孫志恒 呂敏蘭 張智嘉 張 迎 韓曉軍

(新能源轉(zhuǎn)換與儲存關(guān)鍵材料技術(shù)工信部重點實驗室，城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150001)

白蒿揮發(fā)油成分的測定及其抗氧化活性分析

孫志恒 呂敏蘭 張智嘉 張 迎 韓曉軍*

(新能源轉(zhuǎn)換與儲存關(guān)鍵材料技術(shù)工信部重點實驗室，城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室，哈爾濱工業(yè)大學(xué)化工與化學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150001)

采用乙醇浸提法提取生長期和花果期白蒿的揮發(fā)油，通過正交實驗確定最佳提取條件為：提取3次、浸提90 min、對于生長期和花果期白蒿液料比分別為10 mL∶1 g和8 mL∶1 g。通過紅外光譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析了產(chǎn)物的主要成分，生長期白蒿揮發(fā)油的主要成分為桉樹腦、樟腦、右旋龍腦、石竹烯、Cadina-1,4-diene、白菖烯、棕櫚酸乙酯等； 花果期白蒿揮發(fā)油的主要成分為樟腦、石竹烯、龍腦、甲酸橙花酯等。通過1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除實驗對產(chǎn)物的自由基清除活性進行了測定，生長期和花果期白蒿揮發(fā)油對0.05 mmol/L DPPH溶液的IC50值分別為0.40和1.66 mg/mL。研究結(jié)果表明，乙醇浸提的生長期和花果期白蒿的揮發(fā)油具有較好的抗氧化活性。

白蒿揮發(fā)油； 乙醇浸提法； 自由基清除活性

2017-05-26收稿； 2017-09-26接受

本文系國家自然科學(xué)基金項目(Nos. 21773050, 21528501)、城市水資源與水環(huán)境國家重點實驗室(哈爾濱工業(yè)大學(xué))自主課題(No. 2017DX05)和哈爾濱工業(yè)大學(xué)環(huán)境生態(tài)創(chuàng)新專項基金項目(No. HSCJ201607)資助

* E-mail: hanxiaojun@hit.edu.cn

1 引 言

蒿屬植物是生產(chǎn)天然抗氧化劑和殺蟲劑的重要原料[1]。白蒿(Herba Artimisiae Sieversianae)為菊科植物大籽蒿全草，分布廣泛[2,3]。白蒿在《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品，具有治療腫熱咳嗽、濕熱黃疸、風(fēng)濕痹痛、疥瘌惡瘡等功效。白蒿揮發(fā)油是白蒿體內(nèi)一類重要的次生代謝產(chǎn)物，存在于花、葉片、果實、種子和樹皮中，一般由幾十種甚至上百種化合物組成。研究表明，白蒿的揮發(fā)油中含有大量活性成分，是體現(xiàn)白蒿生物活性的重要物質(zhì)[4,5]。揮發(fā)油中的萜烯類物質(zhì)具有殺蟲、抑菌的功效[6～8]，而薁類物質(zhì)具有一定的抗癌作用[9]。目前，提取植物中活性成分的方法主要有水蒸氣蒸餾法[10,11]、溶劑萃取法[12]、蒸餾萃取法[13]、固相微萃取法[14]、分子蒸餾法[15]、超臨界流體萃取法[16]等，這些提取方法均可用于提取白蒿揮發(fā)油[17]。相比而言，溶劑萃取法中的浸提法無需加熱，具有萃取溫度低、萃取成分較完全、提取率較高等優(yōu)點。韓小冰等[18]分別以石油醚、三氯甲烷、丙酮和乙醇為溶劑，對比了索氏提取法、冷浸法和超聲波法提取白蒿的活性成分，結(jié)果表明，以乙醇為溶劑，冷浸法提取的白蒿活性成分生物活性最好。

目前，對于天然產(chǎn)物的活性成分分析手段有紅外光譜[19]、液相色譜[20]、核磁[21]、質(zhì)譜[22]以及儀器聯(lián)用技術(shù)(如ICP-MS[23]、GC-MS[24]等)，這些方法均可用于白蒿揮發(fā)油成分的分析[25,26]。波譜的指紋區(qū)可用于比較不同地區(qū)的天然產(chǎn)物活性成分的差異。雖然波譜手段可以準確確定未知成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，但是對被分析物的純度要求高。對于含有上百種成分的揮發(fā)油，由于部分成分含量較低，利用波譜手段鑒定其結(jié)構(gòu)，不但耗時長，且工作量巨大。GC-MS可以快速準確鑒定多種化合物的混合物，是目前最常用、最為靈敏的分析方法之一。Suleimenov等[27]采用GC-MS檢測鑒定出白蒿揮發(fā)油中104種化學(xué)成分。截至目前，對于白蒿揮發(fā)油的研究主要包括揮發(fā)油的成分分析、揮發(fā)油的生物活性分析等幾個方面[28～30]。然而對于白蒿不同生長時期揮發(fā)油的成分分析、生物活性的異同，相關(guān)的研究較少。研究不同生長時期對白蒿揮發(fā)油成分及活性的影響對于提高白蒿中有效成分的產(chǎn)率，高效綜合利用白蒿提取物有重要意義。所以，本實驗針對這一方面進行了研究。

本研究采用乙醇浸提法提取生長期和花果期白蒿的揮發(fā)油，分別確定了二者浸提的最佳條件； 通過傅里葉紅外光譜(FT-IR)和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)技術(shù)分析了二者產(chǎn)物的主要成分； 測定并比較了二者清除自由基的能力。本研究為白蒿的進一步開發(fā)提供了技術(shù)支持。

2 實驗部分

2.1儀器、試劑與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent HP-5色譜柱，6890GC/5973N質(zhì)譜儀，美國Agilent公司)； Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀(美國Nicolet公司)； Cary-60 UV-Vis紫外可見分光光度計(美國Agilent公司)； RE52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)。

白蒿原料(菊科植物白蒿全草，分別于6月份(生長期)和9月份(花果期)采于黑龍江省哈爾濱市，陰干保存，粉碎備用)。 KBr(色譜純，科密歐化學(xué)試劑有限公司)； 1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、維生素C(VC)和無水乙醇(分析純, 阿拉丁試劑公司)； 實驗用水為蒸餾水。

2.2揮發(fā)油的提取

白蒿揮發(fā)油的提取方法以提取生長期白蒿揮發(fā)油的過程為例，提取條件為浸提3次，浸提時間90 min，液料比10 mL∶1 g，具體方法為：準確稱取生長期白蒿10 g，置于250 mL玻璃瓶中，加入無水乙醇100 mL，浸提90 min后過濾，收集浸提液，余下原料按上述方法再次浸提，共浸提3次，合并浸提液。將浸提液置于20℃條件下冷凍24 h后，迅速濾去白色不溶物，得到的濾液經(jīng)減壓蒸餾除掉乙醇后即為揮發(fā)油產(chǎn)品。 其它條件下的提取過程同上。

2.3揮發(fā)油成分分析

采用GC-MS對揮發(fā)油樣品進行分析，其中氣相色譜表征條件：HP-5色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)； 載氣：He； 流速：1.0 mL/min； 進樣方式：不分流進樣； 進樣量：1.0 μL。程序升溫：柱溫50℃保留3 min，以20℃/min升至280℃，恒溫2 min。質(zhì)譜條件：電離方式EI，電離能量70 eV，離子源溫度230℃，掃描范圍：5～500 amu。溶劑延遲時間為3 min。用計算機譜庫NIST進行檢索。

本實驗采用傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)對獲得的揮發(fā)油樣品進行表征。檢測條件為：KBr壓片法，測定范圍4000～500 cm，掃描信號累加64次，分辨率為4 cm，OPD速度為0.2 cm/s，掃描時實時扣除KBr的干擾。

2.4DPPH自由基清除實驗[31]

配制濃度為0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液作為反應(yīng)液，將不同揮發(fā)油分別配制成特定濃度的待測樣品。將反應(yīng)液分別與待測樣品等體積混合，避光靜置30 min，測定混合液在517 nm處的吸光度，計算自由基清除率：

自由基清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%

其中，A0為反應(yīng)液/無水乙醇等體積混合后的吸光度；Aj為待測樣品/無水乙醇等體積混合后的吸光度；Ai為DPPH/待測樣品等體積混合后的吸光度。以各揮發(fā)油樣品的自由基清除率對樣品濃度繪制擬合曲線，即可得到待測樣品清除DPPH自由基的IC50值。

3 結(jié)果與討論

3.1提取條件的優(yōu)化

分別考察了液料比、提取次數(shù)、浸提時間3個因素對生長期和花果期白蒿揮發(fā)油的提取率的影響， 設(shè)計了三因素三水平的正交實驗。表1為乙醇浸提生長期白蒿揮發(fā)油的實驗結(jié)果。對表1中的數(shù)據(jù)進行極差分析后可得到， 乙醇浸提法提取生長期白蒿揮發(fā)油的最佳提取條件為：液料比10 mL∶1 g； 提取次數(shù)3次； 浸提時間90 min。表2為乙醇浸提花果期白蒿揮發(fā)油的實驗結(jié)果，對表2中的數(shù)據(jù)進行極差分析后，可以確定用乙醇浸提法提取花果期白蒿揮發(fā)油的最佳提取條件為：液料比8 mL∶1 g； 提取次數(shù)3次； 浸提時間90 min。分析上述結(jié)果可知，對于提取不同生長時期白蒿的揮發(fā)油，提取次數(shù)均為影響提取率的關(guān)鍵因素， 提取次數(shù)過少，則提取不完全，收率低； 提取次數(shù)過多，則提取效率降低，本實驗確定的最佳提取次數(shù)為3次。 提取生長期白蒿揮發(fā)油的最佳液料比為10 mL∶1 g，而提取花果期白蒿揮發(fā)油的最佳液料比為8 mL∶1 g，這可能是由于生長期的白蒿代謝更為旺盛，植物中產(chǎn)生的生長素等植物激素促進了相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物的生成和累積，含量相對較多，故需要更多的溶劑才能將揮發(fā)性成分提取完全，而花果期的白蒿中，植物激素影響了萜類物質(zhì)、黃酮類物質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)化，故其次生代謝產(chǎn)物含量有所下降，所需溶劑較少[32]，可見，在提取白蒿揮發(fā)油時，選取生長期白蒿作為原料比選擇花果期白蒿作為原料可以得到更多的揮發(fā)油。相比于文獻報道的提取蒿類植物揮發(fā)油的研究[33,34]， 利用乙醇浸提法提取白蒿揮發(fā)油，方法簡單、節(jié)能環(huán)保，且其提取率更高。

表1 提取生長期白蒿揮發(fā)油正交實驗結(jié)果

Table 1 Orthogonal experimental results of extracting essential oil of Herba Artimisiae Sieversianae in growth period

編號No．液料比Ratioofliquidtosolid提取次數(shù)Timesofextraction浸提時間Extractiontime(min)提取率Yield(%)110mL∶1g31506．41210mL∶1g21206．38310mL∶1g1905．8849mL∶1g31206．5759mL∶1g2906．4069mL∶1g11506．05710mL∶1g3906．88810mL∶1g21506．57910mL∶1g11206．16

表2 提取花果期白蒿揮發(fā)油正交實驗結(jié)果

Table 2 Orthogonal experimental results of extracting essential oil of Herba Artimisiae Sieversianae in flower/fruit bearing period

編號No．液料比Ratioofliquidtosolid提取次數(shù)Timesofextraction浸提時間Extractiontime(min)提取率Yield(%)18mL∶1g31506．3028mL∶1g21206．1838mL∶1g1906．0449mL∶1g31206．2459mL∶1g2906．1569mL∶1g11505．97710mL∶1g3906．39810mL∶1g21506．21910mL∶1g11205．87

3.2揮發(fā)油成分的分析

通過FT-IR和GC-MS分析了揮發(fā)油的主要成分。生長期和花果期白蒿揮發(fā)油的FT-IR圖如圖1所示。圖1a為生長期白蒿揮發(fā)油的紅外光譜，在3360 cm處的吸收峰為的伸縮振動峰，2926和2854 cm處的吸收峰為飽和烷烴中的伸縮振動峰，1737 cm處的吸收峰為酯的的伸縮振動峰，1622和1463 cm處的多重峰為苯環(huán)的特征峰，1378 cm處的吸收峰為的伸縮振動峰，1238、1167和1054 cm處的多重峰為的伸縮振動峰，723 cm處的吸收峰為的特征峰。圖1b為花果期白蒿揮發(fā)油的紅外光譜，在3465 cm處的吸收峰為的伸縮振動峰，2925和2855 cm處的吸收峰為飽和烷烴中的伸縮振動峰，1744 cm處的吸收峰為酯的的伸縮振動峰，1594和1458 cm處的多重峰為苯環(huán)的特征峰，1378 cm處的吸收峰為的伸縮振動峰，1236和1158 cm處的多重峰為酚或醇結(jié)構(gòu)中的伸縮振動峰，724 cm處的吸收峰為的特征峰。紅外光譜表征結(jié)果說明提取的揮發(fā)油中含有芳香化合物、羰基化合物等[35]，同時基于本研究組以往的研究經(jīng)驗，基本可以確定產(chǎn)物中含有醇、酚、酯、烴等化合物。揮發(fā)油的具體成分可以通過GC-MS進一步加以鑒別。

圖1 不同生長時期白蒿揮發(fā)油的FT-IR圖：(a) 生長期白蒿揮發(fā)油； (b) 花果期白蒿揮發(fā)油Fig.1 Fourier transform-infrared (FT-IR) spectra of essential oil of Herba Artimisiae Sieversianae in different growth period: (a) growth period, (b) flower/fruit bearing period

生長期和花果期白蒿揮發(fā)油的GC-MS分析結(jié)果如表3所示。白蒿揮發(fā)油中主要含有桉樹腦、石竹烯、母菊薁等成分。兩種生長時期白蒿的揮發(fā)油都含有較多的烷烴、烯烴成分，這與分析FT-IR圖得出的結(jié)論一致。對比兩種生長時期白蒿的揮發(fā)油的成分可以發(fā)現(xiàn)，不同生長時期白蒿的揮發(fā)油成分和含量不盡相同，生長期白蒿揮發(fā)油的主要成分為桉樹腦、樟腦、右旋龍腦、石竹烯、白菖烯、棕櫚酸乙酯； 花果期白蒿揮發(fā)油主要含有龍腦、石竹烯、甲酸橙花酯、母菊薁、二十烷。生長期的白蒿揮發(fā)油具有0.97%的萜品烯，而花果期的白蒿揮發(fā)油卻沒有，萜烯類化合物是具有代表性的抗氧化活性物質(zhì)，因此可以推測生長期的白蒿揮發(fā)油具有更高的抗氧化活性。同時， 生長期和花果期白蒿揮發(fā)油都含有石竹烯和樟腦，但相對含量差異很大，生長期白蒿揮發(fā)油中石竹烯和樟腦的含量分別為10.43%和2.75%，花果期白蒿揮發(fā)油中石竹烯和樟腦的含量僅約為1.35%和0.46%。不同生長時期白蒿的揮發(fā)油成分和含量有所不同，其原因可能是不同時期，植物所處的環(huán)境和生長狀態(tài)有較大差異，這會導(dǎo)致植物的次生代謝產(chǎn)物存在不同。光照、溫度、細菌、昆蟲等都是影響植物次生代謝產(chǎn)物的環(huán)境因素，會對產(chǎn)物的成分和相對含量產(chǎn)生較大的影響。處于生長期時的白蒿，更易遭受蟲害，故其次生代謝產(chǎn)物中石竹烯、樟腦的含量較多，具有較強的殺蟲、抑菌能力； 相比而言，處于花果期的白蒿，產(chǎn)生的石竹烯、樟腦量較低[36,37]。不同時期白蒿的揮發(fā)油中組分的差異以及各組分相對含量的不同，會導(dǎo)致其生物活性和生理功能存在差異，所以，在提取揮發(fā)油時，需要根據(jù)揮發(fā)油的用途選擇相應(yīng)生長時期的原料。

表3 生長期和花果期的白蒿揮發(fā)油成分及相對含量

Table 3 Composition and content of Herba Artimisiae Sieversianae in different growth periods

編號Number分析物Analyte分子式Formula含量Content(%)生長期Growthperiod花果期Flower/fruitbearingperiod1桉樹腦EucalyptolC10H18O9．422萜品烯TerpineneC10H160．973樟腦CamphorC10H16O2．750．464右旋龍腦DextroborneolC10H18O8．515α?蓽澄茄烯α?CadineneC15H241．996Cyclobuta[1，2：3，4]dicyclopenteneC15H241．977石竹烯CaryophylleneC15H2410．431．358環(huán)蒜頭烯(+)?CyclosativeneC15H240．889愈木創(chuàng)烯GuaieneC15H241．7810Cadina?1，4?dieneC15H245．1111白菖烯CalareneC15H222．9612棕櫚酸乙酯EthylPalmitateC18H36O24．6913龍腦BorneolC10H18O2．5514蒎烯PineneC15H240．3815芹子烯SelineneC15H240．7166甲酸橙花酯NerylformateC13H22O23．0117長葉烯LongifoleneC15H240．8818母菊薁ChamazulenC14H168．3719二十烷EicosaneC20H421．2720二十七烷HeptacosaneC27H560．90

3.3DPPH自由基清除實驗

本實驗以VC為陽性對照，通過測定待測樣品對DPPH自由基的清除效果，確定其抗氧化活性。樣品對DPPH自由基的清除效果采用DPPH底物濃度為0.05 mmol/L時，樣品的IC50值評價，實驗結(jié)果見圖2，當DPPH底物濃度為0.05 mmol/L時，生長期和花果期白蒿的揮發(fā)油的IC50值分別為0.40和1.66 mg/mL。在此條件下，陽性對照物VC的IC50值為0.03 mg/mL。結(jié)果表明，生長期和花果期白蒿的揮發(fā)油均具有一定的抗氧化活性，但相比于VC，其抗氧化活性較低。對比兩種揮發(fā)油的抗氧化活性，生長期白蒿揮發(fā)油的抗氧化活性高于花果期白蒿揮發(fā)油的抗氧化活性，其原因可能是在生長期白蒿的揮發(fā)油中，具有多種花果期揮發(fā)油沒有的活性成分，如桉樹腦、萜品烯、右旋龍腦、α-蓽澄茄烯、愈木創(chuàng)烯、白菖烯、棕櫚酸乙酯等，特別是萜品烯已經(jīng)被證明具有很強的抗氧化活性[38,39]。有些共同成分的含量也比花果期白蒿揮發(fā)油中的含量高，如樟腦、石竹烯等。這與上述成分分析所得結(jié)果一致。因此，為了提高抗氧化活性物質(zhì)的產(chǎn)率，應(yīng)在白蒿生長期進行揮發(fā)油提取。

圖2 生長期(A)、花果期(B)白蒿揮發(fā)油及維生素C(C)自由基清除效果Fig.2 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH) radical scavenging effect of Herba Artimisiae Sieversianae in growth period (A) and flower/fruit bearing period (B), vitamin C (C)

揮發(fā)油是一種混合物，其清除自由基的機理比較復(fù)雜，與揮發(fā)油中大量存在具有抗氧化活性的物質(zhì)有關(guān)，揮發(fā)油中含有的高活性抗氧化成分(如黃酮類、酚類、不飽和脂肪酸類物質(zhì))可以補充機體的抗氧化物質(zhì)，使機體內(nèi)源性抗氧化酶活性提高，有效防止自由基鏈式反應(yīng)的形成及其引起的機體損傷。白蒿揮發(fā)油中主要體現(xiàn)抗氧化活性的成分是萜烯類物質(zhì)，而這類物質(zhì)的種類和含量受植物自身生長調(diào)節(jié)和環(huán)境影響較大，故而不同生長時期以及不同環(huán)境條件下，植物代謝活動的不同是造成不同生長時期白蒿揮發(fā)油抗氧化活性不同的根本原因。

4 結(jié) 論

本研究通過正交實驗法確定了提取生長期和花果期白蒿揮發(fā)油的最佳條件。通過FT-IR和GC-MS的分析，發(fā)現(xiàn)不同生長時期白蒿的揮發(fā)油主要包含桉葉油素、樟腦、蒎烯、龍腦、母菊薁、乙酸香葉酯、棕櫚酸甲酯、衣蘭烯、花側(cè)柏烯、愈木創(chuàng)烯、長葉蒎烯、萜品烯、植酮、石竹烯、水芹烯等萜烯類、醇類、酯類化合物。生長期白蒿揮發(fā)油中的萜烯類物質(zhì)種類和含量均多于花果期白蒿揮發(fā)油。研究了不同生長時期白蒿中揮發(fā)油的抗氧化生物活性，確定了其對于底物濃度為0.05 mmol/L DPPH自由基的IC50分別為0.40 mg/mL(生長期)和1.66 mg/mL(花果期)。在白蒿生長期提取的揮發(fā)油具有更高的抗氧化活性。本研究為白蒿的深入開發(fā)和利用提供了技術(shù)支持，也為研究類似的天然產(chǎn)物提供了參考。

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This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (Nos. 21773050, 21528501), State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment (Harbin Institube of Technology)(No. 2017DX05), and HIT Environment and Ecology Innovation Special Funds (No. HSCJ201617).

ComponentsandTheirAntioxidantActivityofEssentialOilofHerbaArtimisiaeSieversianaefromDifferentGrowthPeriods

SUN Zhi-Heng, LYU Min-Lan, ZHANG Zhi-Jia, ZHANG Ying, HAN Xiao-Jun*
(MIITKeyLaboratoryofCriticalMaterialsTechnologyforNewEnergyConversionandStorage,StateKeyLaboratoryofUrbanWaterResourceandEnvironment,SchoolofChemistryandChemicalEngineering,HarbinInstituteofTechnology,Harbin150001,China)

The effective exploitation of natural products is of great significance. Herein the essential oil from Herba Artimisiae Sieversianae in growth period and flower/fruit bearing period was extracted by ethanol extraction method. The optimal extraction condition was determined by orthogonal experiment, including extracting 3 times, soaking for 90 min, and the ratios of liquid to solid for Herba Artimisiae Sieversianae in growth period and flower/fruit bearing period were 10 mL∶1 g and 8 mL∶1 g, respectively. The main components of the products were confirmed by FT-IR and GC-MS, which were cineole, camphor, d-borneol, caryophyllene, cadina-1, 4-diene, calamenene, ethyl palmitate, etc. in herba artimisiae sieversianae in growth period, and camphor, caryophyllene, borneol, neryl formate, etc. in Herba Artimisiae Sieversianae in flower/fruit bearing period. The radical scavenging activity of the products was determined. The results showed that the IC50values of the essential oil from Herba Artimisiae Sieversianae in growth period and flower/fruit bearing period for 0.05 mmol/L DPPH solution were 0.40 mg/mL and 1.66 mg/mL, respectively. The essential oil extracted by ethanol from Herba Artimisiae Sieversianae was confirmed to possess good antioxidant activity.

Essential oil of Herba Artimisiae Sieversianae; Ethanol extraction; Radical scavenging activity

26 May 2017; Accepted 26 September 2017)

10.11895/j.issn.0253-3820.170333