疆重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(2014KL001)

杜馳(1990—)，女，碩士研究生，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

* 通信作者：E-mail：zfcxju@xju.edu.cn

2016-11-03

* Corresponding author：E-mail：zfcxju@xju.edu.cn

Q786

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.008