黃優(yōu)

572000 海南省第三人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

探討蛋白酶體功能障礙對(duì)散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制的影響

黃優(yōu)

目的探討蛋白酶體功能障礙對(duì)散發(fā)性帕金森病的發(fā)病機(jī)制。方法收集本院2013年7月～2015年7月病例，將存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對(duì)照組，觀察2組患者的行為學(xué)改變情況，通過(guò)RT-PCR、Western blotting分子生物學(xué)方法檢測(cè)患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)表達(dá)水平。結(jié)果觀察組患者血清的α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致散發(fā)性帕金森病患者血液中α-突觸核蛋白(α-Syn)水平升高，考慮該因素可能是散發(fā)性帕金森疾病的危險(xiǎn)因素。

蛋白酶體功能障礙 α-突觸核蛋白(α-Syn) 散發(fā)性帕金森 發(fā)病機(jī)制

帕金森病是一種慢性進(jìn)展性神經(jīng)系統(tǒng)疾病，嚴(yán)重?fù)p害老年人的身體健康和影響老年人的日常生活，并給家庭和社會(huì)帶來(lái)經(jīng)濟(jì)上沉重的負(fù)擔(dān)。在我國(guó)中老年人群中發(fā)病率已達(dá)0.2/100，且呈明顯上升趨勢(shì)[1-2]。臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、動(dòng)作遲緩、運(yùn)動(dòng)減少、肌強(qiáng)直和姿勢(shì)平衡障礙等4大主要特征，除了特征性的運(yùn)動(dòng)障礙等癥狀以外常伴有精神癥狀及認(rèn)知功能障礙，主要表現(xiàn)為抑郁、多疑、思維遲鈍、癡呆、智能低下、幻覺(jué)等。臨床上以平衡障礙一步態(tài)異常為主要癥狀的帕金森病患者往往具有病程進(jìn)展較快，出現(xiàn)抑郁、認(rèn)知障礙、跌倒及殘疾的概率較高的特點(diǎn)。主要的病理特征是出現(xiàn)黑質(zhì)的致密部位多巴胺能神經(jīng)元的選擇性喪失，出現(xiàn)殘存路易小體，該病包括帕金森病癡呆和路易體癡呆，其中90%的患者呈現(xiàn)散在發(fā)生，即散發(fā)性的帕金森病[1]。目前該病主要的治療方法包括藥物及外科手術(shù)治療，但是都只是針對(duì)臨床表現(xiàn)，并不能阻止疾病的進(jìn)程，該病的致殘率較高。該病的病理機(jī)制尚未完全明確，可能與遺傳及環(huán)境因素有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白纖維化是散發(fā)性帕金森病患者導(dǎo)致神經(jīng)元死亡的重要原因[2]。在疾病形成的過(guò)程中α-突觸核蛋白是與該病最為密切的相關(guān)蛋白，具有一定的神經(jīng)毒性，同時(shí)受到脂肪酸的作用，在蛋白酶體功能障礙時(shí)會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)和構(gòu)象變化，泛素-蛋白酶體系是細(xì)胞蛋白的重要系統(tǒng)，可以參與降解蛋白質(zhì)和氧化蛋白質(zhì)[3]。帕金森病患者中黑質(zhì)致密部位氧化損傷的蛋白水平表達(dá)升高。多項(xiàng)研究都表明蛋白酶體可誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，同時(shí)促進(jìn)胞質(zhì)內(nèi)泛素/α-共核蛋白免疫反應(yīng)陽(yáng)性包涵體形成[4]。這提示蛋白酶體障礙對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)病起著重要作用，本研究通過(guò)探討蛋白酶體功能障礙對(duì)散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制的影響，以期為其在散發(fā)性帕金森病發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、細(xì)胞與儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(MBI公司，美國(guó))，辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidas，HRP)標(biāo)記山羊抗兔IgG、HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG(碧云天生物技術(shù)有限公司)，Goat anti-rabbit Ig GHRP，Goat anti-mouse IgG-HRP，α-Syn rabbit polyclonal IgG和β-actin(C4)mouse monoclonal IgG1(購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotechnology公司)，避光4 ℃保存。半干式轉(zhuǎn)移和電泳儀(購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司)。倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)、全能型高性能臺(tái)式冷凍離心機(jī)(Heaeus，BiofugeStratos德國(guó))、深低溫冰箱(SANYO，AltraLow日本)、實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(Rotor-gene3000，澳大利亞)。

1.2 分組

收集本院2013年7月～2015年7月病例，將蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為觀察組，其中女22例，男28例，所有的病例都是初治病例，H&Y分期不超過(guò)2期，其中1期18例，1.5期15例，2期17例，年齡20～70歲，平均年齡(61.25±10.23)歲。未存在蛋白酶體功能障礙的帕金森病患者50例作為對(duì)照組，其中男27例，女23例，年齡0～70歲，平均年齡(64.26±8.56)歲，H&Y分期不超過(guò)2期，其中1期18例，1.5期14例，2期18例。抽取患者的空腹血液，勻漿器充分勻漿，之后將其轉(zhuǎn)移至EP管中，以14 000 r/min離心30 min，取上清液移至新EP管保存，使用前經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白水平。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

①符合帕金森病的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡20～70歲；③納入研究的患者均為接受過(guò)多巴胺受體激動(dòng)劑及左旋多巴制劑的治療；④入組前頭顱影像學(xué)檢查排除帕金森綜合征及多系統(tǒng)萎縮等；⑤依從性強(qiáng)，愿意接受本臨床研究。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn)

①年齡<20歲或>70歲的患者；②存在其他軀體系統(tǒng)疾病，有嚴(yán)重其他系統(tǒng)疾病和惡性腫瘤的患者；③帕金森疊加綜合征、腦血管病、腦炎、一氧化碳中毒及藥物等影響的患者；④患者姿勢(shì)平衡障礙是由于其他疾病引起的；⑤存在嚴(yán)重的記憶障礙，研究對(duì)象的簡(jiǎn)易智力狀態(tài)檢查MMSE<24分者；⑥不愿意接受本臨床研究，依從性差的患者。

1.5 RT-PCR(半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng))

抽取患者的空腹血液，每例血清100mg，提取總RNA。取2μg總RNA行逆轉(zhuǎn)錄cDNA，反應(yīng)體系為20 μl；吸取逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μl，分別加入18sRNA、α-Syn的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)條件均為95 ℃預(yù)變性5 mins，94 ℃變性30 s，60 ℃30 s，72 ℃60 s，72 ℃7 mins，循環(huán)30次；PCR產(chǎn)物溴化乙錠1.5%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下進(jìn)行觀察并拍攝電泳圖像；以18sRNA作為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR產(chǎn)物的半定量分析，測(cè)量各電泳條帶之吸光度積分值(A值)。

1.6 Western blotting

取血清提取100 mg總蛋白；SDS-PAGE凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)膜，加α-Syn一抗(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗(1∶1000)37 ℃孵育1 h；ECL光化學(xué)法顯色，用彩色圖像分析系統(tǒng)測(cè)定吸光度。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 α-Syn mRNA表達(dá)水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表1 α-Syn mRNA表達(dá)水平的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

2.2 α-Syn蛋白表達(dá)水平

觀察組患者的血清α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)(表2)。

表2 α-Syn蛋白表達(dá)水平的比較

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05；與治療前比較，△P<0.05

3 討 論

帕金森病是臨床上的常見(jiàn)神經(jīng)退行性疾病，與選擇性的中腦黑質(zhì)致密部位的多巴胺能神經(jīng)元丟失和退化相關(guān)，主要特征是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的變性[5]。最新的研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體受到抑制可以導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的死亡，形成胞質(zhì)的泛素-α-共核蛋白免疫反應(yīng)包涵體使神經(jīng)元退變，伴隨著黑質(zhì)致密部位多巴胺的喪失，出現(xiàn)神經(jīng)元的損傷。有研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體受損之后多巴胺能神經(jīng)元會(huì)使蛋白酶抑制劑敏感性提高，個(gè)別神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，通過(guò)選擇性損傷機(jī)制促使神經(jīng)細(xì)胞的氧自由基的增多，需要蛋白酶體來(lái)清除這些受損的蛋白[6-8]。蛋白酶體抑制劑選擇性損害多巴胺能神經(jīng)元可能與α-共核蛋白削弱了突觸囊泡對(duì)多巴胺的儲(chǔ)存，從而進(jìn)一步增加了胞漿內(nèi)多巴胺及氧自由基，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞氧化受損有關(guān)[9-11]。

目前臨床尚未明確α-突觸核蛋白的正常功能，在多數(shù)散發(fā)性帕金森病患者中未發(fā)現(xiàn)其基因突變，提示α-Syn 可能在散發(fā)性帕金森病發(fā)病中起著重要作用。泛素蛋白酶體系統(tǒng)是α-Syn的主要降解途徑，如果發(fā)生障礙則會(huì)導(dǎo)致α-Syn 聚集，從而誘發(fā)散發(fā)性帕金森病的發(fā)病[12]。研究發(fā)現(xiàn)蛋白酶體成為影響細(xì)胞功能的重要藥物靶點(diǎn)，該靶點(diǎn)的抑制劑在臨床研究中被廣泛應(yīng)用，α-共核蛋白的生理功能尚不清楚，同時(shí)散發(fā)性帕金森病患者機(jī)體內(nèi)的α-共核蛋白量增高[13-14]。通過(guò)多種翻譯后修飾形式，引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡，中腦黑質(zhì)內(nèi)多種細(xì)胞、生化及分子改變已被發(fā)現(xiàn)，散發(fā)性帕金森病患者蛋白酶體α亞單位丟失，蛋白酶體活化因子表達(dá)下降，水解功能減弱[15]。大量的研究表明在帕金森病發(fā)病機(jī)制中蛋白酶體功能下降起重要作用，參與了黑質(zhì)的神經(jīng)元內(nèi)蛋白質(zhì)聚集及神經(jīng)元變性[16]。本研究結(jié)果顯示，觀察組α-突觸核蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。這提示蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致患者血清中的α-突觸核蛋白(α-Syn)形成，考慮該因素可能是散發(fā)性帕金森病的危險(xiǎn)因素。蛋白酶體功能不能得到恢復(fù)，影響氧化受損的蛋白質(zhì)的降解，從而降低了蛋白酶體的清除能力，同時(shí)氧化受損的蛋白集聚增多，從而造成惡性循環(huán)，導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[17]。

綜上所述，蛋白酶體功能障礙可能導(dǎo)致α-Syn血液中的聚集釋放，也可能是發(fā)生散發(fā)性帕金森病的重要危險(xiǎn)因素。蛋白酶體功能下降可引起多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)α-共核蛋白聚集，從而導(dǎo)致細(xì)胞功能的紊亂，最終促進(jìn)了多巴胺能神經(jīng)元的凋亡。

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R742.5

A

1007-0478(2017)05-0455-03

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.05.019

(2016-09-21收稿)