邰苗苗，吳小葉，杜海燕，孟繁榮，張春香，任有蛇

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.朔州市平魯區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西平魯036800）

山羊附睪頭細胞轉(zhuǎn)染中新霉素和嘌呤霉素的濃度篩選

邰苗苗1，吳小葉2，杜海燕1，孟繁榮1，張春香1，任有蛇1

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山西太谷030801；2.朔州市平魯區(qū)畜牧獸醫(yī)局，山西平魯036800）

通過對9月齡黑山羊附睪頭細胞進行不同濃度、不同時間新霉素和嘌呤霉素的處理，收集各個時間的細胞并進行計數(shù)，旨在研究山羊附睪頭細胞對新霉素和嘌呤霉素的耐受濃度。結(jié)果顯示，山羊附睪頭細胞在轉(zhuǎn)染時對新霉素和嘌呤霉素適宜的質(zhì)量濃度分別為400，2 μg/mL；試驗細胞計數(shù)結(jié)果與細胞生長狀態(tài)相一致，山羊附睪細胞與其他哺乳動物不同組織器官對新霉素和嘌呤霉素的耐受濃度基本一致。研究結(jié)果可為后期基因敲除和過表達載體轉(zhuǎn)染進山羊附睪頭細胞時抗性基因濃度的確定提供了參考，也為后期基因功能的研究奠定了基礎(chǔ)。

山羊附睪頭細胞；新霉素；嘌呤霉素

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗用黑山羊飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院試驗基地，以9月齡公羊附睪頭細胞作為試驗材料。

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)基DMEM/F12，無菌PBS，胰蛋白酶，青鏈霉素混合液，HEPES液（博士德生物公司）；嘌呤霉素（美國Sigma公司），新霉素（即G418，美國Amresco公司），胎牛血清（澳洲Gibco公司生產(chǎn)，購自北京博雅宏興科技發(fā)展有限公司），Guava Via-Count Reagent（北京強欣博瑞生物技術(shù)有限公司），GuavaRInstrument Cleaning Fluid（北京強欣博瑞生物技術(shù)有限公司）。

1.3 試驗方法

將傳代至第3～4代對數(shù)生長期的山羊附睪頭細胞以50%密度鋪到96孔板中，換上含10%胎牛血清及100 U/mL青霉素和鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基，每孔添加100 μL細胞懸液，置于含5%CO2的37℃無菌恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。24 h后分別更換添加新霉素的不含青鏈霉素培養(yǎng)基，使其在細胞培養(yǎng)液的終質(zhì)量濃度分別為 0，50，100，200，400，600，800 μg/mL，每2 d換一次添加新霉素的培養(yǎng)基，每組 15 個重復(fù)，分別于 48，96，120，144，168 h 消化添加不同濃度新霉素的3個孔。采用Guava EasyCyte流式細胞儀進行活細胞計數(shù)，選擇7～10 d細胞全部死亡的新霉素濃度為篩選濃度。

篩選嘌呤霉素時，添加不同濃度的嘌呤霉素，使嘌呤霉素的終質(zhì)量濃度分別為 0，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0 μg/mL，每2 d換一次添加嘌呤霉素的培養(yǎng)基，每組9個重復(fù)，分別于24，48，72 h后消化添加不同濃度的嘌呤霉素的3個孔，采用Guava EasyCyte流式細胞儀進行活細胞計數(shù)，選擇3～4 d細胞全部死亡的嘌呤霉素濃度為篩選濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同新霉素濃度對附睪頭活細胞的抑制效果

表1 不同新霉素濃度對附睪頭活細胞數(shù)目的影響（平均值） 個

試驗結(jié)果顯示，新霉素處理48 h后，處理組質(zhì)量濃度為800 μg/mL時，細胞并未全部死亡，在使用新霉素處理細胞96，120 h后，細胞對新霉素的耐受質(zhì)量濃度分別為600，400 μg/mL；新霉素處理144，168 h后，細胞對新霉素的耐受質(zhì)量濃度均為200 μg/mL（表 1）。

在培養(yǎng)過程中，將新霉素處理過后每個時間段的細胞狀態(tài)都進行拍照保存。圖1為新霉素終質(zhì)量濃度為200 μg/mL的細胞0～7 d的生長狀態(tài)。從圖1可以看出，最初新霉素對附睪頭細胞未產(chǎn)生抑制效果，隨著添加新霉素時間的延長，活細胞越來越少，細胞形態(tài)也有所變化。在添加新霉素144 h后，細胞形態(tài)異常，細胞全部變圓，未呈現(xiàn)正常的鵝卵石狀，且細胞核增大，細胞質(zhì)變渾濁。

2.2 不同嘌呤霉素濃度對附睪頭活細胞的抑制效果

從表2可以看出，嘌呤霉素處理附睪頭細胞24 h后，不同質(zhì)量濃度的嘌呤霉素能夠殺死部分細胞，但即使嘌呤霉素質(zhì)量濃度高達10 μg/mL，也未能使細胞全部死亡；嘌呤霉素處理附睪頭細胞48 h后，5.0 μg/mL的嘌呤霉素組細胞就已全部死亡；嘌呤霉素處理附睪頭細胞72 h后，細胞對嘌呤霉素的耐受質(zhì)量濃度是1.0 μg/mL。

表2 不同嘌呤霉素質(zhì)量濃度對附睪頭活細胞數(shù)目的影響（平均值） 個

在添加不同質(zhì)量濃度的嘌呤霉素之后，不同時間段細胞狀態(tài)不同。圖2為嘌呤霉素終質(zhì)量濃度為1 μg/mL時0～3 d細胞的生長狀態(tài)。由圖2可知，隨著時間的延長，維持正常形態(tài)的細胞數(shù)越來越少，添加1 μg/mL嘌呤霉素72 h后，細胞形態(tài)異常，細胞全部變圓，細胞核變大，不再是鵝卵石樣的細胞。

3 討論

利用基因敲除模型和基因過表達模型，借助序列分析平臺探究未知蛋白的功能是科學(xué)家對基因研究常用的方法[10]。基因的敲除和過表達需要以質(zhì)粒作為載體[11]，轉(zhuǎn)染進山羊附睪頭細胞中對目的基因進行剪切或者過量表達。細胞轉(zhuǎn)染分為瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染[12]，本研究構(gòu)建基因敲除模型和過表達模型是為了將外源基因整合到真核細胞基因組中，使基因被敲除的細胞和基因過量表達的細胞能夠穩(wěn)定傳遞給后代細胞。轉(zhuǎn)染細胞的打靶載體一般會以腐草霉素、嘌呤霉素、潮霉素和新霉素等作為正篩選基因[9]。真核細胞中表達新霉素抗性基因的細胞能夠在含有新霉素的培養(yǎng)液中正常生長，而沒有表達新霉素抗性基因的細胞，則會被新霉素抑制細胞的生長，從而導(dǎo)致細胞的死亡，這樣轉(zhuǎn)染成功的細胞就會被留下來，而轉(zhuǎn)染失敗的陰性細胞在篩選過程中就會死亡，不會對細胞模型的穩(wěn)定遺傳造成影響。

新霉素（Neomycin）是一種水溶性抗生素，屬于2-脫氧胺氨基糖苷類抗生素[13]，其主要作用于細菌30S亞單位，抑制蛋白質(zhì)的合成，從而殺死細菌[14]；對于真核細胞，主要通過破壞細胞內(nèi)的溶酶體來損壞細胞[15]。而嘌呤霉素則是使DNA鏈斷裂，它與50S亞基A部位結(jié)合，抑制氨酰-tRNA的進入，從而引起肽鏈合成的過早終止，一般2 d左右即可開始發(fā)揮作用[9]。由此看來，新霉素對細胞的破壞需要較長時間才能夠使細胞全部死亡，而嘌呤霉素作用時間就相對較短，這與本試驗結(jié)果相吻合。有研究表明，人足細胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為1.5 μg/mL[16]或1 μg/mL[17]；人乳腺癌BT549細胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為3 μg/mL[18]；人牙髓干細胞嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為2 μg/mL[19]；小鼠胚胎干細胞對新霉素的篩選質(zhì)量濃度為400 μg/mL[20]；山羊胎兒成纖維細胞對新霉素的篩選質(zhì)量濃度為400 μg/mL[12]，本研究在山羊附睪頭細胞上得到的結(jié)果與之基本一致。

4 結(jié)論

本試驗結(jié)果表明，新霉素處理細胞第7天，細胞全部死亡的質(zhì)量濃度為200μg/mL，嘌呤霉素處理第3天，細胞全部死亡的質(zhì)量濃度為1 μg/mL。為保證篩選階段未轉(zhuǎn)染細胞能夠全部死亡，將其篩選質(zhì)量濃度變?yōu)樵瓉淼?倍[3]，即新霉素篩選質(zhì)量濃度為 400 μg/mL，嘌呤霉素篩選質(zhì)量濃度為 2 μg/mL。

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Screening of Neomycin and Puromycin Concentration in Transfection of Goat Epididymal Caput Cells

TAI Miaomiao1，WU Xiaoye2，DU Haiyan1，MENG Fanrong1，ZHANG Chunxiang1，REN Youshe1
（1.College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shanxi Agricultural University，Taigu 030801，China；2.Bureau of Animal Husbandry and Veterinary in Pinglu District Shuozhou City，Pinglu 036800，China）

This research was designed to study the tolerance of goat epididymal cells to neomycin and puromycin.The cells of different time were collected and counted at different concentrations of neomycin and puromycin.The results showed that the appropriate concentrations of goat epididymal cells to neomycin and puromycin were 400,2 μg/mL,respectively.The results of this test cell count consistent with the cell growth status,and the tolerance to neomycin and puromycin of goat epididymal cells and other mammalian cells of different tissues and organs was consistent.The results of this study will provide a reference for gene knockout and the determination of resistance genes of overexpression vector transfection into the goat epididymal cells,and to provide a basis for the study of the gene function.

goat epididymal caput cells;neomycin;puromycin

S814

A

1002-2481（2017）10-1691-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.10.28

黑山羊是山西優(yōu)良的地方山羊品種，具有適應(yīng)性強、耐粗飼、易抓膘、抗病抗逆、肉質(zhì)好等特點[1]。為了深入研究黑山羊的繁殖性能，在對山羊睪丸和附睪頭差異表達基因的分析中發(fā)現(xiàn)，與睪丸相比，附睪頭中表達量上調(diào)比例最大的前10位基因中有7個是β防御素，其中，山羊β防御素124（Goat beta-defensin 124，gDB124）基因的上調(diào)比例最高[2]。為了深入研究β防御素124在山羊附睪頭中的功能，本研究對山羊附睪頭細胞進行體外培養(yǎng)，分別構(gòu)建了gDB124敲除載體和gDB124過表達載體。為了篩選基因成功敲除及過表達的細胞，需要對載體上的抗性基因細胞耐受濃度進行初步篩選[3]。

動物細胞的培養(yǎng)開始出現(xiàn)于20世紀，其目前已成為生物、醫(yī)學(xué)研究及應(yīng)用中廣泛采用的一種方法[4]。睪丸中產(chǎn)生的精子是不具備受精能力的[5]，其是在附睪微環(huán)境中獲得運動能力和受精能力的，因此，附睪上皮細胞的培養(yǎng)，需要考慮附睪管腔內(nèi)附睪液和精子等因素[6]。附睪體外模型的建立是從1995年大鼠附睪上皮的培養(yǎng)開始發(fā)展并逐漸成熟起來的[7]。

本研究中過表達載體上的抗性基因為新霉素，敲除載體上的抗性基因為嘌呤霉素。由于抗生素對具有耐藥性的真核細胞篩選的濃度不同[8]，不同細胞系對嘌呤霉素和新霉素的耐受度不同。即使是同種抗生素，不同廠家及批次的抗生素濃度也可能存在差異[9]。如果抗生素濃度過高，會對敲除成功的細胞產(chǎn)生抑制甚至是殺死細胞，造成陽性細胞過少，效率低下；如果抗生素濃度過低，則不能充分抑制未轉(zhuǎn)染成功的細胞，造成假陽性。為了避免不同細胞系之間的耐受差異，并保證試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究需要對嘌呤霉素和新霉素的篩選濃度進行測試。

2017-05-12

國家自然科學(xué)基金項目（31572407）；山西省研究生教育創(chuàng)新項目（2017SY036）

邰苗苗（1993-），女，山西臨汾人，在讀碩士，研究方向：動物遺傳育種與繁殖。任有蛇為通信作者。