尹利方，任 禛,2,3*，夏體淵**，朱維賢，陳澤斌,2，靳 松，顏家亮，趙曉紅

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214；4.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650034)

應(yīng)用克隆文庫(kù)構(gòu)建法研究枇杷根系A(chǔ)MF多樣性

尹利方1，任 禛1,2,3*，夏體淵1**，朱維賢4，陳澤斌1,2，靳 松1，顏家亮1，趙曉紅1

(1.昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)院，云南 昆明 650214；2.云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650214；3.云南省高校特色生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650214；4.昆明市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 昆明 650034)

【目的】為進(jìn)一步探尋和利用寶貴的AMF資源提供有效的研究方法?！痉椒ā吭诶ッ鲗W(xué)院隨機(jī)采集枇杷根系作為實(shí)驗(yàn)樣品，采用CTAB法提取根系 DNA，進(jìn)行18S rDNA PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)入大腸桿菌JM109受體，建立18S rRNA部分基因克隆文庫(kù)。從文庫(kù)中隨機(jī)選取35個(gè)白色克隆子，經(jīng)鑒定，獲得30個(gè)陽(yáng)性克隆子，將陽(yáng)性克隆子測(cè)序。運(yùn)用Mothur等軟件分析陽(yáng)性克隆子序列，確定9條差異序列，為不同的AMF序列?！窘Y(jié)果】克隆文庫(kù)的Coverage C值為93.3 %，克隆文庫(kù)的Shannon-Wiener指數(shù)為2.079，Simpson指數(shù)為0.87，且Rarefaction曲線比較飽和。9個(gè)序列分為了兩個(gè)不同的類群，代表不同AMF種類；球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類群，OUT1和OTU2代表了文庫(kù)中的主要類型，其中OTU1為根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)；OTU3、OTU4、OTU5和OTU6代表著文庫(kù)中的常見(jiàn)類型；其余序列則為枇杷根系中的少見(jiàn)或稀有AMF類型?！窘Y(jié)論】球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類型，其中根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)為優(yōu)勢(shì)AMF種類。

枇杷；AMF；克隆文庫(kù)；18S rRNA基因；系統(tǒng)發(fā)育分析

叢枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhizal Fungi，AMF)是在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中分布最廣泛的一類內(nèi)生性真菌，參與了碳、氮、磷等多種元素的生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程，能與80 %以上的植物形成菌根結(jié)構(gòu)[1]，是與植物關(guān)系比較友好的微生物之一。【研究意義】AMF與植物建立互惠互利共生的關(guān)系，主要表現(xiàn)在促進(jìn)植物根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，提高植物根系對(duì)水肥吸收利用率、增強(qiáng)植物對(duì)逆境的抵抗能力、提高苗木移栽后的水分吸收，促進(jìn)成活、增強(qiáng)植株光合作用能力，增加植物內(nèi)有機(jī)物的合成，使植物生長(zhǎng)茂盛，增加植物生物量、提高作物產(chǎn)量和改善產(chǎn)品品質(zhì)等有利方面[2-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】研究表明，接種叢枝菌根真菌后的棉花生長(zhǎng)速度明顯提高，植株對(duì)營(yíng)養(yǎng)吸收的狀況也得到了改善，楊梅在接種叢枝菌根真菌后，幼苗的光合作用能力也得到明顯提高，抗逆性得到加強(qiáng)[5]。因此，選擇適合的AMF菌劑用于經(jīng)濟(jì)作物以及農(nóng)作物的生產(chǎn)是可行的。叢枝菌根真菌在自然環(huán)境中能夠促進(jìn)生物間的物質(zhì)交換，促進(jìn)生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)，加強(qiáng)植物之間的信息傳遞，促進(jìn)生態(tài)環(huán)境能量的流動(dòng)以及保護(hù)和提高生物的多樣性，穩(wěn)定生態(tài)系統(tǒng)平衡。因此，AMF的生態(tài)結(jié)構(gòu)及群落多樣性成為研究新型生物肥的基礎(chǔ)，大量研究者的關(guān)注使其成為研究熱點(diǎn)。【本研究的切入點(diǎn)】枇杷(Eriobotryajaponica)是AMF的普遍寄主之一，當(dāng)AMF侵染枇杷根系并建立穩(wěn)定的共生體后，能夠改善枇杷的光合特性，促進(jìn)植物根系對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收并促進(jìn)植株生長(zhǎng)，增強(qiáng)植株對(duì)鹽脅迫和低溫等逆境的適應(yīng)能力，增產(chǎn)增收[6-8]。本研究以AMF侵染的枇杷根系為材料，提取DNA。運(yùn)用巢式PCR擴(kuò)增枇杷根系A(chǔ)MF的18S rRNA基因部分片段，目的產(chǎn)物通過(guò)特定引物連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌，構(gòu)建克隆文庫(kù)，應(yīng)用Mothur軟件分析，篩選出差異類群測(cè)序，并對(duì)具有差異類群的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，探明枇杷根系A(chǔ)MF多樣性和親緣關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究旨在探明AMF侵染枇杷根系的主要類群和稀有類群，為進(jìn)一步研究枇杷根系A(chǔ)MF真菌主要的功能類群和相應(yīng)作用奠定基礎(chǔ)，為其他植物根系A(chǔ)MF 18S rDNA克隆文庫(kù)的構(gòu)建提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

選擇昆明學(xué)院農(nóng)學(xué)樓西側(cè)無(wú)明顯病害枇杷樹(shù)，隨機(jī)采集枇杷部分根系，用蒸餾水把采集后的根系清洗干凈，然后將清洗干凈的根系剪成長(zhǎng)度為0.2 cm的小段。

1.2 根系DNA提取

DNA提取的方法參照任禛等改進(jìn)的CTAB法[9]進(jìn)行，獲得的DNA加入TE溶解，-20 ℃條件下保存。

1.3 目的片段的巢式PCR擴(kuò)增

枇杷根系DNA適當(dāng)稀釋后進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1[10]。首次擴(kuò)增引物為Geo A2和Geo11，18S rDNA通用引物，片段長(zhǎng)度為1.8 kb。反應(yīng)所用試劑及用量：10 × PCR buffer 2.5 μl，dNTP(2.5 mmol/L)2 μl，Geo11(10 μmol/L)1 μl，GeoA2(10 μmol/L)1 μl，Taq(5 U/μl)0.2 μl，模板DNA 1 μl，ddH2O補(bǔ)充至25 μl。反應(yīng)過(guò)程：95 ℃ 5 min，95 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。將上述獲得的產(chǎn)物進(jìn)行第2次擴(kuò)增，所使用引物為AMF特異混合引物，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為550 bp。反應(yīng)所用試劑及用量同第一步，反應(yīng)過(guò)程為95 ℃ 預(yù)變性5 min，95 ℃ 45 s，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min 30 s，30次循環(huán)，72 ℃ 10 min。使用Tiangen多功能膠回收純化PCR 最終產(chǎn)物，獲得質(zhì)量較好、純度較高的目的片段，將獲得的DNA片段構(gòu)建克隆文庫(kù)。

1.4 目的基因克隆、陽(yáng)性克隆子確定以及Mothur分析

運(yùn)用Takara pMD 18-T Vector克隆試劑對(duì)純化的目的產(chǎn)物進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞JM109，隨后轉(zhuǎn)化產(chǎn)物在含有青霉素、X-Gal及IPTG的LB平板上隔天培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性克隆子。隨機(jī)挑選35個(gè)白色克隆子，擴(kuò)大培養(yǎng)在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行，使用試劑盒抽提質(zhì)粒，并運(yùn)用PCR擴(kuò)增方式檢驗(yàn)插入DNA片段長(zhǎng)短，最終得到30個(gè)陽(yáng)性克隆子，之后對(duì)30個(gè)陽(yáng)性克隆子進(jìn)行測(cè)序。對(duì)測(cè)序后的結(jié)果進(jìn)行目的基因的提取。使用ClustalX 1.8進(jìn)行目的基因?qū)Ρ确治?。將開(kāi)始和末尾處長(zhǎng)度不同的序列剪切整齊，避免長(zhǎng)短不一的序列增加序列間的差異。應(yīng)用Mothur軟件對(duì)剪切后的序列進(jìn)行分析。根據(jù)軟件對(duì)比分析結(jié)果，認(rèn)為2種序列相似性在98 %的克隆子為相同的基因型，每種基因型代表一個(gè)可操作分類單元(Operational Taxonomic Unit，OTU)，挑選代表不同序列的克隆子，編號(hào)為不同OTU。

1.5 克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)及多樣性計(jì)算

依據(jù)Moyer等[11]的文獻(xiàn)，根據(jù)克隆文庫(kù)中每個(gè)OTU對(duì)應(yīng)的克隆子數(shù)目和總的OTU數(shù)目，計(jì)算克隆文庫(kù)的庫(kù)容值Coverage C，計(jì)算公式為C=[1-(n/N)]×100 %，n為單個(gè)克隆子的OTU數(shù)，N代表總的OTU數(shù)目。使用Analytic Rarefaction version 1.3繪制克隆文庫(kù)的稀有度飽和曲線(Rarefaction Curve)[12]，枇杷根系A(chǔ)MF文庫(kù)的多樣性指數(shù)運(yùn)用SPADE軟件計(jì)算[9]。

表1 Nest-PCR引物

1.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

使用GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST程序，把挑選出來(lái)的OTU分別進(jìn)行相似性比對(duì)，選擇相似度較高的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析。分析軟件為Mega4.1，通過(guò)鄰近法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果

枇杷根系所提取的菌根真菌DNA風(fēng)干后呈透明狀，數(shù)量較少，電泳檢測(cè)結(jié)果看到的條帶不是很清晰，DNA較為分散、雜亂，難以看到明顯的片段，但是有少量的DNA存在，后續(xù)擴(kuò)增不受影響，可以將提取物直接用于PCR擴(kuò)增。由巣式PCR擴(kuò)增結(jié)果可以看出(圖1)，DNA通過(guò)第1次PCR擴(kuò)增后，電泳檢測(cè)圖看到，在1.8 kb左右的條帶比較明亮，表示此次擴(kuò)增比較成功，同時(shí)說(shuō)明得到了大量的DNA，在800 bp左右有模糊條帶，表示有微弱的非特異性擴(kuò)增，不過(guò)第2次擴(kuò)增不受影響。將第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物按比例稀釋后，進(jìn)行第2次擴(kuò)增，由圖1看出，在550 bp左右獲得明亮條帶，說(shuō)明成功獲得目標(biāo)產(chǎn)物，能夠進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。證明反應(yīng)體系和條件滿足實(shí)驗(yàn)要求。采用回收試劑盒回收電泳檢測(cè)的目標(biāo)產(chǎn)物目的片段，回收后的目的片段連接到pMD 18-T 載體中，轉(zhuǎn)化到JM109中，成功建立克隆文庫(kù)。

M1：λ-hind Ⅲ digest DNA Marker；M2、M3均代表DL2000 Marker；1為根系提取的DNA；2為第1次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3為第2次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物M1:λ-hind Ⅲ digest DNA Marker; M2, M3 represent the DL2000 Marker; Lane1: DNA of the roots; Lane2: Results of the first Nested PCR; Lane3: Results of second Nested PCR圖1 Nested-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Amplification by Nested-PCR

2.2 陽(yáng)性克隆篩選以及Mothur

隨機(jī)挑選的35個(gè)白色克隆子。通過(guò)驗(yàn)證，共確定30個(gè)陽(yáng)性克隆子，確定的陽(yáng)性克隆子測(cè)序后，提取目的片段，去除多余的引物并通過(guò)ClustalX 1.8分析獲得的目的基因(圖2)。為降低目的基因的差異，以最短基因長(zhǎng)度為標(biāo)準(zhǔn)，切除其他基因多余的部分。整理好的基因使用Mothur軟件分析，共確定了9個(gè)差異序列，選擇每個(gè)差異序列中代表序列，分別命名為不同的OTU。將不同的OTU序列與GenBank的序列對(duì)比，結(jié)果表明9個(gè)OTU序列為不同的AMF類群。

2.3 枇杷根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)評(píng)價(jià)及多樣性指數(shù)

通過(guò)驗(yàn)證，排除了5個(gè)假陽(yáng)性克隆子，n=2、N=30?？寺∥膸?kù)Coverage C為93.3 %，通過(guò)Rarefaction軟件繪制出的克隆文庫(kù)的稀有度飽和曲線表明，隨著克隆子數(shù)目的增加，克隆文庫(kù)的OTU數(shù)目增加逐漸緩慢(圖3)，說(shuō)明所建立的文庫(kù)能夠說(shuō)明枇杷根系內(nèi)實(shí)際的AMF類群，表明所取OTU序列建立的克隆文庫(kù)能夠代表枇杷根系實(shí)際的AMF類群，更多的取樣也可能只產(chǎn)生少量新的OTU，樣品中所代表的AMF類群在實(shí)際土壤中占有的比例較大，庫(kù)容較為飽和。文庫(kù)的Simpson指數(shù)和Shannon-WienerSimpson指數(shù)分別為0.87和2.079，說(shuō)明枇杷根系的AMF種類較多。

圖2 陽(yáng)性克隆子確定Fig.2 Identified results of positive clones

圖3 克隆文庫(kù)的稀有度飽和曲線Fig.3 The rarefaction curve of clone library

2.4 AMF的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析

運(yùn)用BLAST軟件分析表明，9個(gè)OTU序列中，5個(gè)OTU序列與叢枝菌根(AM)真菌根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)部分序列相似性較高，關(guān)系比較近；2個(gè)OTU序列與不可培養(yǎng)球囊霉(UnculturedGlomus)屬克隆子親緣關(guān)系比較近；2個(gè)OTU序列與不可培養(yǎng)球囊菌門(Uncultured Glomeromycota)相似度高，關(guān)系比較近(表2)。

從GenBank中分別篩選出與9個(gè)OTU相似度較高的序列，參與系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中看出，9個(gè)OTU序列被劃分為2個(gè)大的類群。OTU4、OTU5、OTU6、OTU9劃分在一個(gè)支系中。在這個(gè)支系中，OTU6獨(dú)立于其他3個(gè)OTU。根據(jù)GenBank中相似對(duì)比結(jié)果，OTU6與根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高。進(jìn)一步細(xì)分后，OTU9與 OTU4 、OTU5被劃分為兩個(gè)小支系，兩支系間的關(guān)系較為相近。OTU9與根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高。OTU4被分到兩個(gè)不可培養(yǎng)的球囊霉屬(UnculturedGlomus)之間，表明兩者親緣關(guān)系較近。OTU5在進(jìn)化樹(shù)中，被分到兩個(gè)不可培養(yǎng)的球囊霉屬(UnculturedGlomus)之間，表明三者親緣關(guān)系較近。對(duì)進(jìn)化樹(shù)支系親緣關(guān)系分析并結(jié)合GenBank對(duì)比結(jié)果(表2)表明，OTU4與根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似性為99 %，但在進(jìn)化樹(shù)中與2個(gè)不可培養(yǎng)的球囊霉屬(UnculturedGlomus)關(guān)系較近，可認(rèn)為OTU4為球囊霉屬(Glomus)的序列，表示該類群；OTU5與不可培養(yǎng)的球囊霉屬(UnculturedGlomus)相似性為100 %，認(rèn)為OTU5代表該球囊霉屬類型；OTU9、OTU6與根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似性為99 %，認(rèn)為OTU9、OTU6代表該類群，且OTU9和OTU6分別獨(dú)立在進(jìn)化樹(shù)的不同分支上，可能代表著比較新穎的根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)。

另一分支中，OTU1、OTU2、OTU3、OTU7和OTU8集聚在一個(gè)大的支系，為一個(gè)類群，支系中沒(méi)有已知的AMF進(jìn)行比較。且OTU1、OTU2、OTU7與OTU3、OTU8分散在不同的分支上。由表2可知，OTU1、OTU7與GenBank中根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)相似度較高，相似度分別為100 %、99 %，可認(rèn)為2種序列為根內(nèi)根生囊霉；OTU2與GenBank中不可培養(yǎng)的球囊霉屬(Glomus)相似度較高，相似度為100 %，可認(rèn)為OTU2為該類型；OTU3、OTU8與不可培養(yǎng)的球囊菌門(Uncultured Glomeromycota)相似度較高，相似度分別為98 %、99 %，可認(rèn)為OTU3、OTU8為該類群。OTU1、OTU2、OTU7與GenBank中相近序列的相似性高達(dá)99 %～100 %，但在系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)中與GenBank中相近序列分開(kāi)，獨(dú)立成為一個(gè)新的分支，說(shuō)明OTU1和OTU7可能代表較為新穎的根內(nèi)根生囊霉，OTU2可能代表著新穎的球囊霉屬。

9個(gè)OTU代表序列在文庫(kù)中所對(duì)應(yīng)的克隆子類型和數(shù)目不同。由表2可知，主要侵染的AMF類型是根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)和球囊霉屬(Glomus)，從OTU序列數(shù)目可知，侵染枇杷根系的主要真菌類群是OTU1和OTU2，OTU3、OTU4、OTU5和OTU6則代表了常見(jiàn)類群，OTU7、OTU8和OTU9為文庫(kù)中的少有或稀有AMF種類。

表2 9條OTU序列的BLAST

圖3 枇杷根系A(chǔ)MF 18S rDNA部分序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析Fig.3 Phylogenetic tree analysis based on AMF 18S rRNA gene partial sequences from loquat roots

3 討 論

AMF是一類具有實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值和重要生態(tài)學(xué)意義的土壤微生物，其在農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中發(fā)揮著重要作用，菌根作為未來(lái)的菌肥、生物防治劑和生物調(diào)節(jié)劑，對(duì)于促進(jìn)植物生長(zhǎng)、農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展有不可忽視的作用，并被廣泛認(rèn)同，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上有著很高的利用價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。但是，目前還不能實(shí)現(xiàn)人工培養(yǎng)AMF真菌，這給研究這類真菌提出了新的難題，成了研究這類真菌一大瓶頸。伴隨新技術(shù)的出現(xiàn)，分子生物學(xué)方面的技術(shù)也不斷得以發(fā)展、完善，各種生物技術(shù)逐漸應(yīng)用到AMF的菌種鑒定和群落結(jié)構(gòu)的分析中，甚至多種生物技術(shù)的結(jié)合協(xié)作，克服了傳統(tǒng)研究方法的不足，AMF類型及多樣性的研究更加準(zhǔn)確。至今，國(guó)外對(duì)于這方面的研究比較廣泛，而國(guó)內(nèi)相關(guān)的研究比較少，并且研究方式單一，占主導(dǎo)地位的是運(yùn)用PCR-DGGE分析。龍良鯤等[13]最早使用了DGGE研究AM真菌并陳述的相關(guān)的研究結(jié)果，不足之處是DNA條帶清晰度不高、重復(fù)性不好，作者的觀點(diǎn)是PCR產(chǎn)物太大，使得最終的結(jié)果不理想。接偉光等[14]在DGGE技術(shù)的基礎(chǔ)上，降低了擴(kuò)增產(chǎn)物過(guò)大的情況，獲得了新的成果。黃檗根系和根際土壤中的AM真菌DNA條帶清晰，可靠性強(qiáng)，在此之后，該作者在AMF真菌孢子的鑒定中又使用DGGE技術(shù)[15]。蔡邦平等[16]采用AFLP技術(shù)分析了梅根系中AMF的DNA多樣性，得到了理想的結(jié)果。與之比較后，筆者認(rèn)為，本研究采用的rDNA序列分析更具有優(yōu)勢(shì)。它能夠克服DGGE、AFLP方法的不足。DGGE方法獲得的DNA不多，信息量涵蓋少、基因片段長(zhǎng)度不夠，AFLP方法的靈敏度低、結(jié)果不夠明顯，且具有費(fèi)用較高，對(duì)使用的儀器要求較高的缺點(diǎn)[17]，因此克隆文庫(kù)建立必將成為研究AMF多樣性的主要技術(shù)手段。

系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)結(jié)果表明，9個(gè)OTU序列中，有5個(gè)序列獨(dú)立于一個(gè)大分支上，且又分散在兩個(gè)小的支系上。其余4個(gè)OTU分散在不同序列間，屬于不同的AMF?？傮w呈現(xiàn)大分散，小聚集的序列結(jié)構(gòu)?？梢?jiàn)侵染枇杷根系的AMF的種類比較豐富。大多為新穎的AMF類型。這與任禛等[9]在番茄根系中的研究不太一致，在植物的根系中，發(fā)現(xiàn)了兩種類型截然不同的AMF。但存在與GenBank中相似性較遠(yuǎn)的序列。自然界中的AMF類型眾多，并且不僅僅只局限于人們探明的類型，只有運(yùn)用合適的實(shí)驗(yàn)手段，才能反映真實(shí)的AMF情況。在克隆文庫(kù)建立中，為提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，筆者著重于幾方面的實(shí)驗(yàn)過(guò)程：第一，目的基因片段使用巢式PCR擴(kuò)增，特異性強(qiáng)、高靈敏度，對(duì)提取到的DNA濃度要求不高，少量的DNA通過(guò)擴(kuò)增，也能獲得目的片段；第二，3次擴(kuò)增，將引物AM1、AM2和AM3進(jìn)行混合，混合引物能夠提高特異性，獲得更多文庫(kù)中的AMF類型；第三，克隆子數(shù)目的增加，提高了實(shí)驗(yàn)的真實(shí)性。本實(shí)驗(yàn)對(duì)枇杷根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)的建立屬于初步研究，第1次巣式PCR擴(kuò)增中存在非特異性擴(kuò)增，因此還需要對(duì)DNA提取和特異引物選擇等方面進(jìn)行改進(jìn)。

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析表明，所提取序列較復(fù)雜，但都是AM真菌的特異序列，可為后續(xù)研究提供參考依據(jù)。其中OTU1、OTU2所代表的Rhizophagusirregularis和Glomus屬是侵染枇杷根系的優(yōu)勢(shì)類群，這也是中國(guó)農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)中常見(jiàn)的AMF，它們?cè)谥参镏行纬删缶哂兄匾纳鷳B(tài)學(xué)意義。宋放[18]等通過(guò)對(duì)柑橘根部采樣測(cè)序，發(fā)現(xiàn)柑橘根系A(chǔ)MF主要為Glomus屬和Rhizophagus屬，其中豐富度最高的菌種是Rhizophagusirregularis、Rhizophagusfasciculatus和Glomussp. W3347，在人工檸條林的根系，利用DGGE技術(shù)找到了Glomusintraradices(現(xiàn)常用名為Rhizophagus irregularis)[19]、Glomusfasciculatum、以及其它2種未知AMF類型[20]。任禛[9]曾發(fā)現(xiàn)，Glomusmosseae是主要侵染玉米根系的AMF類群。因此，不同的AMF選擇不同植物形成共生關(guān)系，不同植物根系內(nèi)的AMF類群和多樣性也不相同。通過(guò)分子生物學(xué)的手段，能夠準(zhǔn)確認(rèn)知不同植物根系的AMF群落結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，為研究、收集、開(kāi)發(fā)使用AMF資源打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。目前，在世界范圍內(nèi)的研究者對(duì)AMF熱情高漲。AMF在生態(tài)、生理學(xué)的研究，新技術(shù)的應(yīng)用等方面均有相關(guān)報(bào)道。盡管從枝菌根真菌多樣性的研究成為了熱點(diǎn)，也取得了比較多的成就，但目前對(duì)于不同生態(tài)系統(tǒng)中的AMF多樣性的認(rèn)識(shí)還不夠具體[21]，但可以預(yù)知，在未來(lái)的叢枝菌根真菌研究發(fā)展方向上，對(duì)其研究所使用的技術(shù)將逐漸大眾化，其應(yīng)用技術(shù)的商品化程度將更高，今后叢枝菌根真菌菌劑將成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中依賴的生物科學(xué)技術(shù)之一。

4 結(jié) 論

從枇杷根系A(chǔ)MF克隆文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)，球囊霉屬(Glomus)是枇杷根系的主要AMF類群，OUT1和OTU2代表了文庫(kù)中的主要類型，其中OTU1為根內(nèi)根生囊霉(Rhizophagusirregularis)；OTU3、OTU4、OTU5和OTU6代表著文庫(kù)中的常見(jiàn)類型；OTU7、OTU8和OTU8則為枇杷根系中的少見(jiàn)或稀有AMF類型。

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StudyonSpeciesDiversityofAMFCommunityColonizingLoquatRootsbyConstructingCloneLibrary

YIN Li-fang1, REN Zhen1,2,3*, XIA Ti-yuan1**, ZHU Wei-xian4, CHEN Ze-bin1,2, JIN Song1, YAN Jia-liang1, ZHAO Xiao-hong1

(1.Agriculture College, Kunming University, Yunnan Kunming 650214, China; 2.Engineering Research Center for Characteristics Agriculture of Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 3.Key Laboratory of Special Biological Resource Development and Utilization of Universities in Yunnan Province, Yunnan Kunming 650214, China; 4.Kunming Academy of Agriculture Science, Yunnan Kunming 650034, China)

【Objective】This study aimed to find the effective research methods for exploring and utilizing valuable AMF resources.【Method】The roots of loquat were collected randomly as experimental samples from Kunming University. The 18S rRNA partial gene clone library was established by connected DNA which used the CTAB method and amplified toEscherichiacoliJM109. 30 positive clones that were selected randomly from 35 white clones in the library were sequenced. The Mothur software analyzed the sequence of positive clones, and got 9 different AMF sequences.【Result】The Coverage C of the clone library was 93.3 %. The Shannon-Wiener was 2.079, and the Simpson index was 0.87 in the clone library, the curve was saturated. The 9 sequences were divided into two distinct groups representing different AMF species;Glomuswas the main AMF groups of loquat root. OUT1 and OTU2 represented the main types of the library, here OTU1 wasRhizophagusirregularis. OTU3, OTU4, OTU5 and OTU6 represented the common types of the library; the rest sequences were rare AMF types.【Conclusion】Glomusis the main type of AMF in the roots of loquat, in whichRhizophagusirregularisis the dominant AMF species.

Loquat; AMF; Clone library; 18S rRNA gene; Phylogenetic analysis

1001-4829(2017)5-1009-07

10.16213/j.cnki.scjas.2017.5.005

2016-09-29

云南省都市特色農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心項(xiàng)目(TSNY0201)；云南省教育廳科學(xué)研究基金項(xiàng)目(2014Y390)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究青年項(xiàng)目(2013FD040)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究自籌項(xiàng)目(2013FZ099)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)項(xiàng)目(YJL14005)；昆明學(xué)院人才引進(jìn)基金項(xiàng)目(YJL12010)；昆明學(xué)院校立重點(diǎn)基金項(xiàng)目(XJL12020)；昆明學(xué)院大學(xué)生科研項(xiàng)目(XJD16081)；云南中煙品牌省內(nèi)原料產(chǎn)地生態(tài)與主栽品種合理布局研究項(xiàng)目；云南省高校優(yōu)勢(shì)特色重點(diǎn)學(xué)科(生態(tài)學(xué))建設(shè)項(xiàng)目資助(05000511311)；昆明市農(nóng)業(yè)局滇池流域農(nóng)業(yè)面源污染綜合防控對(duì)策研究(2016JC01)；云南省高校特色生物資源開(kāi)發(fā)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放基金項(xiàng)目(GXKJ201623)

尹利方(1981-)，女，云南昆明人，碩士，講師，主要從事都市農(nóng)業(yè)的教學(xué)科研工作，E-mail: 563454379@qq.com；*為共同第一作者，E-mail: 10067994@qq.com，**為通訊作者，E-mail: xiatiyuan@sohu.com。

S667.3

A

(責(zé)任編輯 王家銀)