黃 茹，吳玉萍，夏振遠(yuǎn)，王正銀，李銀科

（1.云南財(cái)經(jīng)大學(xué)，高原山地土地利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650221；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 650106；3.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716；4.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 631500）

氮素水平對(duì)紅花大金元煙葉游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量的影響

黃 茹1，吳玉萍2，夏振遠(yuǎn)2，王正銀3，李銀科4*

（1.云南財(cái)經(jīng)大學(xué)，高原山地土地利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650221；2.云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，云南 玉溪 650106；3.西南大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，重慶 400716；4.玉溪師范學(xué)院資源環(huán)境學(xué)院，云南 玉溪 631500）

為了解氮素水平對(duì)云南煙區(qū)紅花大金元煙葉游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量的影響，通過田間試驗(yàn)設(shè)置4個(gè)施氮水平0、45、90 和 135 kg/hm2，分析其對(duì)紅花大金元煙葉游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量的影響，并通過感官質(zhì)量對(duì)煙葉品質(zhì)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果表明，煙葉內(nèi)組氨酸和天冬酰胺等含量隨施氮水平的提高而顯著增加，谷氨酰胺和精氨酸等含量以施氮90 kg/hm2處理最高，施氮 135 kg/hm2時(shí)出現(xiàn)下降趨勢(shì)，賴氨酸含量則是隨施氮水平的增加而顯著降低；游離氨基酸總量和蛋白質(zhì)含量隨施氮水平的提高顯著增加，施氮135 kg/hm2最高可達(dá)9.617 mg/g和10.56%；感官評(píng)吸中煙葉的香氣質(zhì)和評(píng)吸總分以施氮90 kg/hm2處理得分最高，不施氮處理最低。在本試驗(yàn)條件下，煙葉內(nèi)游離氨基酸的含量變化隨施氮水平的改變呈現(xiàn)出不一樣的特點(diǎn)，但游離氨基酸總量和蛋白質(zhì)含量隨施氮水平的提高顯著增加，施氮90 kg/hm2處理煙葉感官質(zhì)量最佳。

氮素水平；紅花大金元；游離氨基酸；蛋白質(zhì)；感官質(zhì)量

煙草植株從土壤中吸收銨鹽或硝酸鹽，在煙草根系和綠葉中還原成氨，再經(jīng)同化作用形成各種氨基酸和蛋白質(zhì)等有機(jī)含氮化合物[1]。蛋白質(zhì)和游離氨基酸作為煙葉中的主要含氮化合物對(duì)煙葉品質(zhì)和煙氣質(zhì)量具有重要影響[2-3]。因此，圍繞氮素對(duì)煙葉氨基酸含量及煙葉品質(zhì)的影響研究，已成為國內(nèi)外煙草研究者關(guān)注的熱點(diǎn)[4-5]。劉敬業(yè)等[6]研究認(rèn)為氨基酸含量與施肥量呈正相關(guān)，增幅較大的為谷氨酸、天門冬氨酸和脯氨酸。史宏志等[7]研究不同氮源肥料配比對(duì)河南煙葉氨基酸含量的影響發(fā)現(xiàn)，煙葉中總氨基酸含量與栽培時(shí)總施氮量和無機(jī)氮施用量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。李常軍等[8]對(duì)烤后煙葉主要含氮化合物之間的統(tǒng)計(jì)分析表明，總氮、煙堿、蛋白質(zhì)和氨基酸相互間極顯著相關(guān)。

通過調(diào)節(jié)氮素施用水平來改變煙葉中游離氨基酸和蛋白質(zhì)的含量，可以促進(jìn)煙葉化學(xué)成分協(xié)調(diào)，提高煙葉感官品質(zhì)。因此，本文研究了不同氮素水平下云南玉溪和大理紅花大金元（簡稱紅大）煙葉游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量的變化規(guī)律，以及對(duì)煙葉感官評(píng)吸質(zhì)量的影響，旨在為云南紅大栽培中氮素的合理施用及煙葉品質(zhì)的提升提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)區(qū)概況

試驗(yàn)于2013年5月初至8月底在紅大的主要種植區(qū)云南省玉溪市紅塔區(qū)春和鎮(zhèn)和大理州祥云縣禾甸鎮(zhèn)烤煙基地進(jìn)行。試驗(yàn)地點(diǎn)的氣候和土壤條件見表 1～2。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè) 4個(gè)氮水平處理：N0為不施氮肥；N1為低氮處理（施氮量45 kg/hm2）；N2為中等施氮處理（施氮量90 kg/hm2）；N3為高施氮處理（施氮量135 kg/hm2）。各處理3次重復(fù)，共計(jì)12個(gè)小區(qū)，小區(qū)面積120 m2，隨機(jī)區(qū)組排列?？緹熢耘嘁?guī)格（行距×株距）為 110 cm×60 cm。各處理施用磷肥（P2O5）90 kg/hm2，鉀肥（K2O）225 kg/hm2。試驗(yàn)用氮肥為硝酸銨（含 N 34%）、磷肥為過磷酸鈣（含P2O518%）、鉀肥為硫酸鉀（K2O 50%）。施肥方法為全部磷肥做基肥施用，氮肥和鉀肥的1/3做基肥，剩余的氮肥和鉀肥做追肥分別于烤煙移栽后15 d和30 d施用。試驗(yàn)過程中煙株的有效留葉數(shù)為18～20，田間管理按當(dāng)?shù)赝扑]的優(yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)技術(shù)措施實(shí)施。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 煙葉游離氨基酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定 煙葉適熟后采收烘烤，每小區(qū)取C3F和C2F各2.0 kg混合進(jìn)行游離氨基酸和蛋白質(zhì)的測(cè)定及感官評(píng)吸。游離氨基酸含量采用PITC柱前衍生化的HPLC技術(shù)測(cè)定[9]：準(zhǔn)確稱取過60目篩煙樣1.0 g于100 mL 磨口三角瓶中，加入0.005 mol/L HCl溶液50 mL室溫下超聲萃取30 min，離心后取上清液，使用0.45μm水相濾膜過濾待測(cè)。Agilent 1200 HPLC（美國），色譜條件為色譜柱：Hypersil ODS-C18柱（4.6 mm×100 mm，0.45 μm），衍生化試劑為2, 4-二硝基氟苯，流動(dòng)相A：0.05 mol/L乙酸鈉緩沖溶液，流動(dòng)相B：V乙腈∶V水=1∶1，梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫22 ℃，檢測(cè)波長360 nm。

煙葉蛋白質(zhì)含量的測(cè)定參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行：準(zhǔn)確稱取過40目篩煙樣0.3 g于250 mL三角瓶中，先用0.5%醋酸煮沸樣品15 min，抽濾后濾渣用0.5%醋酸洗滌，再將濾渣置于消化管中，加入0.1 g HgO、1.0 g K2SO4和5 mL濃硫酸消化，然后采用AAⅢ連續(xù)流動(dòng)分析儀（英國Seal公司）測(cè)定。

表1 試驗(yàn)地點(diǎn)氣候條件Table 1 Weather conditions of test sites

表2 試驗(yàn)地點(diǎn)土壤基本農(nóng)化性狀Table 2 Basic agro-chemical properties of experimental soils

1.3.2 煙葉感官質(zhì)量評(píng)定 參照文獻(xiàn)[11]進(jìn)行，取試驗(yàn)煙葉回潮后切絲，然后調(diào)節(jié)煙絲含水率到12.5%左右，卷制成卷煙后在規(guī)定的條件下調(diào)節(jié)24 h，按單料煙評(píng)吸基本要求進(jìn)行評(píng)吸。

1.4 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Office Excel 2013和IBM Statistics SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析處理，不同施氮處理間煙葉化學(xué)成分的均值多重比較采用LSD法；變量間的相關(guān)關(guān)系分析采用Pearson相關(guān)統(tǒng)計(jì)方法。

2 結(jié) 果

2.1 氮素水平對(duì)紅大煙葉游離氨基酸含量的影響

2.1.1 玉溪紅大煙葉游離氨基酸 表3可知，施氮可以顯著提高玉溪紅大煙葉總氨基酸含量，且隨施氮水平的提高呈增加趨勢(shì)，N3處理總氨基酸的含量比N1處理增加了34.71%。但煙葉中不同種類的游離氨基酸含量差異較大，在 N1處理下，含量最高的脯氨酸是含量最低的β-丙氨酸的1513倍。煙葉內(nèi)游離氨基酸的含量變化隨施氮水平的改變呈現(xiàn)出不一樣的特點(diǎn)，組氨酸和脯氨酸等9種氨基酸含量隨施氮量的增加而提高，且各處理間差異顯著；谷氨酰胺和精氨酸等 6種氨基酸則以 N2處理含量最高，氮素施用水平過高時(shí)其含量下降，其中4-氨基丁酸含量從N2處理到N3處理降低了51.09%；賴氨酸含量則是隨施氮水平的增加顯著降低；而高絲氨酸和β-丙氨酸由于含量極其微少，其含量隨施氮水平的變化沒有表現(xiàn)出較為一致的規(guī)律性。

從表3還可以看出，不同施氮水平下煙葉中部分氨基酸的絕對(duì)含量與相對(duì)含量表現(xiàn)出不一樣的變化規(guī)律，如脯氨酸的絕對(duì)含量隨施氮水平的增加而顯著提高，但從N0處理到N2處理，其相對(duì)含量卻逐漸降低，N3處理時(shí)又有所提高，而這種改變會(huì)對(duì)煙葉的感官質(zhì)量造成影響。通過對(duì)施氮水平與氨基酸間的相關(guān)分析結(jié)果表明，施氮水平與煙葉中組氨酸和天冬酰胺等 15種氨基酸呈極顯著正相關(guān)，與高絲氨酸和賴氨酸呈極顯著負(fù)相關(guān)，與4-氨基丁酸、絡(luò)氨酸和亮氨酸相關(guān)性不顯著，表明施氮水平對(duì)玉溪紅大煙葉的游離氨基酸含量具有較為重要的影響。

表3 氮素水平對(duì)玉溪煙葉氨基酸含量的影響Table 3 Effect of nitrogen level on amino acid content of Yuxi tobacco leaf

2.1.2 大理紅大煙葉游離氨基酸 表4可知，施氮也顯著提高大理紅大煙葉總氨基酸含量，且隨施氮水平的提高呈增加趨勢(shì)，N3處理總氨基酸的含量比N1處理增加了47.89%，增加幅度高于玉溪。同樣，大理紅大煙葉中不同種類的游離氨基酸含量差異也較大，其中以脯氨酸含量最高，達(dá)到總量的57%以上。大理紅大煙葉內(nèi)游離氨基酸的含量隨施氮水平的變化規(guī)律與玉溪紅大煙葉的表現(xiàn)基本相似，但其中天冬氨酸和蘇氨酸各處理間存在顯著差異，絡(luò)氨酸含量以 N2處理最高。通過對(duì)施氮水平與氨基酸絕對(duì)含量間的相關(guān)分析結(jié)果表明，除4-氨基丁酸和絡(luò)氨酸，其余氨基酸與施氮水平均具有顯著相關(guān)性，表明施氮水平對(duì)大理紅大煙葉的游離氨基酸含量具有較為重要的影響。

表4 氮素水平對(duì)大理紅大煙葉氨基酸含量的影響Table 4 Effect of nitrogen level on amino acid content of Dali tobacco leaf

2.2 氮素水平對(duì)紅大煙葉蛋白質(zhì)含量的影響

從圖1可見，不同的施氮處理下，玉溪和大理兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的煙葉蛋白質(zhì)含量均隨施氮水平的提高而增加，其含量均以高施氮處理最高，分別為10.35%和10.56%，且4個(gè)處理間均達(dá)到5%的顯著性差異水平。除高氮處理外，玉溪煙葉的蛋白質(zhì)含量均高于大理。玉溪和大理兩個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)煙葉蛋白質(zhì)含量與施氮水平呈極顯著性正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.978和0.961。

2.3 氮素水平對(duì)紅大煙葉感官質(zhì)量的影響

圖1 氮素水平對(duì)紅大煙葉蛋白質(zhì)含量的影響Fig. 1 Effect of nitrogen level on protein content of tobacco leaf

表5 氮素水平對(duì)紅大煙葉感官質(zhì)量的影響Table 5 Effect of nitrogen level on sensory evaluation of tobacco leaf

表5可知，不同的氮素水平下，玉溪和大理紅大煙葉的香氣質(zhì)、香氣量、余味、雜氣、勁頭和評(píng)吸總分均以中等施氮處理最高，不施氮處理感官品質(zhì)較差。除玉溪不施氮和高施氮處理的煙葉香氣質(zhì)外，各處理間存在顯著性的差異。刺激性隨施氮水平的提高顯著性增加，燃燒性和灰色評(píng)分隨施氮量的增加而降低。玉溪和大理紅大煙葉感官質(zhì)量隨施氮水平的變化存在差異，但其變化規(guī)律基本一致。對(duì)施氮水平與感官質(zhì)量指標(biāo)間的相關(guān)分析結(jié)果表明，除香氣質(zhì)外，其余各指標(biāo)與施氮水平均具有顯著相關(guān)性。

3 討 論

相關(guān)研究表明氮素水平對(duì)煙葉中游離氨基酸含量存在一定影響。韓錦峰等[12]研究表明，煙株根系中氨基酸總量隨著施氮量的增加而升高，各種游離氨基酸含量則有增有減。煙葉中的總氨基酸含量與栽培時(shí)總施氮量和無機(jī)氮施用量呈顯著性正相關(guān)關(guān)系，但其中纈氨酸、苯丙氨酸等在中等施氮水平下含量較高[7,13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅大煙葉游離氨基酸總量與施氮水平顯著正相關(guān)，但其中谷氨酰胺、精氨酸、4-氨基丁酸和苯丙氨酸則以中等施氮處理含量最高，這與史宏志等[7]的研究結(jié)果相似。煙葉中游離氨基酸含量除受氮素水平的影響以外，還可能受土壤、海拔等生態(tài)環(huán)境因素的影響[14-15]，因此，本試驗(yàn)中紅大在相同的施肥和栽培措施下，其游離氨基酸含量存在差異，但不同環(huán)境因子的影響還有待進(jìn)一步研究。在中等施氮水平下，玉溪和大理紅煙葉總游離氨基酸的含量大于8.389 mg/g，說明合適的氮素水平下紅大煙葉整體游離氨基酸含量較高，這對(duì)于改善煙葉的品質(zhì)，提高煙葉的香吃味[6]以及煙葉的陳化保存[16]等方面是有利的。

氨基酸對(duì)煙葉品質(zhì)的影響具有雙重作用，一方面在煙葉的調(diào)制和醇化過程中，氨基酸與還原糖發(fā)生反應(yīng)，賦予煙氣香味[17]；另一方面在煙葉的燃燒裂解過程中，氨基酸形成具有刺激性的含氮化合物，同時(shí)還產(chǎn)生一些有害健康的煙氣成分，對(duì)煙氣香吃味產(chǎn)生不良影響[18]。煙葉中適量的氨基酸對(duì)煙氣勁頭的提高和豐滿度的增加有利，但過量則具有刺激性和苦味[19]。眾多研究表明，不同游離氨基酸對(duì)煙葉感官品質(zhì)的影響也存在差異，鄧國賓等[20]認(rèn)為蛋氨酸、精氨酸、酪氨酸、甘氨酸、異亮氨酸對(duì)感官質(zhì)量的影響較大，王樹聲等[21]認(rèn)為，精氨酸、苯丙氨酸對(duì)香氣的貢獻(xiàn)最大。本研究結(jié)果顯示，不施氮時(shí)煙葉游離氨基酸含量較低，過量施氮會(huì)導(dǎo)致煙葉游離氨基酸含量的過高，中等施氮水平下煙葉游離氨基酸含量保持較優(yōu)值，有利于煙葉品質(zhì)提升。煙葉成熟過程中蛋白質(zhì)的逐步降解和氨基酸的進(jìn)一步積累對(duì)促進(jìn)煙葉品質(zhì)的形成有著重要的意義[22]，而施氮量與煙葉成熟度密切相關(guān)，因此通過改變施氮水平可以調(diào)控烤煙葉片中蛋白質(zhì)的含量。煙草是一種嗜好品，其最終的目的是用于吸食。煙葉感官評(píng)吸結(jié)果是評(píng)價(jià)煙葉質(zhì)量和工業(yè)可用性評(píng)價(jià)的重要依據(jù)，常用于評(píng)價(jià)煙葉質(zhì)量的優(yōu)劣[23]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示中等施氮水平下，紅大煙葉的香氣質(zhì)、香氣量和余味等有利于感官評(píng)吸的因素得分較高，勁頭和刺激性適中，雜氣較好，燃燒性和灰色較好，煙葉品質(zhì)較好，這與煙葉氨基酸和蛋白質(zhì)含量變化的結(jié)果較為一致。

綜合分析，氮素水平與云南紅大煙葉中游離氨基酸和蛋白質(zhì)含量密切相關(guān)，中等施氮條件下，玉溪和大理紅大煙葉中游離氨基酸和蛋白質(zhì)協(xié)調(diào)性較好，煙葉品質(zhì)優(yōu)良，感官評(píng)吸質(zhì)量高。

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Effect of Nitrogen Level on Free Amino Acid and Protein Contents of Honghuadajinyuan Tobacco Leaves

HUANG Ru1, WU Yuping2, XIA Zhenyuan2, WANG Zhengyin3, LI Yinke4*

(1. Key Laboratory of Land-use in Plateau Mountainous Region, Yunnan University of Finance and Economics, Kunming 650221,China; 2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Science, Yuxi, Yunnan 650106, China; 3. College of Resources and Environment,Southwest University, Chongqing 400716, China; 4. College of Resources and Environment, Yuxi Normal University, Yuxi, Yunnan 631500, China)

Four nitrogen levels of N 0, 45, 90 and 135 kg/ha were setup to investigate the free amino acid and protein contents in Honghuadajinyuan (Hongda) tobacco at different nitrogen application levels. The results showed that histidine and asparagines content of tobacco increased significantly with the nitrogen application level. Glutamine and arginine contents in the 90 kg/ha N treatments were the highest, and decreased in the 135 kg/ha N treatment. Lysine content was decreased with the nitrogen levels increased. The total amount of free amino acids and protein content of tobacco increased significantly with the nitrogen application level, with up to 9.617 mg/g and 10.56% in the 135 kg/ha N treatment. The quality of aroma and sensory quality reached the highest in 90 kg/ha N and the lowest in 0 N treatment. Under the conditions of this experiment, the total amount of free amino acids and protein content of tobacco increased significantly with the nitrogen application level, but the contents of free amino acids in different species showed different expression with nitrogen application level, the sensory quality of tobacco was the best in 90 kg/ha N.

nitrogen level; honghuadajinyuan; gree amino acid; protein; sensory quality

S572.06

1007-5119（2017）05-0050-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.009

中國煙草總公司重大專項(xiàng)“不同香型煙葉化學(xué)成分研究”（2012GC01）

黃 茹（1982-），女，博士，講師，主要從事農(nóng)業(yè)資源利用研究。E-mail：huangru_2008@163.com。*通信作者，E-mail：linkli609@163.com

2017-01-05

2017-07-21