屈泰龍，李潤成，羅斌宇，葛 猛，嚴(yán)美君，胡輝燦，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

湖南省健康豬群中不同基因型豬博卡病毒流行性及進(jìn)化分析

屈泰龍，李潤成，羅斌宇，葛 猛，嚴(yán)美君，胡輝燦，余興龍

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

為了解豬博卡病毒在不同年齡健康豬群中的感染情況，通過對(duì)GenBank登錄的豬博卡病毒基因序列分析設(shè)計(jì)2對(duì)引物可分別擴(kuò)增PBoV1/2的部分NS1基因和PBoV3/4/5的部分VP1基因。提取2016年8-12月收集自湖南5個(gè)集約化豬場(chǎng)2～20周齡豬共430份肛門拭子樣品的DNA并進(jìn)行PCR檢測(cè)。PBoV陽性率為64.6%(278/430)，PBoV1/2陽性率為27.2%(117/430)，PBoV3/4/5陽性率為45.1%(194/430)，混合感染率為7.7%(33/430)，PBoV3/4/5陽性率顯著高于PBoV1/2陽性率(P=0.034)。PBoV1/2在 2～10周檢出率高于其他周齡，但是與其他周齡豬體內(nèi)檢出率統(tǒng)計(jì)分析無顯著性差異，PBoV3/4/5主要感染8～16周豬，與4周以內(nèi)豬差異顯著，與其他豬群差異不顯著。對(duì)各型的核苷酸與參考序列核苷酸相似性分析顯示PBoV1/2之間的平均相似度為85.4%，PBoV3/4/5之間的平均相似度為67.2%。PBoV在健康豬群中流行廣泛且存在共同感染現(xiàn)象，對(duì)豬的健康尤其是腸道微生物平衡可能存在潛在影響。

豬博卡病毒；流行性；進(jìn)化分析；混合感染；致病性

豬博卡病毒(Porcinebocavirus， PBoV)屬于細(xì)小病毒科博卡病毒屬，主要感染豬，2009年首次從患有仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征的仔豬體內(nèi)鑒定[1]。隨后，在許多國家均有報(bào)道豬群受該病毒感染，并獲得了全基因組或者部分基因[2-4]。根據(jù)堿基相似性將PBoV分為5個(gè)基因型，通過基因差異設(shè)計(jì)了引物用于PCR檢測(cè)，加快了該病毒的流行病學(xué)調(diào)查[5-6]。目前對(duì)于該病毒的調(diào)查多集中在發(fā)病豬，如腹瀉、咳嗽等，陽性率不等[7-10]，為該病的流行病學(xué)規(guī)律提供了一定的基礎(chǔ)知識(shí)。有部分研究人員對(duì)健康豬進(jìn)行了PBoV感染情況調(diào)查，但是因?yàn)檎{(diào)查樣本數(shù)量太少，因此不能準(zhǔn)確說明PBoV在健康豬群中的流行情況[11]。我們?cè)诤鲜?nèi)調(diào)查了5個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)健康豬群中PBoV的流行情況，以期為了解PBoV對(duì)豬潛在的影響提供信息。

1 材料和方法

1.1樣品收集

2016年8-12月，于不同豬場(chǎng)采集430份肛門拭子。樣品采集于湖南省3個(gè)市5個(gè)集約化豬場(chǎng)，來自于不同豬群的豬：2～20周(間隔2周采集1次)，采樣豬均健康，無腹瀉癥狀。A、B、C 3個(gè)豬場(chǎng)每個(gè)階段采集8份樣本，D和E每個(gè)階段采集10份樣本(D場(chǎng)20周齡豬無樣本)。采集樣品時(shí)，每份拭子單獨(dú)存放于一個(gè)滅菌離心管，并于低溫條件下運(yùn)送至湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院病原分子與診斷實(shí)驗(yàn)室。

1.2樣品處理和病毒DNA提取

分別向含拭子的離心管中加入500 μL生理鹽水，漩渦振蕩混勻，于7 500 r/min 離心5 min。取離心后的上清液200 μL采用DNAout kit(北京天恩澤基因科技有限公司)提取DNA，操作步驟按說明書執(zhí)行。

1.3引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增

下載GenBank內(nèi)登錄的PBoV基因序列，經(jīng)比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)在PBoV1/2型的NS1基因和PBoV3/4/5型的VP1基因存在一定的保守區(qū)域，在這2處分別設(shè)計(jì)引物(表1)，可對(duì)應(yīng)擴(kuò)增PBoV1/2型NS1基因和PBoV3/4/5型VP1基因的部分序列。將PBoV1/2、PBoV3/4/5的PCR產(chǎn)物測(cè)序經(jīng)驗(yàn)證后分別構(gòu)建至pMD19-T載體，并將其做101～108稀釋用于PCR方法的敏感性檢測(cè)；使用以上2對(duì)引物分別擴(kuò)增豬圓環(huán)病毒2型(Porcinecircovirus2，PCV2)、豬細(xì)小病毒(Porcineparvovirus，PPV)、PEDV(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)和豬撒佩羅病毒(Porcinesapelovirus，PSV)的DNA或cDNA及PBS；分別使用2對(duì)引物對(duì)肛門拭子的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，20 μL PCR反應(yīng)體系包含：2×Mix 10 μL，10 mmol/L 上下游引物各0.2 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補(bǔ)足至20 μL。PCR反應(yīng)采用如下程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

表1 PBoV1/2和PBoV3/4/5擴(kuò)增引物信息Tab.1 Primers information for PBoV1/2 and PBoV3/4/5

1.4測(cè)序及進(jìn)化分析

將經(jīng)2對(duì)引物擴(kuò)增為陽性的部分樣品DNA經(jīng)純化后送Qsingke生物測(cè)序，所得序列與GenBank內(nèi)PBoV1/2型、PBoV3/4/5型序列進(jìn)行進(jìn)化分析。將序列經(jīng)MAFFT軟件比對(duì)，DAMBE軟件進(jìn)行序列飽和度檢測(cè)，Jmodeltest程序分析最佳堿基進(jìn)化模型，根據(jù)以上信息用MEGA 6軟件選擇合適參數(shù)構(gòu)建Maximum likelihood (ML ) tree。

1.5統(tǒng)計(jì)分析

將樣本內(nèi)PBoV1/2型和PBoV3/4/5檢測(cè)結(jié)果匯總于Excel 2010：同一豬場(chǎng)不同周齡樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)作為一組，共有5組，每組8～10個(gè)數(shù)據(jù)；同一周齡不同豬場(chǎng)樣本的檢測(cè)數(shù)據(jù)作為一組，共有10組，每組5個(gè)數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)用單因素方差分析(IBM SPSS Statistics 19軟件的)方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，置信區(qū)間設(shè)置為95%，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1PCR引物擴(kuò)增特異性和敏感性

分別使用引物擴(kuò)增樣品及PCV2、PPV、PEDV、PSV的DNA或cDNA及PBS，僅從各自對(duì)應(yīng)的樣品中擴(kuò)增到陽性信號(hào)，而其他對(duì)照均為陰性(圖1-A、B)。將稀釋至不同濃度的質(zhì)粒pMDT-PBV1/2和pMDT-PBV3/4/5分別用PBoV1/2F和PBoV1/2R引物擴(kuò)增，引物PBoV1/2最低可擴(kuò)增拷貝數(shù)為38 拷貝/mL，PBoV3/4/5最低可擴(kuò)增拷貝數(shù)為94拷貝/mL(圖1-C、D)。

2.2PBoV流行性檢測(cè)

PBoV陽性率為64.6%(278/430)，PBoV1/2陽性率為27.2%(117/430)，PBoV3/4/5陽性率為45.1%(194/430)，混合感染率為7.7%(33/430)，PBoV3/4/5陽性率顯著高于PBoV1/2(P=0.034)。

將檢測(cè)數(shù)據(jù)按照不同周齡和不同豬場(chǎng)總陽性率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，PBV1/2周齡總陽性率為2.9%～43.2%，其中2周齡仔豬樣本內(nèi)檢出率最高為43.2%(19/44)，隨著年齡的增長，陽性率呈現(xiàn)漸低趨勢(shì)，至20周陽性率為2.9%(1/43)。對(duì)不同豬場(chǎng)的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，陽性率達(dá)到30%以上的豬場(chǎng)有A(36.3%，29/80)和B(32.5%，26/80)，其余豬場(chǎng)陽性率從高到低依次為C(28.7%，23/80)，D(22.2%，20/90)和E(25.0%，25/100)。將各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)陽性率和周齡陽性率分別進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果各個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)之間PBoV1/2陽性率無顯著差異，周齡差異顯著性分析顯示，除20周陽性率顯著低于2～10周齡檢出率外，其他各周齡之間無顯著差異，詳細(xì)數(shù)據(jù)見表2。

A、B分別為PBoV1/2、PBoV3/4/5引物特異性檢測(cè)結(jié)果：M.DL2000；1.樣本DNA；2.PBS;3.PCV2;4.PPV;5.PEDV;6.PSV。C、D分別為PBoV1/2、PBoV3/4/5引物擴(kuò)增梯度稀釋質(zhì)粒結(jié)果：M.DL2000；N1～N8分別為質(zhì)粒101～108稀釋倍數(shù)；PBoV1/2引物最高可擴(kuò)增稀釋倍數(shù)為107；含拷貝數(shù)為38拷貝/mL；PBoV3/4/5引物最高可擴(kuò)增稀釋倍數(shù)為106；含拷貝數(shù)為94拷貝/mL。

A，B are specify amplification result of primer forPBoV1/2 andPBoV3/4/5，respectively： M.DNA Ladder 2000；1.Target DNA (PBov1/2 or PBoV3/4/5)；2.PBS；3.PCV2；4.PPV；5.PEDV；6.PSV.C,D.Amplification results using primers forPBoV1/2 andPBoV3/4/5 with gradient dilution plasmid：M.DNA Ladder 2000；N1-N8.Dilutions of Plasmid with target gene from 101-108，the minimum amplification copies number forPBoV1/2 andPBoV3/4/5 are 38，94 copies/mL，respectively.

圖1 PBoV引物特異性及敏感性檢測(cè)Fig.1 Specify and sensitivity of primers for PBoV amplification

PBoV3/4/5周齡總陽性率為4.5%～68.2%，總陽性率從2周齡最低(4.5%，2/44)至8周齡時(shí)達(dá)到最高(68.2%，30/44)，隨后陽性率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，20周齡樣本檢出率為32.3%(11/43)。將不同周齡的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，根據(jù)SPSS統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)差異性分析將數(shù)據(jù)分為3組，1組：8，10，12，16周；2組：6，14，18，20周；3組：2，4周。3個(gè)小組各組內(nèi)數(shù)據(jù)無顯著差異，1組內(nèi)各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)與2組內(nèi)各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)，2組內(nèi)各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)與3組內(nèi)各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)之間無顯著差異，但1組內(nèi)各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)與3組各年齡段檢測(cè)數(shù)據(jù)之間差異顯著，1組、2組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但1組數(shù)據(jù)平均值高于2組，詳見表3。

根據(jù)不同豬場(chǎng)總陽性率統(tǒng)計(jì)顯示D(71.1%，64/90)和C(66.3%，53/80)最高，隨之B(30.0%，24/80)、E(29.0%，29/100)和A(26.3%，21/80)逐漸降低。D和C 2個(gè)豬場(chǎng)內(nèi)陽性率顯著(P<0.05)高于B、E和A豬場(chǎng)陽性率(表4)。

2.3進(jìn)化分析

將擴(kuò)增樣品所得序列分別與GenBank內(nèi)下載的序列進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，經(jīng)DAMBE軟件分析，Iss數(shù)值小于Iss.cSym，且差異顯著(P<0.05，表5)，堿基序列進(jìn)化度未飽和，可做進(jìn)化分析。將試驗(yàn)所得序列與參考序列構(gòu)建ML進(jìn)化樹(圖2)，2對(duì)引物擴(kuò)增所得序列分別與相對(duì)應(yīng)的參考序列歸為一支，PBV1/2試驗(yàn)序列與參考序列平均堿基相似性為85.4%，除了與參考序列JN400876(堿基相似性42.3%～46.7%)距離較遠(yuǎn)，與其他多數(shù)PBoV1/2型參考序列親緣關(guān)系較近(堿基相似性80.1%～99.6%)。試驗(yàn)所得序列之間平均堿基相似性為94%，彼此之間的堿基相似性為83.7%(Y6-1與2-1)～99.8%(Y4-2和Y4-3)，尤其是來源于同一豬場(chǎng)的樣品(Y系列)彼此之間的相似性為91.8%～99.8%。PBoV3/4/5平均堿基相似性為67.2%，可分為2支，其中有8條序列單獨(dú)分為一簇，彼此之間的堿基相似性為68.5%～98.0%，另外8條序列與其余參考序列分為一簇，彼此之間的堿基相似性為68.4%～89.8%。

表3 不同豬群中PBoV3/4/5陽性率Tab.3 The positive rate of PBoV3/4/5 in different pig groups %

表4 PBoV3/4/5按照不同周齡和豬場(chǎng)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果Tab.4 t-test of PBoV3/4/5 based on age and farm

注：表內(nèi)數(shù)據(jù)為平均值加減標(biāo)準(zhǔn)差；其中a～d為按周齡分組統(tǒng)計(jì)時(shí)差異顯著標(biāo)識(shí)；e和f為按豬場(chǎng)統(tǒng)計(jì)是差異顯著標(biāo)識(shí)；不同小寫字母表示差異顯著。

Note： Data of the calculations displayed as mean value added and subtract with standard deviation; a-d mean significant differences based on age;while e and f mean significant differences based on farm; Different lowercase indicate significant differences.

表 5 堿基進(jìn)化飽和度檢測(cè)Tab.5 Test of nucleotides substitution saturation

3 討論

目前PBoV共有5個(gè)基因型，主要有3個(gè)ORF，分別編碼NS1、NP1和VP1/VP2[11-12]。曾有研究人員試圖建立3個(gè)ORF的ELISA方法并希望可用于血清學(xué)調(diào)查研究[13]。但是根據(jù)3個(gè)ORF氨基酸同源性分析，基因型之間氨基酸相似度為29.4%～48.4%，基因型內(nèi)氨基酸相似度為73.3%～99.5%，均存在較大差異，因此，不能夠準(zhǔn)確地對(duì)臨床樣品進(jìn)行流行型檢測(cè)[14-15]。通過對(duì)GenBank內(nèi)登錄PBoV基因組進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)PBoV1型和PBoV2型之間、PBoV3、PBoV4和PBoV5型之間的序列比較接近，設(shè)計(jì)2對(duì)引物，構(gòu)建PCR檢測(cè)方法，可分別特異性擴(kuò)增相對(duì)應(yīng)的基因型。

文獻(xiàn)報(bào)道PBoV在病豬(腹瀉，PMWS等)的陽性率為20%～100%[10,16]，在健康豬群中的陽性率為6%～56%[8,17]。Blomstr?m等[1]對(duì)34頭患有PMWS和24頭健康豬進(jìn)行PBoV-like (經(jīng)過比對(duì)分析為PBoV1)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)患有PMWS的豬PBoV檢出率為88%，而無PMWS癥狀的豬體內(nèi)PBoV檢出率為46%。PCR檢測(cè)陽性率差異性有2個(gè)主要原因，其一由于PBoV堿基序列差異性較大，而不同的研究團(tuán)隊(duì)所使用的引物擴(kuò)增靶序列的基因型有很大差異，多數(shù)為某單一基因型；其二，每個(gè)團(tuán)隊(duì)調(diào)查的豬群健康狀況不一致，甚至豬群年齡構(gòu)成有很大差異。我們?cè)O(shè)計(jì)了可有效擴(kuò)增PBoV1/2、PBoV3/4/5的引物，同時(shí)對(duì)不同年齡的健康豬進(jìn)行了檢測(cè)，系統(tǒng)的檢測(cè)了豬群中PBoV的流行狀況。試驗(yàn)樣品共有430份健康豬肛門拭子，其中PBoV陽性率為64.6%，PBoV1/2陽性率為27.2%，PBoV3/4/5陽性率為45.1%，混合感染率為7.7%，表明湖南省內(nèi)PBoV3/4/5陽性率高于PBoV 1/2流行型。2周齡仔豬PBoV1/2便有較高陽性率，且隨著年齡的增長檢出率逐漸降低，表明仔豬易感，而隨著年齡增大，PBoV1/2對(duì)豬的感染能力下降，母豬可能未曾感染，因此無相應(yīng)的抗體，而仔豬也無從獲得相應(yīng)母源抗體。PBoV3/4/5總陽性率則呈先升高后降低趨勢(shì)，2周齡時(shí)僅在D豬場(chǎng)有陽性樣本，其余豬場(chǎng)檢測(cè)均為陰性。2周齡之后年齡段豬群中均有陽性，表明PBoV3/4/5可感染所有豬群，而2周齡核酸檢測(cè)陽性率低可能是母源抗體的保護(hù)。從以上結(jié)果及分析可以得知：PBoV3/4/5對(duì)豬的感染能力可能強(qiáng)于PBoV1/2。PBoV3/4/5在肥豬群(8～16周)陽性率明顯高于PBoV1/2型陽性率，也說明PBoV3/4/5感染能力或者在豬體內(nèi)適應(yīng)性強(qiáng)于PBoV1/2。觀察分析PBoV3/4/5感染規(guī)律：2～8周齡感染率逐漸上升，在8周齡達(dá)到最高值(68.2%)并在8～12周齡保持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定陽性率，12周齡后呈下降趨勢(shì)，至20周齡時(shí)，陽性率為32.4%。這個(gè)感染規(guī)律與PCV2感染規(guī)律相一致。5個(gè)豬場(chǎng)中有2個(gè)豬場(chǎng)免疫PCV2疫苗5年以上(C和D場(chǎng))，2個(gè)免疫PCV2疫苗2.5年左右(B和E場(chǎng))，1個(gè)未免疫過PCV-2疫苗(A場(chǎng))。通過對(duì)PBoV1/2和PBoV3/4/5統(tǒng)計(jì)分析，本研究發(fā)現(xiàn)，隨著豬場(chǎng)內(nèi)PCV-2免疫時(shí)間的增長，PBoV1/2陽性率逐漸降低，而PBoV3/4/5陽性率則逐漸升高。PCV2感染主要導(dǎo)致機(jī)體的免疫系統(tǒng)功能性下降，而PCV2疫苗免疫則可以預(yù)防PCV2感染，從而使機(jī)體免疫系統(tǒng)保持相對(duì)健康。因此，PBoV1/2感染隨PCV2疫苗免疫時(shí)間增長而下降。PBoV3/4/5隨著豬場(chǎng)中PCV2疫苗免疫時(shí)間的增長而呈現(xiàn)逐漸升高的現(xiàn)象是比較出乎意料的.目前這兩者之間的相關(guān)性未有相關(guān)報(bào)道，因此需要進(jìn)一步加強(qiáng)研究以闡明相關(guān)性。由于目前PBoV尚未有效的體外培養(yǎng)方法，無法實(shí)施試驗(yàn)控制條件下的攻毒試驗(yàn)，因此對(duì)其具體致病性理解仍需加強(qiáng)相關(guān)研究。

ML進(jìn)化樹采用MEGA 6軟件繪制，采用Tamura-Nei model和Gamma distributed 模型，自展值(Bootstrap)設(shè)定為1 000，比對(duì)中產(chǎn)生的空格在進(jìn)化樹構(gòu)建過程中均刪除。A.PBoV1/2共有15條樣本序列(標(biāo)記為●)，7條參考序列，樣本序列長度為445～451 bp。B.PBoV3/4/5共有16條樣本序列(標(biāo)記為■)，17條參考序列，樣本序列長度為504～543 bp。

Maximum likelihood tree was conducted using MEGA 6 with Tamura-Nei model and Gamma distributed model with Bootstrap of 1 000 and the gap during alignment was complete delete.A.15 obtained (marked with ●) and 7 reference PBoV1/2 with 445-451 bp；B.16 obtained (marked with ■) and 17 reference PBoV3/4/5 with 504-543 nucleotides.

圖2PBoV樣本序列與參考序列進(jìn)化分析
Fig.2PhylogeneticanalysisofPBoVbasedonobtainedandreferencesequences

PBoV各型之間NS1或VP1基因有一段保守序列，可用于設(shè)計(jì)引物[12,18-19]。本研究設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增序列高度變異，經(jīng)與參考序列比對(duì)分析堿基相似度85.4%(NS1)，67.2%(VP1)。由于PBoV全基因組差異較大，因此擴(kuò)增相對(duì)麻煩，用全基因組進(jìn)化分析也比較難以進(jìn)行。許多研究團(tuán)隊(duì)采用NS1或VP1代替全基因組進(jìn)行進(jìn)化，雖然有一定差異，但總體具有可信度[20]。進(jìn)化分析顯示樣本序列與參考序列交叉分布，進(jìn)一步說明樣本序列核酸的多態(tài)性。

2010年，該病毒僅在瑞典和中國有報(bào)道[21]，但是，目前該病毒已在許多國家豬群中存在[7,22-23]。國際間種豬及豬肉加工產(chǎn)品的貿(mào)易日益頻繁，但是PBoV并未列入入境檢驗(yàn)檢疫范圍，因此，在某種程度上促進(jìn)了該病毒在國際間的流通。PBoV無論是在健康豬群中還是發(fā)病豬群中均有一定比例的檢出率，該病對(duì)于豬的健康狀況是否存在影響還不能確定，因此需要進(jìn)一步加強(qiáng)對(duì)該病毒的研究。

[1] Blomstr?m A L，Belák S，F(xiàn)ossum C，et al.Detection of a novelPorcineboca-likevirusin the background ofPorcinecircovirustype 2 induced postweaning multisystemic wasting syndrome[J].Virus Research，2009，146(1/2)：125-129.

[2] Liu M，Li Y，Sun D，et al.Detection and genetic analysis ofPorcinebocavirusin different swine herds in North Central China[J].The Scientific World Journal，2014，2014(3)：947084.

[3] Cheung A K，Wu G，Wang D，et al.Identification and molecular cloning of a novelPorcineparvovirus[J].Archives of Virology，2010，155(5)：801-806.

[4] Huang J，Mor S K，Erber J，et al.Detection and characterization ofPorcinebocavirusin the United States[J].Archives of Virology，2014，159(7)：1797-1801.

[5] 蔡雨函，朱 玲，周遠(yuǎn)成，等.豬博卡病毒雙重PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2013(8)：833-838.

[6] 付朋飛，李夢(mèng)奇，喬 涵，等.豬博卡病毒1型/2型PCR檢測(cè)方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2016，38(7)：572-575.

[7] Mcmenamy M J，Mckillen J，Mcnair I，et al.Detection of aPorcineboca-likevirusin combination withPorcinecircovirustype 2 genotypes andTorquetenosusvirusin pigs from postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS-affected farms in archival samples from Great Britain[J].Veterinary Microbiology，2013，164(3/4)：293-298.

[8] Ndze V N，Cadar D，Cságola A，et al.Detection of novelPorcinebocavirusesin fecal samples of asymptomatic pigs in Cameroon[J].Infection，Genetics and Evolution ：Journal of Molecular Epidemiology and Evolutionary Genetics in Infectious Diseases，2013，17(3)：277-282.

[9] Shan T，Lan D，Li L，et al.Genomic characterization and high prevalence of Bocaviruses in swine[J].PLoS One，2011，6(4)：e17292.

[10] Zhai S，Yue C，Wei Z，et al.High prevalence of a novelPorcinebocavirusin weanling piglets with respiratory tract symptoms in China[J].Archives of Virology，2010，155(8)：1313-1317.

[11] Yang W Z，Yu J M，Li J S，et al.Genome characterization of a novelPorcinebocavirus[J].Archives of Virology，2012，157(11)：2125-2132.

[12] Blomstr?m A L，St?hl K，Okurut A R，et al.Genetic characterisation of aPorcinebocavirusdetected in domestic pigs in Uganda[J].Virus Genes，2013，47(2)：370-373.

[13] 李 彬，毛 立，何孔旺，等.豬博卡病毒NP1基因的克隆與原核表達(dá)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2011，26(3)：28-31.

[14] Wang E，Liu W，Yang B，et al.Complete sequence and phylogenetic analysis of aPorcinebocavirusstrain swBoV CH437[J].Virus Genes，2014，48(2)：387-390.

[15] 周 宇，唐連飛，朱事康，等.豬博卡病毒的基因分型[J].中國動(dòng)物檢疫，2015(2)：63-68.

[16] Lau S K，Woo P C，Yip C C，et al.Co-existence of multiple strains of two novel porcine bocaviruses in the same pig，a previously undescribed phenomenon in members of the family Parvoviridae，and evidence for inter- and intra-host genetic diversity and recombination[J].Journal of General Virology，2011，92(9)：2047-2059.

[17] Amimo J O，El Zowalaty M E，Githae D，et al.Metagenomic analysis demonstrates the diversity of the fecal virome in asymptomatic pigs in East Africa[J].Archives of Virology，2016，161(4)：887-897.

[18] Cheng W X，Li J S，Huang C P，et al.Identification and nearly full-length genome characterization of novelPorcinebocaviruses[J].PLoS One，2010，5(10)：e13583.

[19] 胡軍勇，張 倩，王丹丹，等.豬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其初步流行病學(xué)調(diào)查[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2012，34(8)：632-636.

[20] 周 宇，唐連飛，朱事康，等.兩株豬博卡病毒的檢測(cè)及遺傳演化分析[J].中國獸醫(yī)雜志，2014，50(10)：9-12.

[21] 翟少倫，岳 城，韋祖樟，等.豬博卡病毒PCR檢測(cè)方法的建立及其應(yīng)用[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào)，2010，18(2)：14-17.

[22] Zhang Q，Zhang C，Gao M，et al.Evolutionary，epidemiological，demographical，and geographical dissection ofPorcinebocavirusin China and America[J].Virus Research，2015，195(195)：13-24.

[23] Zhou F，Sun H，Wang Y.Porcinebocavirus：achievements in the past five years[J].Viruses，2014，6(12)：4946-4960.

PrevalenceandPhylogeneticAnalysisofMultiplePorcinebocavirusGenotypesinClinicallyHealthyPigsinHunanProvince

QU Tailong，LI Runcheng，LUO Binyu，GE Meng，YAN Meijun，HU Huican，YU Xinglong

(Veterinary Faculty，Hunan Agricultural University，Changsha 410128，China)

To evaluate the prevalence of PBoV in healthy pig in different age，primers targeting to partialNS1 gene of PBoV1/2 andVP1 gene of PBoV3/4/5 were designed based on the analysis of PBoV sequences from GenBank.Total 430 anal swab species were collected from 5 pig farms with the pig′age of 2-20 weeks from August to December 2016 in Hunan Province.The total positive rate of PBoV was 64.6% (278/430)，PBoV1/2 for 27.2%(117/430)，PBoV3/4/5 for 45.1%(194/430) and with 7.7%(33/430) positive rate of coinfection.The mainly infection age of PBoV1/2 ranged 2-10 weeks，and PBoV3/4/5 from 8-16 weeks.The average nucleotide identity of obtained sequences and references of PBoV1/2 and PBoV3/4/5 was 85.4% and 67.2%，respectively.High prevalence and coinfection were observed in clinically healthy pigs，which may cause potential effect to the microbes in the gut.

PBoV; Prevalence; Phylogenetic analysis; Coinfection; Pathogenicity

2017-07-22

湖南省戰(zhàn)略性新興產(chǎn)業(yè)科技攻關(guān)類項(xiàng)目(2016GK4015)

屈泰龍(1986-)，男，河南開封人，在讀博士，主要從事動(dòng)物疫病防控研究。

余興龍(1965-)，男，湖南岳陽人，教授，博士，博士生導(dǎo)師，主要從事畜禽疫病的診斷、分子病毒學(xué)與基因工程研究。

S855.3

A

1000-7091(2017)05-0136-06

10.7668/hbnxb.2017.05.021