朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

萘降解菌的分離鑒定、生長(zhǎng)特性和降解途徑探究*

朱 星 王若宇 汪 銳 白 雪 任龍飛 邵嘉慧 張小凡#

(上海交通大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200240)

從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌株DGN9，經(jīng)形態(tài)學(xué)和16SrDNA測(cè)序鑒定，該菌株屬于無(wú)色桿菌(Achromobactersp.)。其最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適pH為7，最適萘初始質(zhì)量濃度為1 000mg/L，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%的條件下生長(zhǎng)良好，具有一定的耐鹽性。其對(duì)萘的可能降解途徑為水楊酸降解途徑。同時(shí)，該菌株對(duì)蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對(duì)苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸等底物也有降解作用，具有底物生長(zhǎng)廣譜性。

萘 無(wú)色桿菌屬 生長(zhǎng)特性 降解途徑

多環(huán)芳烴(PAHs)是指兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的稠環(huán)有機(jī)化合物[1-2]，由于疏水性和穩(wěn)定性使其容易在人體內(nèi)富集，具有致癌、致畸和致突變效應(yīng)，是一類(lèi)普遍存在于環(huán)境中的對(duì)生態(tài)環(huán)境和人體健康具有嚴(yán)重危害的難降解污染物[3]。1976年，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(USEPA)就已將16種PAHs列為優(yōu)先控制的有機(jī)污染物[4]。隨著研究的進(jìn)步，越來(lái)越多的PAHs被發(fā)現(xiàn)，因此尋求高效、經(jīng)濟(jì)、環(huán)保的PAHs去除方法顯得越來(lái)越重要。

目前，去除污水中PAHs的方法有物理、化學(xué)和生物方法[5]。物理方法因不能徹底降解PAHs，已逐漸被研究人員放棄；化學(xué)方法雖然能有效降解PAHs，但同時(shí)存在二次污染和高能耗等問(wèn)題。利用微生物降解PAHs的生物方法具有經(jīng)濟(jì)、高效、二次污染少等優(yōu)勢(shì)，因此成為了去除污水中PAHs的理想方法。大量研究發(fā)現(xiàn)并分離了能以PAHs為碳源進(jìn)行降解的微生物[6]。萘是PAHs中結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單、分子量最小的一種化合物，一直是研究PAHs降解的典型。已報(bào)道的萘降解菌很多，主要有反硝化產(chǎn)堿菌(Alcaligenesdenitrificans)、分支桿菌(Mycobacteriumsp.)、惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida)、泡馕假單胞菌(Pseudomonasvesicularis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、紅球菌(Rhodococcussp.)和莫拉氏菌(Moraxellasp.)等[7-8]。這些萘降解菌株對(duì)鹽度要求比較苛刻，關(guān)于耐鹽性萘降解菌的分離研究還比較少。辛樹(shù)權(quán)等[9]篩選出了一株可在NaCl質(zhì)量濃度為3 g/L的條件下良好生長(zhǎng)的萘降解菌。饒麗[10]發(fā)現(xiàn)的萘降解菌可在2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl下良好生長(zhǎng)。

無(wú)色桿菌(Achromobactersp.)是已知的可用于降解多種難降解污染物的微生物，如石油、苯酚、氯酚和苯甲酸等。唐玉斌等[11]發(fā)現(xiàn)，木糖氧化無(wú)色桿菌可以降解蒽、菲、芘、4種PAHs，具有生長(zhǎng)底物廣譜性。李妮等[12]從孔雀綠污染土壤中分離出1株無(wú)色桿菌，發(fā)現(xiàn)其還可高效脫除孔雀綠。目前，關(guān)于無(wú)色桿菌降解萘的研究不多。因此，探究無(wú)色菌株對(duì)萘的降解途徑及其廣譜性和耐鹽性對(duì)理解無(wú)色桿菌降解PAHs具有一定的指導(dǎo)意義。本研究從天津大港油田附近污染土壤中分離出1株萘降解菌，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察和16S rDNA測(cè)序分析，探究其最佳生長(zhǎng)條件，并在最佳條件下對(duì)萘的降解途徑進(jìn)行了研究，同時(shí)對(duì)其廣譜性和耐鹽性進(jìn)行了討論。

1 材料和方法

1.1 材 料

1.1.1 土 樣

土樣取自天津大港油田附近(38°43′48″N、117°30′36″E)，該處土壤長(zhǎng)期受石油污染，采集深度為5～10 cm，采集到的土樣放入塑封袋中，密封，置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基[13]：Na2HPO42.2 g、KH2PO40.8 g、(NH4)2SO44.95 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、FeSO4·7H2O 10 mg、CaCl2·2H2O 10 mg、酵母粉 50 mg、礦物液10 mL，H2O 1 000 mL。其中，每100 mL礦物液中含ZnSO4·7H2O 50 mg、MnSO4·5H2O 50 mg、Na2MoO4·2H2O 10 mg、CuSO4·5H2O 5 mg、H2O 100 mL。

無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基在無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上加2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂。

1.1.3 儀 器

安捷倫7890B/5977A氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC/MS)， HP-5MS毛細(xì)管色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；尼康E200光學(xué)顯微鏡；日立S-520掃描電子顯微鏡(SEM)；UV-1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；Thermo X1R高速離心機(jī)；MLS-3750高壓滅菌鍋。

1.2 方 法

1.2.1 菌株的富集與純化

取0.5 g土樣置于30 mL的蒸餾水中，在30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)24 h，取上清液3 mL轉(zhuǎn)接到30 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min條件下培養(yǎng)7 d以富集萘降解菌，分別在萘初始質(zhì)量濃度為100、300、500、500、500 mg/L時(shí)連續(xù)富集5次后，選擇菌落生長(zhǎng)較好的樣品在無(wú)機(jī)鹽固體培養(yǎng)基上多次劃線分離純化，-80 ℃甘油保存，編號(hào)為DGN9。

1.2.2 菌種鑒定

在光學(xué)顯微鏡和SEM觀察的基礎(chǔ)上利用16S rDNA測(cè)序分析進(jìn)行鑒定。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)體系：DNA模板0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，DNA聚合酶0.2 μL, 10 μmol/L引物(27F 5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’、1492R 5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)各 0.5 μL，加雙蒸水至25 μL；擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)后72 ℃修復(fù)延伸10 min，4 ℃終止反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序后在美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)進(jìn)行blast 比對(duì)，通過(guò)MEGA 4.1計(jì)算遺傳距離，鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.2.3 菌株的生長(zhǎng)特性測(cè)定

菌株的生長(zhǎng)特性包括最適生長(zhǎng)溫度、最適萘初始濃度、最適pH、耐鹽性及生長(zhǎng)曲線。測(cè)定最適生長(zhǎng)溫度時(shí)，設(shè)置20、25、30、35 ℃ 4種不同溫度，pH為7，萘初始質(zhì)量濃度為500 mg/L；測(cè)定最適萘初始質(zhì)量濃度時(shí)，設(shè)置300、500、700、1 000、1 200、1 400 mg/L 6個(gè)梯度，溫度為30 ℃，pH為7；測(cè)定最適pH時(shí)，設(shè)置pH為6、7、8、9、10，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃；測(cè)定菌株耐鹽性時(shí)，設(shè)置NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%、4%、6%、8%，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L，溫度為30 ℃，pH為7。以上試驗(yàn)均于250 mL的三角搖瓶(含90 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基)中進(jìn)行，180 r/min搖床振蕩培養(yǎng)96 h，每隔12 h用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)光密度(OD600)，每組試驗(yàn)平行3次。生長(zhǎng)曲線測(cè)定于250 mL三角搖瓶(含90 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)中進(jìn)行，按10%(體積分?jǐn)?shù)，下同)的接種量接種菌株DGN9到90 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中，30 ℃、180 r/min、pH=7條件下振蕩培養(yǎng)96 h，每隔8 h測(cè)一次OD600，平行3次，以不接種菌液作為空白(CK)對(duì)照。

1.2.4 菌株的萘降解效率測(cè)定

將對(duì)數(shù)期菌株按10%接種量接種到100 mL無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L)，30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔24 h取培養(yǎng)液3 mL，測(cè)OD600并用正己烷按1∶1(體積比)萃取，無(wú)水硫酸鈉脫水，待GC/MS分析。色譜條件:載氣為He；進(jìn)樣量為1 μL；升溫程序?yàn)?0 ℃保持2 min，以15 ℃/min升至190 ℃保持2 min，3 ℃/min升至300 ℃保持2 min；質(zhì)譜條件：離子源溫度為230 ℃，檢測(cè)器溫度為315 ℃。

1.2.5 菌株的萘降解途徑

通過(guò)萘雙加氧酶的鐵硫蛋白質(zhì)大亞基基因(nahAC)[14]、水楊醛脫氫酶基因(nahF)[15]、水楊酸羥基化酶基因(nahG)[16]和兒茶酚2,3-雙加氧酶基因(nahH)[17]考察菌株的萘降解途徑。4種關(guān)鍵酶基因的PCR體系參照1.2.2，相應(yīng)的引物見(jiàn)表1。擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，32個(gè)循環(huán)后72 ℃修復(fù)延伸7 min。

表1 關(guān)鍵酶基因引物

1.2.6 菌株的底物特異性測(cè)定

將對(duì)數(shù)期菌株按10%接種量分別接種到30 mL含蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對(duì)苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基中(質(zhì)量濃度均為500 mg/L)，在pH=7、30 ℃、180 r/min下振蕩培養(yǎng)7 d，測(cè)定OD600，平行3次。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的鑒定

DGN9菌落呈圓形，表面輕微隆起，淡黃色，濕潤(rùn)，半透明，邊緣整齊，光滑。革蘭氏染色為陰性，在光學(xué)顯微鏡下呈桿狀，SEM觀察如圖1所示。

16S rDNA的測(cè)序分析得到的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)表明，菌株DGN9與Achromobacterxylosoxidanssubsp. (GU0145)的同源性達(dá)到98.6%，與Achromobacterpulmonis(KT808881.1)的同源性為97.4%，可鑒定為無(wú)色桿菌。

圖1 DGN9的SEM圖Fig.1 SEM image of DGN9

2.2 菌株DGN9的生長(zhǎng)特性

由圖2(a)可見(jiàn)，30 ℃的生長(zhǎng)曲線OD600高于其他溫度，因此30 ℃為最適生長(zhǎng)溫度；圖2(b)表明，萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)曲線的OD600高于其他濃度，因此最適萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L；圖2(c)表明，當(dāng)pH為7～9時(shí)，菌株DGN9生長(zhǎng)良好，最適pH為7；如圖2(d)所示，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%條件下DGN9生長(zhǎng)良好，說(shuō)明DGN9具有一定的耐鹽性，但當(dāng)鹽濃度過(guò)高時(shí)菌株生長(zhǎng)受到抑制。

DGN9在萘初始質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中30 ℃、180 r/min、pH=7條件下培養(yǎng)96 h的生長(zhǎng)曲線如圖3所示。前8 h為遲緩期，8～40 h為對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期，40～80 h為穩(wěn)定期，80 h后進(jìn)入衰亡期。

2.3 菌株DGN9的底物特異性

分別以蒽、菲、芘、聯(lián)苯、對(duì)苯二甲酸、鄰苯二酚、苯酚、苯甲酸鈉、水楊酸、鄰苯二甲酸為碳源，在pH=7、30 ℃、180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)7 d后，培養(yǎng)基由透明變混濁，OD600明顯升高，測(cè)定結(jié)果如表2所示。由此可見(jiàn)，菌株DGN9可以不同有機(jī)物為碳源，具有底物生長(zhǎng)廣譜性。

表2 DGN9的底物特異性

2.4 菌株DGN9的萘降解途徑

4種萘降解途徑的關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示。nahAC和nahG擴(kuò)增產(chǎn)物條帶清晰可見(jiàn)，nahF條帶比較模糊，沒(méi)有觀察到nahH的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。目前，已知的萘降解途徑主要有兩種：一種為水楊酸降解途徑；另一種為龍膽酸降解途徑，但龍膽酸降解途徑比較罕見(jiàn)[18-21]。由關(guān)鍵酶PCR擴(kuò)增結(jié)果可以判斷，菌株DGN9對(duì)萘的降解可能為水楊酸降解途徑，但不排除存在其他未知的降解途徑，有待進(jìn)一步深入研究。

圖2 菌株DGN9的生長(zhǎng)特性Fig.2 Growth characteristics of DGN9

圖3 DGN9 的生長(zhǎng)曲線Fig.3 Growth curve of DGN9

3 結(jié) 論

菌株DGN9鑒定為無(wú)色桿菌，其最佳生長(zhǎng)條件為：最適生長(zhǎng)溫度30 ℃、最適萘初始質(zhì)量濃度1 000 mg/L、最適pH為7，在NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%、2%的條件下可以生長(zhǎng)良好。此外，菌株DGN9具有底物生長(zhǎng)廣譜性，對(duì)萘降解途徑可能為水楊酸降解途徑。

圖4 萘降解途徑的關(guān)鍵酶基因PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 PCR amplification of key enzyme genes

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Isolation,identification,growthcharacteristicsanddegradationpathwayofnaphthalenedegradingbacteria

ZHUXing,WANGRuoyu,WANGRui,BAIXue,RENLongfei,SHAOJiahui,ZHANGXiaofan.

(SchoolofEnvironmentalScienceandEngineering,ShanghaiJiaoTongUniversity,Shanghai200240)

A naphthalene degrading bacteria DGN9 was isolated from Dagang Oil Field in Tianjin. Through morphological analysis and 16S rDNA sequence analysis,DGN9 was identified asAchromobactersp. Its optimum growth temperature was 30 ℃,optimum initial concentration of naphthalene was 1 000 mg/L,and optimum growth pH was 7. DGN9 could grow well when NaCl mass percentage was up to 1% or 2%. The possible degradation pathway might be salicylic acid pathway. The strain could also degrade anthracene,phenanthrene,pyrene,biphenyl,p-phthalic acid,catechol,phenol,sodium benzoate,salicylic acid and phthalic acid,covering a wide variety of substrates.

naphthalene;Achromobactersp.; growth characteristics; degradation pathway

10.15985/j.cnki.1001-3865.2017.04.007

2016-06-20)

朱 星，女，1992年生，碩士研究生，主要從事萃取生物膜反應(yīng)器處理難降解有機(jī)物的研究。#

。

*國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.21577089)；上海交通大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新項(xiàng)目(No.IPP12175)。