王靜竹 楊瑞，2 劉欣

1 國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

2 北京體育大學(xué)（北京100084）

興奮劑19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮的檢測(cè)研究

王靜竹1楊瑞1，2劉欣1

1 國(guó)家體育總局反興奮劑中心（北京100029）

2 北京體育大學(xué)（北京100084）

目的：19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本膽烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是競(jìng)技體育中禁用的內(nèi)源性類(lèi)固醇興奮劑，可由諾龍代謝而來(lái)。本研究的目的是采用同位素比質(zhì)譜方法對(duì)尿中19NA和19NE進(jìn)行檢測(cè)規(guī)律研究。方法：征集2名男性志愿者?？诜?0 mg諾龍，并于服藥前后收集尿樣。對(duì)尿樣中19NA和19NE的濃度及同位素比進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：服藥后尿樣中19NA和19NE的濃度迅速上升，其同位素比降低至接近受試品的同位素比值。結(jié)論：攝入諾龍不影響尿中孕烷二醇、雄酮、本膽烷醇酮的同位素比值。尿樣在服藥后27小時(shí)內(nèi)提示尿樣為陽(yáng)性。

19-去甲雄酮；19-去甲本膽烷醇酮；同位素比質(zhì)譜；興奮劑檢測(cè)

19-去甲雄酮（19-Norandrosterone，19NA）和19-去甲本膽烷醇酮（19-Noretiocholanolone，19NE）是諾龍（19-去甲睪酮）、19-去甲雄烯二酮、19-去甲雄烯二醇在人體內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物。它們都屬于19位去甲基的類(lèi)固醇激素，可以促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成，運(yùn)動(dòng)員服用可減少脂肪貯存，增加瘦體重。19NA和19NE是世界反興奮劑機(jī)構(gòu)（World Anti-Doping Agency，簡(jiǎn)稱(chēng)WADA）禁用的興奮劑[1]，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。

圖1 19-去甲雄酮和19-去甲本膽烷醇酮的化學(xué)結(jié)構(gòu)

在20世紀(jì)80年代前，19位去甲基的類(lèi)固醇激素被認(rèn)為都是外源合成的，即體內(nèi)不能產(chǎn)生此種物質(zhì)。在此后的有關(guān)研究中，首先在馬和豬等動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性的諾龍，隨后的研究表明，諾龍和其它19去甲基類(lèi)固醇激素可以由人體自身合成和代謝的[2]。此類(lèi)物質(zhì)屬于內(nèi)源性類(lèi)固醇興奮劑。由于19NA和19NE在人體內(nèi)可以自身合成，按照WADA的要求，對(duì)于它們的檢測(cè)需采用氣相色譜/燃燒爐/同位素比質(zhì)譜（isotope ratio mass spectrometry，IRMS）的方法來(lái)判斷其來(lái)源。檢測(cè)時(shí)，測(cè)定尿樣中19NA和19NE的碳同位素比值（即δ值，單位為‰），以及內(nèi)源性參照物的碳同位素比值，計(jì)算兩者之間的差值，即△δ值，當(dāng)該值大于3時(shí)，即表示19NA和19NE是外源性的，樣本被判定為興奮劑陽(yáng)性[3]。在檢測(cè)19NA和19NE時(shí)，內(nèi)源性參照物可選擇孕烷二醇（5β-Pregnane-3ɑ，20ɑ-diol，PD）、雄酮（An）、11-羥基雄酮等。

對(duì)19NA和19NE的檢測(cè)研究主要集中在定量和來(lái)源鑒別方面。Bagchus等人研究了三種劑量的癸酸諾龍?jiān)谘杭澳蛞褐兴幬锎x動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，確定了可以檢測(cè)到19NA和19NE的時(shí)間窗口期[4]。Tseng等人對(duì)服用了營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)劑后的尿樣中19NA和19NE進(jìn)行了定性和定量分析研究[5]。在Baume等人的研究中，志愿者口服25 mg同位素標(biāo)記諾龍，通過(guò)對(duì)尿樣中19NA和19NE的定性和定量分析，探討了諾龍?jiān)诖x過(guò)程中的個(gè)體差異[6]。另外，有研究介紹了同位素比方法檢測(cè)尿樣中19NA來(lái)源的實(shí)驗(yàn)方法[7，8]，并討論了內(nèi)源性19NA的來(lái)源。

由于飲食、地域、環(huán)境、人種等因素對(duì)同位素比值有影響，IRMS檢測(cè)方法的建立應(yīng)該對(duì)這些因素加以考察。應(yīng)用IRMS方法對(duì)中國(guó)地域內(nèi)的中國(guó)人口服諾龍的檢測(cè)研究以及尿中19NA和19NE的檢測(cè)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究針對(duì)口服諾龍后中國(guó)人的尿樣中19NA和19NE興奮劑進(jìn)行同位素比檢測(cè)研究。諾龍?jiān)隗w內(nèi)可被代謝為19NA和19NE，因此可采用口服諾龍后收集尿樣的方法得到具有19NA和19NE代謝信息的樣本。諾龍、19NA、19NE這三者均為興奮劑，因19NA和19NE是諾龍的代謝產(chǎn)物，檢測(cè)19NA和19NE即是檢測(cè)諾龍。如果它們?cè)谀驑又泻扛撸^(guò)WADA設(shè)定的相關(guān)界限，樣品為陽(yáng)性，不需要采用同位素比質(zhì)譜方法鑒別內(nèi)源性與外源性。如果代謝物19NA和19NE在尿樣中濃度低，則需要排除內(nèi)源性的可能，此時(shí)采用IRMS方法鑒別來(lái)源。本研究的目的是采用IRMS方法檢測(cè)口服興奮劑諾龍及檢測(cè)19NA和19NE。尿中19NA和19NE有外源性來(lái)源時(shí)，樣本中An和本膽烷醇酮（Etiocholanolone，Etio）是否受到影響也在本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行驗(yàn)證。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器與設(shè)備

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）：HP6890/5973，Agilent Technologies；超純水制備儀：Milli-Q，MILLIPORE公司；高效液相色譜儀（HPLC）：Waters 2796，Waters公司；氣相色譜/燃燒爐/同位素比質(zhì)譜儀（GC/C/IRMS）：DELTA PLUS，Thermo Scientific公 司。

1.2 試劑、對(duì)照品

β-葡萄糖醛酸甙酶：b-Glucuronidase from E.coli IX-A型，Sigma，美國(guó)；叔丁基甲醚[（CH3）3COCH3]：TEDIA COMPANY.INC，美國(guó)；N-甲基-N-三甲基硅基三氟乙酰胺（N-methyl-N-trimethylsilyltri-fluoroacetamide，MSTFA）：Sigma，美國(guó)；三甲基碘硅烷（Trimethylsilyliodide，TMSI）：Sigma，美國(guó)；二硫代赤蘚糖醇（ Dithioerythritol）：Aldrich，美國(guó)。其它試劑為分析純，由北京化工廠(chǎng)等提供。

19NA、19NE、An、Etio、PD、甲基睪酮（17a-Methyltestosterone，MT）、諾龍等對(duì)照品購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。受試品為裝入膠囊的20 mg諾龍對(duì)照品。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 試劑的制備

β-葡萄糖醛酸苷酶溶液：取β-葡萄糖醛酸苷酶適量，溶解于磷酸鹽緩沖液中，配制成50000 unit/mL溶液，置4℃冰箱中保存，備用。

磷酸鹽緩沖液：在0.2 M磷酸二氫鉀水溶液中，加入0.2 M磷酸氫二鉀水溶液，用pH計(jì)檢測(cè)pH值，pH=6.9。

2.2 儀器操作條件

2.2.1 GC/MS色譜條件

色譜柱：HP-1毛細(xì)管色譜柱（17 m×0.2 mm i.d.×0.11 μm）；進(jìn)樣口溫度：280℃；接口溫度：300℃；采用恒壓模式，柱壓：87 kPa；分流比10∶1；進(jìn)樣1 mL；柱升溫程序?yàn)椋?80℃-3.3℃ /min→231℃-30℃/min→310℃（2min）。

2.2.2 HPLC色譜條件

色譜柱為ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，于35分鐘內(nèi)，流動(dòng)相由30%乙腈增加至100%乙腈。流速1 mL/min，柱溫27℃。

2.2.3 GC/C/IRMS色譜條件

色譜柱：HP-5毛細(xì)管色譜柱（25 m×0.25 mm i.d.×0.33 μm）；進(jìn)樣口溫度：260℃；采用恒流模式，柱流速為1 mL/min，不分流進(jìn)樣；柱溫采用程序升溫：180℃（2min）-6℃/min→255℃-3℃/min→285℃（5min）。

氧化爐溫度為960℃；還原爐溫度為600℃。

2.3 受試品同位素比值檢測(cè)

采用IRMS測(cè)定諾龍受試品同位素比值。

2.4 尿樣中19NA和19NE濃度測(cè)定

精密吸取2mL尿樣，加入MT內(nèi)標(biāo)溶液，再加入1 mL磷酸鹽緩沖液和50 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混勻，在55℃恒溫水浴中酶解3 hr，取出。加入4 mL叔丁基甲醚振蕩萃取。離心，吸取上層有機(jī)溶液，在55℃加熱下用氮?dú)獯蹈?，加?0 mL衍生化試劑（MSTFA/TMSI/Dithioerythritol 1000∶3∶1），溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入樣品瓶中，封蓋，70℃反應(yīng)30min。備用。

依據(jù)峰面積以?xún)?nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量分析，并按照下列公式進(jìn)行濃度的比重校正。

2.5 樣品同位素比測(cè)定

取6 mL尿樣，加入1 mL磷酸鹽緩沖液和100 mL β-葡萄糖醛酸甙酶溶液，混勻，在55℃恒溫水浴中酶解3 hr，取出。加入8 mL叔丁基甲醚振蕩萃取。離心，吸取上層有機(jī)溶液，在55℃加熱下用氮?dú)獯蹈桑尤?0 mL甲醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)入樣品瓶中，封蓋，備用。依HPLC條件，及對(duì)照品的保留時(shí)間，分離并收集相關(guān)組分，并于55℃氮?dú)饬鞔蹈?。依?jù)GC/C/IRMS條件測(cè)定待測(cè)物的同位素比值。

2.6 體內(nèi)代謝研究

2.6.1 受試及尿樣采集

征集2名健康男性志愿者（N1、N2）參加受試，年齡為22～25歲。志愿者受試通過(guò)倫理審查，并簽署知情同意書(shū)。受試者在受試前的尿樣為空白尿樣（0 h）。受試者單次口服受試品1粒。在服藥后收集11份尿樣。尿樣采集安排如下：受試后當(dāng)天（第1天）留尿6份，間隔約2～3小時(shí)；第2天留尿3份，間隔約5～10小時(shí)；第3天留晨尿2份。

2.6.2 樣品處理及數(shù)據(jù)分析

將采集的尿樣依照上述樣品制備方法進(jìn)行處理，對(duì)尿中19NA和19NE、PD進(jìn)行含量測(cè)定并進(jìn)行19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值的測(cè)定，繪制尿排曲線(xiàn)。

3 結(jié)果與討論

3.1 受試品諾龍同位素比值及檢測(cè)方法的驗(yàn)證

諾龍同位素比值（‰）為-30.92 ±0.41（n=6）。

實(shí)驗(yàn)所用方法已通過(guò)方法驗(yàn)證。19NA和19NE日內(nèi)精密度（‰，n=6）分別為-31.50±0.29和-30.52±0.26；日間精密度（‰，n=6）分別為-31.64 ±0.29和-30.52 ±0.09；重復(fù)性（‰，n=6）分別為-31.11 ±0.18和-31.22 ±0.22；19NA線(xiàn)性（300～5000 mv）RSD為1.60%；19NE線(xiàn)性（300～4000 mv）RSD為1.21%。

3.2 19NA和19NE濃度隨時(shí)間變化規(guī)律

繪制2名受試者19NA和19NE濃度尿排曲線(xiàn)（見(jiàn)圖2）。

圖2 受試者尿樣中19NA和19NE濃度尿排曲線(xiàn)

受試者服用諾龍之后，尿樣中19NA和19NE濃度迅速升高。約在2小時(shí)到達(dá)最大值，之后濃度下降。此二受試者尿中19NA濃度大于19NE。 10小時(shí)后，濃度降至很低水平。此后，濃度在27小時(shí)略有升高，之后，再次降低。

3.3 19NA、19NE、An、Etio、PD同位素比值隨時(shí)間變化規(guī)律

繪制2名受試者19NA、19NE、An、Etio、PD的同位素比值尿排曲線(xiàn)（見(jiàn)圖3）。

受試者服藥后2～13小時(shí)內(nèi)及27小時(shí)尿中19NA和19NE的濃度高于檢測(cè)限（2 ng/mL），對(duì)樣品進(jìn)行了同位素比檢測(cè)，同位素比值以δ值表示，單位為‰。測(cè)定結(jié)果表明，服藥后尿樣中19NA和19NE的δ值保持在約-30‰，與受試品的δ值-30.92‰接近。PD作為內(nèi)源性參照物，其δ值未發(fā)生變化。An和Etio的δ值未發(fā)生變化。19NA和19NE的δ值與PD的δ值的差值均大于WADA的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)3‰，其與An的δ值的差值均大于3‰。An和Etio的δ值不因攝入諾龍而受影響。尿樣在服藥后10小時(shí)內(nèi)及27小時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性。

3.4 內(nèi)源性諾龍及19NA、19NE的來(lái)源

相關(guān)研究表明內(nèi)源性諾龍是體內(nèi)雄性激素在芳香酶的作用下向雌性激素轉(zhuǎn)化時(shí)產(chǎn)生的[9]。諾龍可在婦女胎盤(pán)中檢測(cè)到，同時(shí)在尿樣也中檢測(cè)到19NA的存在[10]。攝入動(dòng)物臟器，可導(dǎo)致尿樣中的19NA升高。使用炔諾酮類(lèi)的藥物，也會(huì)產(chǎn)生19NA。另有研究表明，19NA和19NE也來(lái)自An和Etio[11]。尿樣中存在著19位去甲基的反應(yīng)，19-去甲類(lèi)固醇激素代謝物可在樣品前處理過(guò)程中，由An和Etio代謝形成[12]。

圖3 受試者尿樣中19NA和19NE同位素比值尿排曲線(xiàn)

3.5 本研究在常規(guī)檢測(cè)中的意義

本研究已應(yīng)用于實(shí)際檢測(cè)工作，填補(bǔ)了我國(guó)在此方面檢測(cè)方法的空白。本研究一方面對(duì)所建立的相關(guān)檢測(cè)方法進(jìn)行了應(yīng)用驗(yàn)證，另一方面了解了以19NA和19NE為被檢測(cè)物質(zhì)的諾龍的檢測(cè)規(guī)律。因此，本研究對(duì)于實(shí)際檢測(cè)工作具有重要意義。

4 結(jié)論

口服諾龍20 mg使尿中的19NA和19NE濃度在2小時(shí)內(nèi)迅速升高，δ值與受試品的δ值接近。尿中PD、An、Etio的δ值未發(fā)生變化。尿樣在服藥后10小時(shí)內(nèi)及27小時(shí)檢測(cè)為陽(yáng)性。

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Study for the Doping Control of 19-Norandrosterone and 19-Noretiocholanolone with Isotope Ratio Mass Spectrometry

Wang Jingzhu1，Yang Rui1，2，Liu Xin1
1 National Anti-Doping Laboratory，China Anti-Doping Agency，Beijing 100029，China
2 Beijing Sports University，Beijing 100084，China

Wang Jingzhu，Email：wangjingzhu@chinada.cn

ObjectiveThe 19-Norandrosterone（19NA）and 19-Noretiocholanolone（19NE）are endogenous steroids abused as dope.The aim of this study was to investigate the detection of 19NA and 19NE using isotope ratio mass spectrometry.MethodsTwo male volunteers were recruited.Each volunteer was orally administered a single dose of 20 mg of nandrolone，and their urine samples were collected after administration.The analyses of urinary concentrations and isotope ratios of 19NA and 19NE were performed.ResultsConcentrations of 19NA and 19NE increased rapidly after administration，and their isotope ratios decreased to the value of the drug ingested.ConclusionThe intake of nandrolone has no effect on the isotope ratios of pregnanediol，androsterone and etiocholanolone.The urine samples were positive within 27 hours after administration.

19-norandrosterone，19-noretiocholanolone，IRMS，doping test

2017.03.25

國(guó)家體育總局重點(diǎn)研究領(lǐng)域攻關(guān)課題（2013B003）

王靜竹,Email：wangjingzhu@chinada.cn