鄒德堂，趙廣欣，孫 健

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

水稻淀粉合成候選基因OsAGPL3與淀粉相關性狀的關聯(lián)分析

鄒德堂，趙廣欣，孫 健

（東北農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，哈爾濱 150030）

以不同地理來源77份水稻品種組成關聯(lián)作圖群體，對水稻淀粉合成相關候選基因OsAGPL3作序列變異分析，在考慮群體結構影響基礎上，利用連鎖不平衡結構分析和關聯(lián)分析揭示該基因與淀粉相關性狀關系，發(fā)掘與直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、膠稠度和糊化溫度相關優(yōu)異等位變異。OsAGPL3基因多態(tài)性分析表明，在編碼區(qū)和非編碼區(qū)內(nèi)共發(fā)現(xiàn)200個SNP和44個Indel，LD衰減距離為1 260 bp（R2=0.1），11個多態(tài)性位點與淀粉相關性狀存在顯著關聯(lián)，其中5個位點可引起氨基酸改變，試驗群體可分為12種單體型。

水稻；淀粉；OsAGPL3基因;關聯(lián)分析

水稻是重要糧食作物，其品質性狀成為研究重點[1-2]。蒸煮食味是評價稻米品質主要指標之一。淀粉作為重要營養(yǎng)成分，其組成和結構是影響蒸煮食味主要因素，決定稻米品質[3-5]。

淀粉合成是復雜過程，與稻米淀粉合成相關酶主要有5大類，包括ADP葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）、淀粉分支酶（SBE）、顆粒結合淀粉合成酶（GBSS）、可溶性淀粉合成酶（SSS）和脫分支酶（DBE），各類酶存在相應同工型，由20個基因編碼，在合成不同階段每個基因作用不同[6-11]。其中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶（簡稱AGP酶），是水稻中催化淀粉合成第一階段關鍵酶，對蒸煮食味起決定作用[12]。Bao等研究表明，水稻AGP基因家族主要由四個大亞基（OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4）和兩個小亞基（OsAGPS1和OsAGPS2）組成[12]，對比序列，發(fā)現(xiàn)其同源性較高，但在AGpase中功能不同：大亞基是酶調(diào)節(jié)中心，小亞基是酶活性中心[13]。姜麗娜等證明AGP基因表達促進淀粉積累[14]；Lee等證實OsAGPL2、OsAGPS2在胚乳中特異性表達[15]；Huang等發(fā)現(xiàn)OsAGPL4可能是源組織和庫組織中次要亞基[16-17]。

單核苷酸多態(tài)性（SNP）是基因組序列中單個堿基對變化或小片段插入缺失引起的多態(tài)性。存在于基因組各個區(qū)域，根據(jù)位置可分為基因編碼區(qū)SNP和非編碼區(qū)SNP兩類，基因編碼區(qū)變異可能導致編碼氨基酸發(fā)生變化，引起蛋白質序列改變，造成蛋白質功能差異。例如，位于Wx基因第4外顯子處A762突變?yōu)镚762，天冬氨酸變?yōu)楦拾彼?；位于?外顯子中A1132突變?yōu)镃1132，酪氨酸變?yōu)榻z氨酸[18-20]。

關聯(lián)分析技術應用自然種質群體，將目標性狀表型值同基因多樣性結合，挖掘具有特定功能等位基因位點[21]。較傳統(tǒng)連鎖分析，具有更高分辨率、挖掘并分析更多優(yōu)勢等位基因和無需構建專門作圖群體優(yōu)勢[22-24]。Thornsberry等發(fā)現(xiàn)與玉米開花期相關的5個SNP和4個Indel，首次在植物中應用關聯(lián)分析技術[25]。

Huang等從水稻全長cDNA文庫中鑒定6個克隆，編碼腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶6個亞基，分別是OsAGPS1、OsAGPS2、OsAGPL1、OsAGPL2、OsAGPL3和OsAGPL4，其中OsAGPL3基因在種子發(fā)育階段表達并直接影響淀粉累積[16]。OsAGPL3基因位于水稻第5條染色體上，基因全長5 484 bp，具有399 bp的5'非翻譯區(qū)（5'UTR），含有13個內(nèi)含子和14個外顯子，還有441bp 3'UTR。因此，本研究將OsAGPL3作為目標基因，通過對77份不同地理來源水稻自然群體OsAGPL3基因深度測序，將群體結構作為協(xié)變量，測量與淀粉相關主要性狀（直鏈淀粉含量、支鏈淀粉含量、糊化溫度和膠稠度），與目標基因作候選基因關聯(lián)分析，挖掘OsAGPL3基因中與淀粉相關理化特性關聯(lián)SNP及Indel突變，為改良水稻品質提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以77份具有廣泛地理分布的粳稻品種作為本試驗材料（見表1），由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所、黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院、遼寧省農(nóng)業(yè)科學院和東北農(nóng)業(yè)大學水稻研究所提供。2016年在東北農(nóng)業(yè)大學阿城實驗實習基地開展田間試驗，4月16日播種，5月20日插秧，雙行區(qū)，行長2米，行距30厘米，穴距10厘米，3次重復，水肥病蟲害管理同一般大田管理。

1.2 DNA提取和PCR產(chǎn)物測序

采用CTAB法[26]提取DNA，以NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）中OsAGPL3參考基因組為模板，使用Primer Premier5.0軟件分四段設計引物。

以供試材料全基因組DNA為模板，采用康為世紀公司2×Taq MasterMix作PCR擴增，反應體系為50 μL，其中包含2 μL（40 ng·μL-1）DNA、5 μL上游引物（10 μmol· L-1）、5 μL下游引物（10 μmol·L-1）和25 μL 2×Taq MasterMix（Taq DNA酶、PCR Buffer、Mg+、dNTPs和13 μLddH2O）。反應程序為：94℃預變性5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 90 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min；4℃保存。直接測序經(jīng)過回收純化的PCR片段，每個試樣重復3次。

1.3 淀粉相關理化特性測定

1.3.1 淀粉含量測量

雙波長法測定直鏈淀粉含量與支鏈淀粉含量[27]，繪制標準曲線，將樣品放入烘干箱至恒重。粉碎過60目篩，乙醚脫脂，稱取脫脂樣品約0.1 g，加0.5 mol·L-1KOH溶液10 mL，35℃水浴中振蕩15 min，蒸餾水定容至50 mL后靜置。從中取出2.5 mL作為樣品測定液，2.5 mL作為樣品空白液，均加入25 mL蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至3.5，加碘試劑0.5 mL于樣品測定液中，均定容至50 mL混勻，靜置20 min后，以空白液為對照，用2 cm比色杯，分別在波長620、430、550、730 nm下測定光密度值為Eλ1、Eλ2、Eλ3、Eλ4，通過計算：ΔE直=Eλ2-Eλ1，ΔE支=Eλ4-Eλ3分別代入直鏈淀粉標準曲線和支鏈淀粉標準曲線，測定兩種淀粉含量。

表1 77份材料名稱與來源Table 1 Name and source of the 77 accessions

表2 基于OsAGPL3基因序列引物設計Table2 Primer design based on OsAGPL3 gene sequence

1.3.2 膠稠度測量

取過0.15 mm孔徑篩后精米粉0.10 g放入試管內(nèi)，加入0.20 mL百里酚藍指示劑，振蕩至完全分散。再加入2.0 mL 0.20 mol·L-1氫氧化鉀溶液，再次振蕩。用玻璃球蓋住試管口，放入水浴鍋內(nèi)，米膠高度約在試管長度2/3處，8 min后取出試管，常溫下冷卻5 min。再放入冷水中20 min。常溫下，將試管平放在操作臺上。1 h后測量冷膠前沿至試管底長度即為樣品膠稠度（mm）[28]。

1.3.3 糊化溫度測量

在每個方盒內(nèi)放入6粒成熟飽滿精米，分別加入10.0 mL 1.70%氫氧化鉀溶液，米粒分布均勻后加蓋。放入30±2℃的恒溫箱內(nèi)約23 h，取出后逐粒觀察米粒分解情況，作分級記錄，標準見表2[28-29]。

表2 稻米堿消值評價標準[27]Table 2 Evaluate standard for rice alkalidigestion value

1.4 群體結構分析

根據(jù)www.gramene.com網(wǎng)站微衛(wèi)星數(shù)據(jù)庫，選取1 000對SSR標記，由上海生工生物工程有限公司合成，隨機選取20個材料作引物篩選，共選出154對均勻分布于水稻12條染色體并且多態(tài)性好、分辨性強引物。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染法檢測，拍照記錄[30]。等位基因根據(jù)帶型依次賦值1～9，運用Structure 2.3.4軟件[31]，采用混合模型分析。burn-in循環(huán)10 000次，MC重復100 000次，K值設為1～10，每個值計算5個重復，得出lnP（D）值和△K值，計算Q矩陣，每份材料以Q≥0.65為閾值將其劃入相應亞群。

1.5 多態(tài)性檢測

使用 Clustal X[32]軟件序列比對OsAGPL3基因，獲得PHYLIP格式文件。用 DNAsp 5.0[33]軟件計算Tajima's D值，TASSEL[34]軟件作單核苷酸多態(tài)性分析和連鎖不平衡（LD）分析。

1.6 關聯(lián)分析

基于OsAGPL3序列對目標群體作關聯(lián)分析，選取TASSEL軟件一般線性模型，以每個個體Q值作為協(xié)變量作回歸分析，當顯著水平（P＜0.05）時，認為該位點與目標性狀顯著關聯(lián)。

2 結果與分析

2.1 群體結構分析

分析77個品種群體結構，用STRUCTURE軟件分析最佳K值，K=3時,符合似然值最大。如圖1所示，按照K=3將該群體分為3個亞群，第1個亞群含有44個品種，第2個亞群含有16個品種，第3個亞群有17個品種。

2.2OsAGPL3基因多態(tài)性

OsAGPL3基因多態(tài)性分布見表3。

圖1 77份材料在3個亞群中分布Fig.1 Model-based cluster membership for 77 in three groups

表3 OsAGPL3基因序列多態(tài)性分布Table 3 Polymorphism of OsAGPL3 sequences

表3中，77個品種OsAGPL3基因在5 484 bp范圍測序，除去5'UTR和3'UTR區(qū)域，其余4 644 bp內(nèi)共發(fā)現(xiàn)200個SNP和44個Indel，平均每23 bp有1個SNP，每106 bp有1個Indel，SNP發(fā)生頻率明顯高于Indel。在編碼區(qū)1 560 bp中，全部均為SNP，共17個，其頻率為10.9 SNP·kb-1；在非編碼區(qū)3 084 bp中，SNP加上Indel共227個，其頻率為73.61 SNP·kb-1。本研究中SNP和Indel主要發(fā)生在內(nèi)含子區(qū)域。在測到的SNP中，編碼區(qū)共有7個轉換、10個顛換，轉換與顛換比例為0.7，17個多態(tài)性位點中，多態(tài)性位點為非同義突變有14個，多態(tài)性位點為同義突變僅3個。

統(tǒng)計基因序列多樣性以核苷酸多樣性π值和核苷酸多態(tài)性θ值為指標。其中，衡量群體突變率參數(shù)為θ值，而衡量同一位點不同序列之間差異為π值。由于π和θ變化趨勢一致，主要分析π值變化。在前2 488 bp范圍內(nèi)存在較高多樣性，π值先從0.0179升至0.0216，再大幅降至0.0117，然后穩(wěn)點升至0.0136與0.0175；在隨后627 bp內(nèi)π值大幅降至0.0038，再迅速升至0.0155，然后上升至0.0208后再大幅降至0.0032，形成明顯拐點；而π值在其后1 448 bp內(nèi)波動較大，呈現(xiàn)波浪式變化趨勢，出現(xiàn)多拐點，直到最后734 bp趨近穩(wěn)點，總體π值在0.0223～0.0032，且編碼區(qū)核苷酸多態(tài)性比非編碼區(qū)低。整個OsAGPL3基因Tajima'D值為-2.73854，P＜0.001，達到顯著水平。

2.3OsAGPL3基因連鎖不平衡結構分析

對OsAGPL3基因序列多態(tài)性作位點間連鎖不平衡結構分析（見圖2），用不同顏色表示每對多態(tài)性位點之間r2值及Fisher精確檢驗P值（顯著性），連鎖不平衡現(xiàn)象越明顯顏色更偏向紅色，圖左下角為P值，右上角為r2。由圖可知，整個區(qū)域分散分布較弱LD結構，當中明顯的（r2＞1.0）有2個，分別是3715～3721和3715～3722。

圖2 OsAGPL3基因多態(tài)性位點間連鎖不平衡(*表示顯著性位點)Fig.2 Linkage disequilibrium between pairs of OsAGPL3 sequence polymorphic loci(*significant loci)

檢測OsAGPL3基因LD衰退程度，以r2為衡量指標，以1 260 bp為分界線，1 260 bp后迅速 衰退。

2.4OsAGPL3基因與表型性狀關聯(lián)分析

將4個表型性狀與OsAGPL3基因序列多態(tài)性位點關聯(lián)分析表明（見表4），共有11個位點與表型性狀發(fā)生關聯(lián)，其中內(nèi)含子有5個位點形成關聯(lián)，3744（A/C）、4306（G/A）2個位點與GC關聯(lián)，4271（C/T）、4297（T/C）2個位點與APC關聯(lián)和4288（C/A）1個位點與AC關聯(lián)；外顯子有6個位點形成關聯(lián)，3829（C/G）、4316（A/G）兩個位點與GC關聯(lián)、4318（T/G）1個位點與APC關聯(lián)，2647（G/T）、2664（T/C）、3663（A/C）3個位點與AC關聯(lián)。

根據(jù)淀粉相關性狀與多態(tài)性位點間關聯(lián)性分析及各位點貢獻率，選取與性狀顯著關聯(lián)（P＜0.05）位點（位點2647、2664、3663、3744、3829、4271、4288、4297、4306、4316、4318）將群體分為12種單體型（見表5）。

表4 多態(tài)性位點Table 4 Polymorphic loci

表5 OsAGPL3基因單體型Table 5 Haplotypes of OsAGPL3 gene

3 討論與結論

蒸煮食味品質受外界環(huán)境影響及基因調(diào)控[35]。淀粉合成相關基因變化影響水稻蒸煮食味品質?；蚬δ芨淖兓騿适б话阋蚰硞€或幾個位點突變引起。Umemoto等發(fā)現(xiàn)OsSSⅡa基因中5個變異功能性位點，其中一個SNP導致氨基酸編碼變化，靠近C末端兩個SNP導致氨基酸改變，可能是引起酶活性改變關鍵因素[36]。相對于本試驗中與OsAGPL3基因相關聯(lián)中11個SNP，其中5個SNP引起氨基酸改變，可能是造成淀粉含量差異原因。因此，候選基因關聯(lián)分析處理基因多態(tài)性可為水稻分子標記輔助育種提供有價值信息，李釗等應用關聯(lián)分析挖掘發(fā)現(xiàn)33個SNP和9個Indel與胚性愈傷組織形成能力顯著相關[37]；楊澤峰等發(fā)現(xiàn)玉米ZmSSⅡa基因編碼區(qū)具有24個SNP，將該基因劃分成9種編碼區(qū)單倍型，編碼7種ZmSSⅡa蛋白質[38]；Hao等在大豆基因IFS1中發(fā)現(xiàn)與SMV SC-7抗性顯著相關SNP 2個，其中1 902 bp位點出現(xiàn)在抗葉病材料中，說明IFS1基因1 902 bp“C/T”變異是與SC-7抗病性顯著相關功能性位點，可開發(fā)成分子標記[39]。

Yan等認為豐富遺傳多樣性可促進作物改良[40]。本研究結果表明，OsAGPL3基因具有較高核苷酸多樣性水平，基因序列中共發(fā)現(xiàn)244個多態(tài)位點，其中包含200個SNP和44個Indel。平均每23.22 bp出現(xiàn)1個SNP，平均每105.55出現(xiàn)1個Indel，高于Umemoto等研究結果[36,41-42]，可能與所選材料具有相對廣泛地理來源有關。與Mishra等研究結果一致，多數(shù)SNP存在于內(nèi)含子，雖然未產(chǎn)生氨基酸序列變化，但內(nèi)含子中SNP會引起編碼蛋白質結構變化，適應不同氣候環(huán)境并滿足各種育種要求[42-44]。利用OsAGPL3序列中SNP位點作 Tajima'D測驗，其Tajima'D值為-2.73854，達到極顯著水平，表明OsAGPL3基因可能受負選擇作用而保持較低比率突變，或有利等位基因受到強烈正向選擇，由于搭載效應產(chǎn)生較多低頻突變，Tajima'D值為負值。

本研究中OsAGPL3基因連鎖不平衡，在1 260 bp附近衰退到R2=0.1水平，與Remington等研究玉米LD衰退距離1.5 kb結果一致[45]。在分析序列11個SNP位點中，位點2664堿基變異為T/C，編碼氨基酸無變化，屬于同義突變；位點2647、3663、3829、4316和4318堿基均導致氨基酸變化，堿基變化分別為G/T、A/C、C/G、A/G、和G/T，相應氨基酸變化為Glu/Asp、Asp/Ala、Ser/Cys、Lys/Glu和 Lys/Asn，其中2647和2663可能是導致直鏈淀粉含量變化關鍵位點，4318可能是導致支鏈淀粉含量變化關鍵位點，3829和4316可能是導致膠稠度變化關鍵位點。非同義突變可引起氨基酸變化，影響蛋白質功能，但同義突變無法改變氨基酸，幾乎不影響基因功能，發(fā)生氨基酸變異幾個多態(tài)性位點是基因功能改變主因，但該調(diào)控是否通過改變蛋白質結構改變其功能，需進一步研究。推測僅基于核酸序列變化，OsAGPL3基因在其他過程中是否受其他因素調(diào)控，產(chǎn)生蛋白在一級乃至高級結構上是否有差異，尚需進一步驗證。

OsAGPL3基因比對全長4 644 bp區(qū)間內(nèi)共發(fā)現(xiàn)200個SNP和44個Indel，在整個序列內(nèi)LD水平較低，有兩對明顯連鎖不平衡位點，分別是3715～3721和3715～3722，并且在1 260 bp處R2=0.1水平。OsAGPL3基因中有4個多態(tài)性位點與直鏈淀粉含量相關聯(lián)；有3個多態(tài)性位點與支鏈淀粉含量相關聯(lián)；有2個多態(tài)性位點與膠稠度相關聯(lián)。

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Association analysis on candidate gene OsAGPL3 involved in synthesis of rice starch and starch related traits/

ZOU Detang,ZHAO Guangxin,SUN Jian
（School of Agriculture,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Association mapping population of 77 rice cultivars from different geographical sources was used.Gene sequence variation of candidate gene OsAGPL3 related to rice starch synthesis was analyzed.Based on the influence of population structure,the linkage disequilibrium analysis and association analysis revealed the relationship between OsAGPL3 gene and starch-related traits,and revealed related excellent allelic variation associated with amylose content,amylopectin content,gel consistency and gelatinization temperature.The polymorphism analysis of OsAGP L3 gene showed that there were 200 SNPs and 44 Indels in the coding and non-coding regions,and LD attenuation distance was 1 260 bp(R2=0.1).There were significant relationship between 11 polymorphic and starch-related traits,among which five loci caused a change in amino acids,and the population was divided into 12 haplotypes.

rice；starch；OsAGPL3 gene;association analysis

S331

A

1005-9369（2017）09-0001-10

時間 2017-10-19 17：14：29 [URL]http：//kns.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20171019.1714.008.

鄒德堂,趙廣欣,孫健.水稻淀粉合成候選基因OsAGPL3與淀粉相關性狀的關聯(lián)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2017,48(9)：1-10.Zou Detang,Zhao Guangxin,Sun Jian.Association analysis on candidate gene OsAGPL3 involved in synthesis of rice starch and starch related traits[J].Journal of Northeast Agricultural University,2017,48(9)：1-10.(in Chinese with English abstract)

2017-07-03

黑龍江省重大科技招標項目（GA14B102-02）

鄒德堂（1965-），男，教授，博士，博士生導師，研究方向為水稻遺傳育種。E-mall：zoudt@163.com