趙 洋 李曉明 李茹雪 王 春 卜崇峰1,*

(1.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所，楊凌 712100； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，楊凌 712100； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，楊凌 712100)

長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體快速培育的關(guān)鍵影響因子研究

趙 洋1,2李曉明4李茹雪3王 春3卜崇峰1,3*

(1.中國(guó)科學(xué)院水利部水土保持研究所，楊凌 712100； 2.中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，北京 100049； 3.西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所，楊凌 712100； 4.西北農(nóng)林科技大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，楊凌 712100)

為了給苔蘚結(jié)皮野外恢復(fù)的大規(guī)模接種提供豐富種源，本文利用0.1% NaClO(10、15、20、30、45、60、120 s)和0.1% HgCl2(10、15、20、30、45、60、120 s)兩種消毒液，采用Knop、MS和Hoagland 3種培養(yǎng)基，設(shè)置5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5七個(gè)水平的pH值，通過(guò)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，測(cè)定長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚[Didymodonditrichoides(Broth.)]莖葉體的成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)等指標(biāo)，探討影響長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體擴(kuò)繁的關(guān)鍵因子。結(jié)果表明：(1)消毒方式、培養(yǎng)基及pH均對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)有顯著影響(P<0.05)，影響大小依次均為消毒方式>培養(yǎng)基>pH；(2)最適合的消毒方式為：0.1%NaClO消毒15～20 s；(3)最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)的培養(yǎng)基是Knop和Hoagland培養(yǎng)基；(4)最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)的pH是7.5。從而得出快速培育長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的最佳組合為：0.1% NaClO消毒15～20 s+Hoagland/Knop+pH=7.5。本文的研究結(jié)果可以縮短長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚生長(zhǎng)周期以進(jìn)行快速繁殖，為苔蘚結(jié)皮的快速培育以及工程化應(yīng)用提供一定的借鑒。

長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚；原絲體；消毒方式；培養(yǎng)基；pH

苔蘚植物作為一種過(guò)渡植物，具有耐旱、耐寒和養(yǎng)分需求低等特點(diǎn)[1]，不僅能改善其生存地的生態(tài)環(huán)境，使土壤從貧瘠轉(zhuǎn)為肥沃，而且在改善土壤的理化性質(zhì)、增加土壤肥力以及防風(fēng)固沙等方面有著不可忽視的作用[2～4]。

自然條件下，苔蘚結(jié)皮的發(fā)育會(huì)受到一些資源、環(huán)境等的限制，且生長(zhǎng)緩慢，有時(shí)需要幾十年甚至上百年才可以形成穩(wěn)定的苔蘚結(jié)皮層[5]。同時(shí)，苔蘚結(jié)皮的抗干擾能力比較脆弱，一旦受到破壞，便需要漫長(zhǎng)的時(shí)間才可以恢復(fù)[6]。因此，可以通過(guò)苔蘚結(jié)皮的人工培育，縮短其生長(zhǎng)周期，實(shí)現(xiàn)苔蘚結(jié)皮的快速培育與恢復(fù)，使其迅速發(fā)揮水土保持等生態(tài)功能。但苔蘚植物一般個(gè)體矮小，且多種間雜生，不易于鑒別和分離，難以實(shí)現(xiàn)單一種源的大量采集[7]；同時(shí)，苔蘚結(jié)皮的大量采集勢(shì)必會(huì)對(duì)野外地表擾動(dòng)破壞嚴(yán)重，造成不必要的水土流失。而通過(guò)室內(nèi)擴(kuò)繁原絲體技術(shù)僅需少量的結(jié)皮種源就可以獲得大量可供移植的苔蘚結(jié)皮，在室內(nèi)將種源制備好，然后直接接種到野外，可以在一定程度上解決種源問(wèn)題。因此，通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù)來(lái)獲得大量、單一且無(wú)菌的實(shí)驗(yàn)材料可能會(huì)成為苔蘚結(jié)皮領(lǐng)域的重要研究?jī)?nèi)容之一。

原絲體階段是苔蘚植物區(qū)別于其他高等植物的一個(gè)特殊階段，可以通過(guò)苔蘚的孢子、莖葉體、葉部位長(zhǎng)出，而且一條原絲體又可以分化成無(wú)數(shù)個(gè)配子體，從而為苔蘚植物的快速繁殖提供條件[8～9]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者關(guān)于苔蘚的研究報(bào)道較多，但大都集中在苔蘚植物的孢子消毒[10～14]、不同培養(yǎng)條件對(duì)苔蘚植物孢子成活率和原絲體發(fā)育的影響[15～19]以及添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原絲體分化的影響等方面的研究[20～23]，而以苔蘚植物莖葉體為外植體進(jìn)行原絲體培育的鮮有報(bào)道。為此，本研究以長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體為研究對(duì)象，從莖葉體的成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)等方面來(lái)評(píng)價(jià)不同的消毒方式、培養(yǎng)基以及pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)和分化的影響，篩選出擴(kuò)繁長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體關(guān)鍵因子，從而為苔蘚結(jié)皮野外恢復(fù)工程化應(yīng)用提供種源。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用苔蘚結(jié)皮采自陜西省延安市安塞縣紙坊溝(36°46′99″～36°52′44″N，109°17′2″～109°18′50″E)。選擇發(fā)育良好且較為完整的苔蘚結(jié)皮，利用小鏟鏟取苔蘚結(jié)皮層(1 cm厚)，裝入塑料袋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室自然陰干備用。經(jīng)鑒定供試蘚種的優(yōu)勢(shì)種為長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚(Didymodonditrichoides)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 苔蘚結(jié)皮莖葉體的制備

人工挑出肉眼可見(jiàn)的植物殘?jiān)?、土塊、石子等，用自來(lái)水沖洗，使苔蘚植株與土壤分離，并用蒸餾水沖洗數(shù)次，再將洗凈的結(jié)皮陰干，用小刀切成1～2 mm的莖葉體備用。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備

基本培養(yǎng)基為Knop+12%瓊脂；MS+12%瓊脂；Hoagland+12%瓊脂；將pH調(diào)至7.0～7.2。

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，考慮消毒劑與消毒時(shí)間、培養(yǎng)基以及pH這3個(gè)因素，每個(gè)因素水平詳見(jiàn)表1～3，且每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 培育過(guò)程

將長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚的莖葉體分別在0.1% NaClO和0.1% HgCl2兩種消毒液下進(jìn)行7個(gè)時(shí)間梯度(10、15、20、30、45、60和120 s)的消毒。待消毒液消毒完成后，用無(wú)菌水沖洗8～10次，盡可能的洗掉殘留的消毒液，以減少對(duì)莖葉體的傷害。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[24～26]，將消完毒的莖葉體分別接種在上述的培養(yǎng)基(90 mm)上，在智能光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)(培養(yǎng)條件為溫度25℃、光強(qiáng)2 500～3 500 Lux、光照時(shí)間12 h/12 h)，每個(gè)培養(yǎng)基上接種10個(gè)外植體，每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。接種完成后，每天觀察其生長(zhǎng)狀況，10 d后測(cè)定其成活率。

在消毒試驗(yàn)結(jié)束后，試驗(yàn)中選取了Knop、MS和Hoagland 3種培養(yǎng)基作為培養(yǎng)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的基質(zhì)，培養(yǎng)條件同上，隨后設(shè)置了7個(gè)pH梯度(5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5)，定期測(cè)量其成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)，在長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)趨于穩(wěn)定變化時(shí)試驗(yàn)結(jié)束。其中成活率的判別標(biāo)準(zhǔn)是植株是否還存在綠色以及返綠現(xiàn)象，成活率=成活的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%[27]，用肉眼辨別植株的存活情況；原絲體長(zhǎng)度是選用長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體分散形成的原絲體測(cè)量，取最長(zhǎng)的主軸原絲體用尺子測(cè)量其長(zhǎng)度[8]，用毫米表示；原絲體分枝數(shù)是將莖葉體分散形成的原絲體群的數(shù)目用肉眼數(shù)出來(lái)，然后選取最多的分枝數(shù)作為長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的分枝數(shù)。

表1消毒劑與消毒時(shí)間單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

Table1Singlefactorexperimentdesigntableofdisinfectantanddisinfectiontime

消毒劑Disinfectant消毒時(shí)間Disinfectiontime(s)0.1%NaClO0.1%HgCl210、15、20、30、45、60、120

表2 培養(yǎng)基配方表

表3 pH單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)表

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用Excel 2010軟件進(jìn)行處理與分析，數(shù)據(jù)表達(dá)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Means±SE)。利用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 19.0對(duì)不同處理的各個(gè)指標(biāo)進(jìn)行方差分析和多重比較，分析不同因素對(duì)各個(gè)指標(biāo)的影響程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 消毒方式對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的影響

試驗(yàn)考慮在Hoagland培養(yǎng)基下不同消毒方式對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的成活率的影響(表4～5)。將HgCl2和NaClO處理過(guò)的莖葉體接種到3種培養(yǎng)基上都會(huì)造成莖葉體死亡，且HgCl2消毒和NaClO消毒在不同的消毒時(shí)間下均有顯著性差異(P<0.05)，但HgCl2消毒液處理下的最高成活率21.00%都顯著低于NaClO處理下的最低成活率47.78%(P<0.05)，說(shuō)明HgCl2消毒液不適合作為長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的消毒劑。

而NaClO作為苔蘚組織培養(yǎng)中常用的消毒劑，具有一定的揮發(fā)性，對(duì)外植體的毒害作用相對(duì)較小。從本試驗(yàn)的結(jié)果可以看出(表5)，NaClO消毒液在不同的時(shí)間處理下有顯著差異(P<0.05)，且15和20 s處理下的莖葉體的成活率顯著高于10、30、45、60、120 s這5個(gè)處理(P<0.05)，而用0.1% NaClO處理下的15、20 s的莖葉體存活率無(wú)顯著差異(P>0.05)。說(shuō)明，用0.1%的NaClO處理15～20 s是最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的消毒方式。

表4HgCl2消毒液對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的消毒效果(培養(yǎng)10d)

Table4HgCl2disinfectantonthecormusofD.ditrichoidedisinfectioneffect(cultured10d)

HgCl2濃度ConcentrationofHgCl2(%)消毒時(shí)間Disinfectiontime(s)成活率Survivalrate(%)0.110152030456012021.00±0.14b3.82±0.05c0.00±0.00d0.00±0.00d0.00±0.00d0.00±0.00d0.00±0.00d

表5NaClO消毒液對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的消毒效果(培養(yǎng)10d)

Table5NaClOdisinfectantonthecormusofD.ditrichoidedisinfectioneffect(cultured10d)

NaClO濃度ConcentrationofNaClO(%)消毒時(shí)間Disinfectiontime(s)成活率Survivalrate(%)0.110152030456012047.78±0.20c86.73±0.11a83.74±0.06a62.50±0.17b51.14±0.08c55.00±0.13bc52.50±0.06c

注：同列相同字母表示處理間差異不顯著(P>0.05)；不同字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

Note：The same column with the same letters between treatments were not significant(P>0.05);Different letters indicate significant differences between treatments(P<0.05)

圖1 不同培養(yǎng)基下原絲體生長(zhǎng)狀況 A. MS、Hoagland和Knop培養(yǎng)基在0.1% NaClO消毒15 s基礎(chǔ)上培養(yǎng)10 d時(shí)原絲體生長(zhǎng)狀況圖；B. MS、Hoagland和Knop培養(yǎng)基在0.1% NaClO消毒15 s基礎(chǔ)上培養(yǎng)30 d原絲體生長(zhǎng)狀況圖Fig.1 The growth condition of protonema under different culture medium A. MS,Hoagland and Knop culture medium on the basis of 0.1% NaClO disinfection 15 s culture 10 days’s protonema growth condition; B. MS,Hoagland and Knop culture medium on the basis of 0.1% NaClO disinfection 15 s culture 10 days’s protonema growth condition

2.2 培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)考慮在0.1%NaClO消毒15 s的基礎(chǔ)上，選取了Knop、Hoagland和MS 3種培養(yǎng)基，從圖2A可以看出隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，3種培養(yǎng)基上莖葉體的成活率均呈先上升后下降的趨勢(shì)。這是因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期，莖葉體先失去了活性，然后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，莖葉體出現(xiàn)返綠跡象，并分化原絲體和配子體且原絲體和配子體并存，使得成活率上升(圖2)；而培養(yǎng)到30 d時(shí)，培養(yǎng)基中有藻類(lèi)的產(chǎn)生，和莖葉體競(jìng)爭(zhēng)養(yǎng)分，導(dǎo)致一部分的莖葉體死亡，從而使成活率降低。

從圖2B和圖1可以看出在培養(yǎng)10 d時(shí)，MS培養(yǎng)基中莖葉體的存活率顯著低于Knop和Hoagland培養(yǎng)基，而隨著培養(yǎng)時(shí)間的增長(zhǎng)，莖葉體開(kāi)始返綠(圖1)，并不斷的分化出配子體，使得在培養(yǎng)30 d時(shí)，三者之間沒(méi)有存在顯著性差異(P>0.05)。而Knop和Hoagland培養(yǎng)基在培養(yǎng)10和30 d時(shí)都沒(méi)有出現(xiàn)顯著性差異(P>0.05)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，Knop和Hoagland培養(yǎng)基上的莖葉體在7 d左右開(kāi)始萌發(fā)原絲體(圖3E)，而MS培養(yǎng)基上的莖葉體在15 d左右才開(kāi)始萌發(fā)原絲體，而且莖葉體返綠速度很慢。從圖2C～D和圖1也可以直觀看出，在培養(yǎng)30 d時(shí)，接種在MS培養(yǎng)基上的莖葉體的原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)明顯的低于Knop和Hoagland培養(yǎng)基，而Knop和Hoagland培養(yǎng)基上莖葉體分化的原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)并無(wú)明顯差異，但Knop培養(yǎng)基稍微要比Hoagland培養(yǎng)基的值高一些。說(shuō)明Knop和Hoagland培養(yǎng)基最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的生長(zhǎng)，而MS培養(yǎng)基不適合。

2.3 pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)的影響

試驗(yàn)在0.1%NaClO消毒15 s，在Knop和Hoagland培養(yǎng)基下設(shè)置了5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5這7個(gè)pH梯度。從圖4A～B可以看出無(wú)論是Knop還是Hoagland培養(yǎng)基，在pH=5.5的情況下，長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體已經(jīng)全部死亡且沒(méi)有分化原絲體和配子體，與其他幾個(gè)pH處理差異顯著(P<0.01)，說(shuō)明長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體不適合在過(guò)酸的環(huán)境中生長(zhǎng)。從圖4B可以看出在Hoagland培養(yǎng)基的pH=8和pH=8.5的情況下，長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體已經(jīng)全部死亡且沒(méi)有分化原絲體和配子體，說(shuō)明長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體在Hoagland培養(yǎng)基下不適合在偏堿的環(huán)境中生長(zhǎng)。同時(shí)可以看出其他幾個(gè)pH處理隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Knop和Hoagland培養(yǎng)基上的原絲體長(zhǎng)度均呈上升趨勢(shì)，在25～30 d時(shí)趨于平緩增長(zhǎng)，而在30～35 d時(shí)又快速增長(zhǎng)，但在30和35 d的pH處理所表現(xiàn)出的趨勢(shì)一致，所以選擇30 d進(jìn)行后續(xù)分析。

圖2 培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)影響 A.在3種培養(yǎng)基中的長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體成活率隨培養(yǎng)時(shí)間的變化圖；B.在3種培養(yǎng)基中長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體分別在10和30 d的成活率對(duì)比圖；C.在3種培養(yǎng)基中長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚在30 d的原絲體長(zhǎng)度圖；D.在3種培養(yǎng)基中長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚在30 d的原絲體分枝數(shù)圖 相同字母代表無(wú)顯著差異(P>0.05)，不同字母代表差異顯著(P<0.05) 下同。Fig.2 The influence of culture medium to the survival rate of the cormus of D.ditrichoides,length of protonema and number of branches A. Survival rate of the cormus of D.ditrichoides in three kinds of culture medium with the variation of culture time figure; B. Survival rate of the cormus of D.ditrichoides in three kinds of culture medium respectively in the 10 and 30 day comparison figure；C. D.ditrichoides in three kinds of culture medium in a 30-day protonema length figure; D. D.ditrichoides in three kinds of culture medium in a 30-day protonema branch number figure The same letters represent no significant differences(P>0.05);Different letters represent significant differences(P<0.05) The same as below.

圖3 不同培養(yǎng)階段長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)圖 a. Knop培養(yǎng)基下培養(yǎng)10 d左右的莖葉體；b. Knop培養(yǎng)基下培養(yǎng)30 d分化的原絲體；c. Knop培養(yǎng)基下培養(yǎng)40 d生長(zhǎng)的原絲體；d. Knop培養(yǎng)基下培養(yǎng)50 d分化的原絲體和配子體；e.顯微鏡下觀察的7 d分化出來(lái)的原絲體；f. 顯微鏡下觀察的30 d分化的原絲體Fig.3 Different culture stages of the protonema growth of D.ditrichoides a. Cormus cultivated about 10 days under Knop culture medium; b. Differentiation of protonema in 30days under Knop culture medium; c. Differentiation of protonema in 40 days under Knop culture medium; d. Differentiation of protonema and gametophytes in 50 days under Knop culture medium; e. 7 days of differentiation of protonema observed under microscope; f. 30 days of differentiation of protonema observed under microscope

圖4 不同pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體長(zhǎng)度以及分枝數(shù)的影響 A.在Knop培養(yǎng)基不同pH梯度下長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體長(zhǎng)度隨著培養(yǎng)時(shí)間變化圖；B.在Hoagland培養(yǎng)基不同pH梯度下長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體隨著培養(yǎng)時(shí)間變化圖；C.在Knop和Hoaland培養(yǎng)基不同pH梯度下30 d的原絲體長(zhǎng)度圖；D.在Knop和Hoaland培養(yǎng)基不同pH梯度下30 d的原絲體分枝圖Fig.4 Effect of different pH on the D.ditrichoides protonema length and branches A. Protonema length of D.ditrichoides as the culture time variation under different pH gradient of Knop culture medium; B. Protonema length of D.ditrichoides as the culture time variation under different pH gradient of Hoagland culture medium; C. Protonema length in Knop and Hoagland medium cultured 30 days at different pH gradient; D. Protonema branches in Knop and Hoagland medium cultured 30 days at different pH gradient

從圖4C～D可以看出在培養(yǎng)到30 d時(shí)，Knop培養(yǎng)基在pH為7.5時(shí)的原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)最大，且原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)與其他6個(gè)pH處理存在著顯著性差異(P<0.05)，所以在Knop培養(yǎng)基下最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體原絲體生長(zhǎng)的pH是7.5。而在Hoagland培養(yǎng)基下pH在7.5、7和6.5下的原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)三者之間沒(méi)有顯著性差異(P>0.05)，而與pH為6和5.5這兩個(gè)處理存在著顯著差異(P<0.05)，因而在綜合對(duì)比pH為7.5、7和6.5情況下的原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)，可知pH為7.5為長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體在Hoagland培養(yǎng)基下生長(zhǎng)的最適pH。

3 討論

3.1 消毒方式對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的影響

外植體的消毒在苔蘚植物的組織培養(yǎng)中是至關(guān)重要的一步，但由于蘚種的不同以及同一蘚種的不同部位對(duì)于消毒的承受程度大不相同，所以選擇合適的消毒液及其濃度、消毒時(shí)間是很關(guān)鍵的一步[24]。本試驗(yàn)中采用了0.1% NaClO和0.1% HgCl2作為消毒液，并設(shè)置了不同消毒時(shí)間，發(fā)現(xiàn)經(jīng)HgCl2消毒處理的長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的成活率顯著低于NaClO處理，但在NaClO處理下并不是消毒時(shí)間越長(zhǎng)，其成活率越高，而是存在一個(gè)最適值。

本試驗(yàn)確定的最佳消毒方式是：0.1% NaClO處理15～20 s。李曉毓確定最適合尖葉匍燈蘚(Plagiomniumacutum(Lindb.) T.Kop.)外植體的消毒方式是0.05%的HgCl2消毒60 s[28]、郎玉卓發(fā)現(xiàn)的最適合大羽蘚(Thuidiumcymbifolium(Doz. Et Molk.) Doz.Et Molk)配子體的消毒方式是0.5% NaClO+0.05% HgCl2消毒60 s[11]、Gonzadle研究的大羽蘚孢子用5% NaClO消毒5 min才可以得到很好的效果[13]。這和本研究關(guān)于不同蘚種的消毒方式存在一個(gè)最適值是一致的，但是所得到的最佳消毒方式卻不一致。這是因?yàn)椴煌\種對(duì)消毒劑以及消毒時(shí)間的要求不同，同時(shí)本試驗(yàn)選取長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體作為外植體，相對(duì)于苔蘚孢子比較脆弱，以及長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚蘚種的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和生長(zhǎng)的環(huán)境都會(huì)在一定程度上影響消毒效果，從而和前人的研究結(jié)果產(chǎn)生差異。

3.2 培養(yǎng)基對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的影響

培養(yǎng)基質(zhì)會(huì)對(duì)苔蘚植物原絲體的生長(zhǎng)和分化產(chǎn)生影響，而苔蘚植物在培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)還會(huì)受到自身分泌物的反饋抑制作用[29]。崔巍[10]等采用Benecke、MS和Knop 3種培養(yǎng)基培養(yǎng)毛尖紫萼蘚(GrimmiapiliferaP.Beauv)的配子體時(shí)發(fā)現(xiàn)Benecke培養(yǎng)基最適合毛尖紫萼蘚的返綠生長(zhǎng)。杭璐璐[30]等采用MS、Benecke、1/2MS、改良Knop和Knop培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)葉小羽蘚(Haplocladiummicrophyllum(Hedw.) Broth)的孢子時(shí)發(fā)現(xiàn)MS培養(yǎng)基下孢子萌發(fā)率最高。本試驗(yàn)選取了Knop、MS和Hoagland 3種培養(yǎng)基作為長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的培養(yǎng)基質(zhì)。將消毒后的莖葉體接種到培養(yǎng)基上時(shí)發(fā)現(xiàn)MS的染菌率最高，同時(shí)原絲體萌發(fā)時(shí)間最久且生長(zhǎng)緩慢，而Knop和Hoagland兩種培養(yǎng)基上染菌率比較低，且在7 d左右就開(kāi)始萌發(fā)原絲體并且迅速生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)得出MS培養(yǎng)基最不適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的生長(zhǎng)，而Knop和Hoagland培養(yǎng)基兩者之間沒(méi)有顯著差異(P>0.05)。在MS培養(yǎng)基下長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚的原絲體不僅萌發(fā)晚而且生長(zhǎng)緩慢，這是由于培養(yǎng)基成分不同。MS作為一種無(wú)機(jī)培養(yǎng)基在很多苔蘚種的組織培養(yǎng)中表現(xiàn)出絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，但在本試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)其不適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的生長(zhǎng)，此結(jié)果和李曉毓[28]等的研究結(jié)果一致，這表明苔蘚植物組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基無(wú)機(jī)鹽成分并不是越全越好。同時(shí)由于不同的苔蘚種對(duì)培養(yǎng)基質(zhì)的要求是不同的，原絲體在生長(zhǎng)的過(guò)程中，也會(huì)分泌一些化合物到培養(yǎng)基上[29]，這些化合物會(huì)在某種程度上與培養(yǎng)基相互作用，從而影響原絲體的生長(zhǎng)，在MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的原絲體會(huì)分泌很多的植物激素，從而影響原絲體生長(zhǎng)，促進(jìn)配子體的分化[31～32]。

3.3 pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的影響

不同苔蘚植物對(duì)pH有不同的適應(yīng)范圍，且不同原始生境的苔蘚植物之間對(duì)環(huán)境的pH要求差異也很大。王振杰[33]等在研究不同培養(yǎng)基和pH對(duì)金灰蘚(Pylaisiellapolyantha(Hedw.)Grout)孢子萌發(fā)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，在Knop、SH、N63種培養(yǎng)基下設(shè)置不同的pH梯度后，金灰蘚孢子在3種培養(yǎng)基中萌發(fā)最好的pH分別為7、8、7，說(shuō)明金灰蘚孢子適合在堿性環(huán)境中生存。本試驗(yàn)選取了5.5～8.5中的7個(gè)pH梯度進(jìn)行長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)pH為5.5時(shí)，長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體未分化原絲體和配子體且已經(jīng)全部死亡。

本試驗(yàn)得出最適合長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)的pH為7.5，和他人的研究結(jié)果不一致。這是因?yàn)椴煌μ\種對(duì)pH的要求差異很大，一般認(rèn)為苔蘚植物最適的pH范圍是5～9。而在苔蘚植物組織培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)條件的最適pH不僅取決于苔蘚植物的種類(lèi)，同時(shí)和該種苔蘚植物生長(zhǎng)的原始生境有一定的關(guān)系，而在特殊生境中生長(zhǎng)的苔蘚植物對(duì)培養(yǎng)基的pH要求更嚴(yán)格。本試驗(yàn)采集的長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚采自陜北安塞紙坊溝，其生境處的pH為7.8，試驗(yàn)得出的結(jié)果也驗(yàn)證了這一說(shuō)法，此外苔蘚植物在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)分泌一些物質(zhì)從而在一定程度上也會(huì)影響培養(yǎng)基的pH[31]。長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚的生境是在黃土區(qū)，而黃土區(qū)的土質(zhì)偏堿性，這樣就使得在組織培養(yǎng)條件下，長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚的原絲體更適合在中性偏堿的環(huán)境中生存。

4 結(jié)論

采用單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，在智能光照培養(yǎng)箱(溫度25℃、光強(qiáng)2 500～3 500 Lux、光照時(shí)間12 h/12 h)的條件下進(jìn)行長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的組織培養(yǎng)，研究了不同的消毒方式、培養(yǎng)基及pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體生長(zhǎng)和分化的影響，主要結(jié)論有：(1)消毒方式、培養(yǎng)基和pH對(duì)長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體的成活率、原絲體長(zhǎng)度和分枝數(shù)均有顯著影響(P<0.05)，對(duì)于長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚莖葉體成活率、原絲體長(zhǎng)度和的影響順序?yàn)橄痉绞?培養(yǎng)基>pH；(2)快速培育長(zhǎng)尖對(duì)齒蘚原絲體的最佳組合為：0.1% NaClO消毒15～20 s+Hoagland/Knop+pH為7.5。本試驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以為黃土區(qū)苔蘚結(jié)皮野外恢復(fù)工程化應(yīng)用提供一些借鑒。

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The Light of West China of Chinese Academy of Sciences(2014-91)；The Fundamental Research Funds for the Central Universities (2014YQ006)；The National Nature Science Foundation of China(41541008)

introduction：ZHAO Yang(1992—),female,master students,engaged in the rapid cultivation of moss crust’s protonema.

date:2016-11-03

TheResearchofKeyInfluenceFactorsofRapidCultureoftheProtonemaofDidymodonditrichoides

ZHAO Yang1,2LI Xiao-Ming4LI Ru-Xue3WANG Chun3BU Chong-Feng1,3*

(1.Institute of Soil and Water Conservation,Chinese Academy of Sciences and Ministry of Water Resources,Yangling 712100；2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049；3.Institute of Soil and Water Conservation,Northwest A&F University,Yangling 712100；4.College of Nature Resource and Environment,Northwest A&F University,Yangling 712100)

In order to provide a rich source of mass vaccination for the field restoration of moss crust, we used two kinds of disinfection method, 0.1% NaClO(10, 15, 20, 30, 45, 60, 120 s) and 0.1% HgCl2(10, 15, 20, 30, 45, 60, 120 s), with Knop, MS and Hoagland as culture media, and set the pH values(5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5), through the single factor experiment design method, we determined the survival rate of the cormus of [Didymodonditrichoides(Broth.)], protonema length and number of branches, thereby exploring key factors that affect the propagation of the protonema ofD.ditrichoides. The results are as follows: (1)The disinfection method, culture medium and pH value have significant influence upon the survival rate of the cormus ofD.ditrichoides, length of protonema and number of branches(P<0.05), in a descending order of disinfection method, culture medium, and pH value; (2)The most suitable disinfection method is 0.1% NaClO with a duration of 15-20 s; (3)The most suitable culture medium for the growth of the protonema ofD.ditrichoidesis Knop and Hoagland; (4)The most suitable pH value for the growth of protonema ofD.ditrichoidesis 7.5. Therefore, the best combination of factors for rapid cultivation of the protonema ofD.ditrichoidesis 0.1% NaClO disinfection 15-20 s+Hoagland/Knop+pH=7.5. Our experiment can be determined to shorten the growth cycle ofD.ditrichoidesand realize rapid propagation, thereby providing experience for the rapid culture and engineering application of moss crust.

Didymodonditrichoides;protonema;disinfection method;culture medium;pH

中國(guó)科學(xué)院西部之光(2014-91)；中央高校優(yōu)秀青年科研業(yè)務(wù)專(zhuān)項(xiàng)基金(2014YQ006)；國(guó)家自然科學(xué)基金(41541008)

趙洋(1992—)，女，碩士研究生，主要從事苔蘚結(jié)皮原絲體的快速培育研究。

* 通信作者：E-mail：buchongfeng@163.com

2016-11-03

* Corresponding author：E-mail：buchongfeng@163.com

S154

A

10.7525/j.issn.1673-5102.2017.02.005