王興紅

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300；2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

柑橘黑斑病菌的分子檢測(cè)技術(shù)研究

王興紅1，2

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心，北京 102300；2.浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

為了快速區(qū)分柑橘黑斑病菌、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌、首都葉點(diǎn)霉菌和中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌，在ITS1和18S區(qū)域設(shè)計(jì)了針對(duì)柑橘黑斑病菌、首都葉點(diǎn)霉菌和中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌的上游引物，以ITS4作為下游引物，并對(duì)所設(shè)計(jì)引物的特異性和退火溫度進(jìn)行了篩選，對(duì)引物的靈敏度進(jìn)行了驗(yàn)證，并進(jìn)行了果園疑似病斑的檢測(cè)。結(jié)果表明，在退火溫度為60 ℃時(shí)，引物Pc1/ITS4僅能從柑橘黑斑病菌中擴(kuò)增出593 bp的特異性條帶，引物Pct4/ITS4僅能從首都葉點(diǎn)霉菌中擴(kuò)增出551 bp的條帶，引物Pcc1/ITS4僅能從中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌中擴(kuò)增出706 bp的條帶，不能從柑橘常見病害病原菌中擴(kuò)增出任何條帶。特異性引物的靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明，引物Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的檢測(cè)靈敏度為200 pg，引物Pcc1/ITS4的檢測(cè)靈敏度為20 pg。篩選的特異性引物Pc1/ITS4可以對(duì)果園疑似柑橘黑斑病病斑進(jìn)行檢測(cè)。因此，利用設(shè)計(jì)的特異性引物Pc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pcc1/ITS4，結(jié)合簡(jiǎn)單的病原菌基因組DNA提取方法，可以在短時(shí)間內(nèi)完成對(duì)病原菌的分子檢測(cè)。

柑橘黑斑病；柑橘黑斑病菌；中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌；首都葉點(diǎn)霉菌；特異性引物

柑橘黑斑病(Citrusblack spot，CBS)，由柑橘黑斑病菌(Phyllostictacitricarpa，有性態(tài)為柑橘球座菌Guignardiacitricarpa)引起，病原菌主要侵染柑橘的果實(shí)并在果皮上形成多種類型的病斑而導(dǎo)致柑橘果實(shí)的商品性下降[1-5]。柑橘黑斑病在澳洲、南美洲、南非以及我國(guó)各柑橘產(chǎn)區(qū)發(fā)生普遍[6-8]，但該病害尚未在歐盟等地區(qū)發(fā)生，歐盟、美國(guó)等將柑橘黑斑病菌列為A1類禁止入境的有害生物[9]，這些國(guó)家對(duì)進(jìn)口的柑橘果實(shí)都要進(jìn)行嚴(yán)格的檢驗(yàn)，一旦發(fā)現(xiàn)病果即作通報(bào)甚至是退貨處理。因此，急需能夠快速準(zhǔn)確鑒定柑橘黑斑病菌的技術(shù)，使被檢測(cè)果實(shí)快速通關(guān)，防止由于長(zhǎng)時(shí)間滯留，水果商品量下降，也防止帶病菌果實(shí)傳入其他國(guó)家，造成病菌傳播。

目前檢測(cè)柑橘黑斑病的技術(shù)包括癥狀的診斷、利用顯微鏡檢查病原菌、病原菌的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和分子生物學(xué)快速檢測(cè)等。癥狀的診斷和顯微鏡觀察需要豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，而且病害發(fā)展初期病斑一般無子實(shí)體，錯(cuò)誤判斷的可能性較大；而傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)需要至少一周時(shí)間，對(duì)急需通關(guān)的柑橘來說并不實(shí)用。因此，Bonants等[10]在ITS區(qū)域設(shè)計(jì)了針對(duì)柑橘黑斑病菌的特異性引物GCF3/GCR7，該引物能夠快速檢測(cè)帶有分生孢子和沒有分生孢子的病斑，該方法優(yōu)于歐盟的7 d分離培養(yǎng)鑒定方法，但是該方法在單個(gè)病斑檢測(cè)方面效率比較低。Meyer等[11]在ITS區(qū)域設(shè)計(jì)能夠區(qū)分致病菌-柑橘球座菌和非致病菌-芒果球座菌(Guignardiamangiferae)(經(jīng)Glienke等[12]研究為首都葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictacapitalensis))的特異性引物CITRICI/ITS4和CAMEL2/ITS4，利用該引物結(jié)合快速提取病斑基因組DNA的方法，可以在1 d內(nèi)完成對(duì)病原菌的檢測(cè)，大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，但靈敏度較低。Peres等[13]對(duì)Bonants和Meyer等[10-11]所設(shè)計(jì)引物的特異性和靈敏度進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)這些引物靈敏度較低，尤其在檢測(cè)單個(gè)病斑時(shí)，效率非常低，因此Peres等[13]在ITS區(qū)域重新設(shè)計(jì)針對(duì)致病性菌-柑橘球座菌和非致病菌-芒果球座菌 (經(jīng)Glienke等[12]研究為首都葉點(diǎn)霉菌)的特異性引物GCN/GCMR和GMN/GCMR，該引物能夠快速有效地對(duì)單個(gè)病斑進(jìn)行檢測(cè)。Mpevan等[14]在ITS區(qū)域設(shè)計(jì)探針，利用Real-time PCR方法檢測(cè)柑橘黑斑病菌，該方法比傳統(tǒng)PCR靈敏度更高，可用于快速準(zhǔn)確區(qū)分柑橘黑斑病菌和芒果球座菌(經(jīng)Glienke等[12]研究為首都葉點(diǎn)霉菌)，但該方法受實(shí)驗(yàn)室條件的限制較大。Meyer等[15]利用巢式PCR法快速區(qū)分南非柑橘上的柑橘黑斑病菌和芒果球座菌 (經(jīng)Glienke等[12]研究為首都葉點(diǎn)霉菌)，該方法靈敏度高、特異性好，能夠?qū)蝹€(gè)病斑的基因組DNA甚至更低濃度的基因組DNA進(jìn)行檢測(cè)。Tomlinson等[16]利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)柑橘黑斑病菌，該技術(shù)具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、快速、準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可以在40 min內(nèi)完成對(duì)病原菌的檢測(cè)，但該技術(shù)易產(chǎn)生假陽性。

雖然上述分子檢測(cè)方法各有優(yōu)點(diǎn)，但僅適用于對(duì)致病性菌柑橘黑斑病菌和非致病性菌首都葉點(diǎn)霉菌的區(qū)分。然而目前發(fā)現(xiàn)柑橘上存在5種葉點(diǎn)霉屬真菌，即引起柑橘黑斑病的柑橘黑斑病菌[17]，引起柚棕褐斑病(Tan spot)的亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌[18]，伴隨2種病害發(fā)生的2種內(nèi)生葉點(diǎn)霉菌，即僅在中國(guó)發(fā)現(xiàn)的中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictacitrichinaensis)[6]和世界各地廣泛存在的首都葉點(diǎn)霉菌[19]，以及巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictacitribraziliensis)[12]，在中國(guó)柑橘上存在前4種。利用上述分子檢測(cè)方法無法對(duì)中國(guó)柑橘上的4種葉點(diǎn)霉屬真菌進(jìn)行區(qū)分，檢測(cè)致病性菌柑橘黑斑病菌的引物同樣也能檢測(cè)非致病性菌中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌，因此急需設(shè)計(jì)新的特異性引物區(qū)分柑橘上的4種葉點(diǎn)霉屬真菌，以免因誤判造成不必要的損失。

基于以上分析本研究擬對(duì)柑橘上5種葉點(diǎn)霉屬真菌和親緣關(guān)系較近的舌下葉點(diǎn)霉菌(Phyllostictahypoglossi)進(jìn)行序列比對(duì)，重新設(shè)計(jì)針對(duì)柑橘黑斑病菌、中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌和首都葉點(diǎn)霉菌的特異性引物，為檢疫性病原菌柑橘黑斑病菌的有效快速檢測(cè)提供基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1供試菌株

2009-2010年在我國(guó)柑橘主產(chǎn)區(qū)采集的具有柑橘黑斑病癥狀或具有柚棕褐斑病癥狀的果實(shí)或葉片，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行組織分離與純化，并進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。從經(jīng)過鑒定的柑橘黑斑病菌、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌和首都葉點(diǎn)霉菌中選擇部分完成柯赫氏法則的菌株進(jìn)行研究。

本研究中所用的柑橘常見病原菌柑橘綠霉病菌(PenicilliumdigitatumSacc.)、柑橘褐斑病病原菌(Alternariaalternata(Fr.：Fr) Keissler)、柑橘樹脂病菌(Diaporthecitri(Fawcett) Wolf)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides(Penz.) Sacc)和柑橘脂點(diǎn)黃斑病菌(MycosphaerellacitriWhiteside)，均來自浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院園藝植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室。

1.2基因組DNA提取

利用真菌基因組提取試劑盒提取供試菌株和病斑基因組DNA，提取的基因組DNA經(jīng)0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用超微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)測(cè)量提取菌株DNA的OD260/280值均在1.8左右，純度較高，可以滿足試驗(yàn)要求。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3特異性引物的設(shè)計(jì)

利用DNAman軟件對(duì)供試菌株柑橘黑斑病菌(ZJUCC200928、ZJUCC200968、ZJUCC200946、NFMJ67)，亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌 (ZJUCC200901、ZJUCC200914、GXSTY102、GDSTY98)，首都葉點(diǎn)霉菌 (ZJUCC200958、ZJUCC200962、ZJWZMG53、GDSTY88)，中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌 (CGMCC3.14303、CGMCC3.14302、ZJUCC2010100、CQJC64)的 ITS序列以及GenBank中下載的舌下葉點(diǎn)霉菌(CBS101.72)和巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌(CBS100098)的ITS序列進(jìn)行同源性比較，選擇同源性低的區(qū)域設(shè)計(jì)上游引物，以ITS4(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGA -3′)作為下游引物。在ITS1區(qū)域設(shè)計(jì)柑橘黑斑病菌的上游引物Pc1；同樣在ITS1區(qū)域設(shè)計(jì)首都葉點(diǎn)霉菌的上游引物Pct1、Pct3和Pct4；在18S區(qū)域設(shè)計(jì)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌的上游引物Pcc1、Pcc3和Pcc6，所設(shè)計(jì)的引物利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行檢測(cè)。退火溫度設(shè)58，60，65 ℃ 3個(gè)梯度。

1.4引物特異性檢測(cè)及目的條帶的克隆

將上述設(shè)計(jì)的引物與驗(yàn)證模板DNA質(zhì)量、PCR反應(yīng)體系的引物ACT-512F/ACT-783R[20]結(jié)合，對(duì)中國(guó)柑橘上4種葉點(diǎn)霉屬真菌亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌、柑橘黑斑病菌、首都葉點(diǎn)霉菌和中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌以及柑橘常見病害病原菌柑橘脂點(diǎn)黃斑病菌、柑橘褐斑病病原菌、膠孢炭疽菌、柑橘樹脂病菌和柑橘綠霉病菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增出的條帶大小與引物設(shè)計(jì)時(shí)理論條帶大小是否一致來判斷引物的特異性。將目的條帶利用試劑盒回收，并進(jìn)行克隆和測(cè)序，獲得的核苷酸序列與GenBank中已知的序列比較，進(jìn)一步檢驗(yàn)擴(kuò)增出的條帶的正確性。

1.5特異性引物靈敏度檢驗(yàn)

采用10倍濃度稀釋法將模板中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、首都葉點(diǎn)霉菌和柑橘黑斑病菌基因組DNA用超純水分別稀釋成200 ng/μL、20 ng/μL、2 ng/μL、200 pg/μL、20 pg/μL、2 pg/μL、200 fg/μL、20 fg/μL、2 fg/μL、200 ag/μL、20 ag/μL、2 ag/μL 12個(gè)不同濃度梯度，對(duì)所篩選的引物進(jìn)行靈敏度檢驗(yàn)，以便得到最佳引物組合。

1.6特異性引物對(duì)病斑的檢測(cè)

采集重慶甜橙果園疑似柑橘黑斑病癥狀果實(shí)，以及在廣東沙田柚果園采集的疑似柚棕褐斑病癥狀的柚果和葉片，提取果實(shí)和葉片病斑基因組DNA，利用上述設(shè)計(jì)的柑橘黑斑病菌的特異性引物和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性引物Pca8/ITS4進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)一步驗(yàn)證引物的特異性[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1特異性引物和退火溫度的篩選

將針對(duì)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、柑橘黑斑病菌和首都葉點(diǎn)霉菌分別設(shè)計(jì)的上游引物與ITS4構(gòu)成引物對(duì)。分別以中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、柑橘黑斑病菌和首都葉點(diǎn)霉菌為模板，在58，60，65 ℃退火溫度分別進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，針對(duì)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌的引物對(duì)Pcc1/ITS4，柑橘黑斑病菌的引物對(duì)Pc1/ITS4，首都葉點(diǎn)霉菌的引物對(duì)Pct4/ITS4(表1)，均在60 ℃退火溫度下擴(kuò)增特異性好、穩(wěn)定性高(表2)。

表1 特異性上游引物序列Tab.1 Specific upstream primer sequence

表2 不同退火溫度引物的特異性Tab.2 The specificity of designed primers in different annealing temperatures

注：Pcc.中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌; Pc.柑橘黑斑病菌; Pca.亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌; Pct.首都葉點(diǎn)霉菌；++.獲得目的條帶并且條帶清晰明亮；+.獲得目的條帶但條帶清晰度一般；-.未獲得目的條帶。

Note：Pcc.P.citrichinaensis; Pc.P.citricarpa; Pca.P.citriasina; Pct.P.capitalensis; ++.The target band was amplified and the bands were clear and bright；+.The target band was amplified but the bands were normal; -.The target band was not amplified .

2.2引物的特異性檢驗(yàn)

篩選的特異性引物Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4和Pct4/ITS4分別對(duì)4株中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、4株柑橘黑斑病菌、4株首都葉點(diǎn)霉菌和4株亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果顯示，引物Pcc1/ITS4僅能從4株中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌的基因組DNA中擴(kuò)增出706 bp的條帶，不能從柑橘黑斑病菌、首都葉點(diǎn)霉菌和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的基因組DNA中擴(kuò)增出該條帶(圖1)；引物Pc1/ITS4僅能從供試菌株柑橘黑斑病菌的基因組DNA中擴(kuò)增出593 bp的條帶，在其他菌種的基因組DNA中未擴(kuò)增出目的條帶(圖2)；引物Pct4/ITS4僅能從供試菌株首都葉點(diǎn)霉菌的基因組DNA中擴(kuò)增出551 bp的條帶，而不能從其他菌株的基因組DNA中擴(kuò)增出該條帶(圖3)。將每個(gè)特異性引物擴(kuò)增出的條帶進(jìn)行克隆回收測(cè)序，得到的序列與已知種的相似性達(dá)到100%。同時(shí)利用這些特異性引物對(duì)柑橘常見病害病原菌的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，均未擴(kuò)增出任何條帶，進(jìn)一步證明，所設(shè)計(jì)的引物特異性好。

1～4.4個(gè)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株; 5～8.4個(gè)首都葉點(diǎn)霉菌菌株;9～12.4個(gè)亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株;13～16. 4個(gè)柑橘黑斑病菌菌株; 260 bp的條帶為引物ACT512F/ACT783R擴(kuò)增產(chǎn)物。

1-4.FourP.citrichinaensisisolatess; 5-8.FourP.capitalensisisolates; 9-12.FourP.citriasianaisolates; 13-16.FourP.citricarpaisolates; The 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

圖1引物Pcc1/ITS4特異性
Fig.1SpecificitydetectionofprimerPcc1/ITS4

1～4. 4個(gè)柑橘黑斑病菌菌株; 5～8.4個(gè)首都葉點(diǎn)霉菌菌株;9～12.4個(gè)亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株;13～16. 4個(gè)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株; 260 bp的條帶為引物ACT512F/ACT783R擴(kuò)增產(chǎn)物。

1-4. FourP.citricarpaisolates; 5-8.FourP.capitalensisisolates;9-12.FourP.citriasianaisolates ;13-16. FourP.citrichinaensisisolates; 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

圖2引物Pc1/ITS4的特異性
Fig.2SpecificitydetectionofprimerPc1/ITS4

2.3引物的靈敏度檢驗(yàn)

為了測(cè)試特異性引物Pcc1/ITS4、Pc1/ITS4和Pct4/ITS4的靈敏度，分別將中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、柑橘黑斑病菌和首都葉點(diǎn)霉菌的基因組DNA進(jìn)行梯度稀釋，并對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，當(dāng)PCR體系中含有20 pg模板時(shí)，特異性引物Pcc1/ITS4能擴(kuò)增出目的條帶(圖4-A)；雖然在模板含量為20 pg時(shí)，引物Pct4/ITS4能擴(kuò)增出目的條帶，但條帶太弱，難以進(jìn)行辨別，因此針對(duì)于首都葉點(diǎn)霉菌的特異性引物可檢測(cè)到的模板最低量為200 pg(圖4-B)；特異性引物Pc1/ITS4的檢測(cè)靈敏度為 200 pg(圖4-C)。證明所設(shè)計(jì)的特異性引物靈敏度較高，可用于病原菌的鑒定。

1～4.4個(gè)首都葉點(diǎn)霉菌菌株; 5～8.4個(gè)柑橘黑斑病菌菌株; 9～12.4個(gè)亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株; 13～16.4個(gè)中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株; 260 bp的條帶為引物ACT512F/ACT783R擴(kuò)增產(chǎn)物。

1-4. FourP.capitalensisisolates; 5-8. FourP.citricarpaisolates;9-12. FourP.citriasianaisolates; 13-16. FourP.citrichinaensisisolates; 260 bp bands were amplified by primerACT512F/ACT783R.

圖3引物Pct4/ITS4的特異性
Fig.3SpecificitydetectionofprimerPct4/ITS4

A.中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌特異性引物的靈敏度檢驗(yàn)；B.首都葉點(diǎn)霉菌特異性引物的靈敏度檢驗(yàn)；C.柑橘黑斑病菌特異性引物的靈敏度檢驗(yàn)；M. Trans 2K plus DNA Marker；1～12.模板量為200 ng、20 ng、2 ng、200 pg、20 pg、2 pg、200 fg、20 fg、2 fg、200 ag、20 ag和2 ag。

A. Sensitivity detection of specific primer forP.citrichinaensis; B. Sensitivity detection of specific primer forP.capitalensis; C.Sensitivity detection of specific primer forP.citricarpa; M. Trans 2K plus DNA Marker; 1-12. Nucleic acid template 200 ng, 20 ng, 2 ng, 200 pg, 20 pg, 2 pg, 200 fg,20 fg, 2 fg, 200 ag, 20 ag and 2 ag.

圖4Pcc1/ITS4、Pct4/ITS4和Pc1/ITS4引物的靈敏度檢驗(yàn)
Fig.4SensitivitydetectionofspecificprimersPcc1/ITS4,Pct4/ITS4andPc1/ITS4

2.4果園疑似柑橘黑斑病病斑檢測(cè)

引物Pc1/ITS4對(duì)甜橙具有疑似柑橘黑斑病癥狀的病斑和柚果、葉片具有疑似棕褐斑病癥狀的病斑基因組DNA檢測(cè)結(jié)果顯示，Pc1/ITS4從甜橙疑似柑橘黑斑病病斑基因組中擴(kuò)增出柑橘黑斑病菌的目的條帶，而不能從柚疑似棕褐斑病病斑基因組中擴(kuò)增出任何條帶(圖5)。而特異性引物Pca8/ITS4僅可以從柚疑似棕褐斑病病斑中檢測(cè)到亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的目的條帶。

1.陽性對(duì)照；2～4.具有疑似柚棕褐斑病癥狀的沙田柚果實(shí)病斑；5～7.具有疑似柚棕褐斑病癥狀的沙田柚葉片病斑；8～11.具有疑似柑橘黑斑病癥狀的甜橙果實(shí)病斑；M.100 bp Plus Ⅱ DNA Ladder.

1.Positive control; 2-4.Lesions from pomelo peel with doubtable tan spot symptoms; 5-7.Lesions from pomelo leaves with doubtable tan spot symptoms; 8-11.Lesions from fruit peel of sweet orange with suspected citrus black spot symptoms；M.100 bp Plus Ⅱ DNA Ladder.

圖5特異性引物對(duì)柑橘葉片和果實(shí)疑似黑斑病癥狀病斑的檢測(cè)
Fig.5Specificprimerdetectedthepathogenofcitrusfruitandleaflesionswithsuspectedblackspotsymptoms

3 結(jié)論與討論

本研究設(shè)計(jì)并篩選了針對(duì)柑橘黑斑病菌、首都葉點(diǎn)霉菌和中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性引物，該特異性引物可以將柑橘上4種葉點(diǎn)霉屬真菌進(jìn)行區(qū)分，且設(shè)計(jì)的引物特異性好、靈敏度高，可用于柑橘黑斑病菌的快速檢測(cè)。

利用本研究設(shè)計(jì)的特異性引物可以準(zhǔn)確快速檢測(cè)柑橘黑斑病菌，與前人研究相比，本研究將柑橘上存在的所有葉點(diǎn)霉菌(柑橘黑斑病菌、首都葉點(diǎn)霉菌、 中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌和巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌)以及與中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌親緣關(guān)系較近的舌下葉點(diǎn)霉菌進(jìn)行序列比對(duì)，在ITS1和18S區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，并將特異性引物對(duì)柑橘黑斑病菌、 首都葉點(diǎn)霉菌、中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌、亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌進(jìn)行了擴(kuò)增，特異性引物Pc1/ITS4只能從柑橘黑斑病菌中擴(kuò)增出條帶，而不能從中國(guó)柑橘上其他葉點(diǎn)霉屬真菌和柑橘常見病害病原菌中擴(kuò)增出條帶。由于本研究中沒有獲得巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌的菌株，所以特異性引物沒有對(duì)巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌進(jìn)行擴(kuò)增，下一步應(yīng)從荷蘭菌種保存中心(Centraalbureau voor Schimmelcultures，Utrecht，The Netherlands )或研究者Glienke獲得巴西柑橘葉點(diǎn)霉菌菌株，并對(duì)所設(shè)計(jì)的引物進(jìn)行檢驗(yàn)。

前人設(shè)計(jì)的針對(duì)柑橘黑斑病菌的特異性引物靈敏度不同。Bonants等[10]設(shè)計(jì)的針對(duì)柑橘黑斑病菌的特異性引物GCF3/GCR7檢測(cè)病原菌的靈敏度為20 pg；Meyer等[11]設(shè)計(jì)的特異性引物CITRIC1/ITS4檢測(cè)柑橘黑斑病菌的靈敏度為100 pg；Peres等[13]設(shè)計(jì)的特異性引物GCN/GCMR檢測(cè)病原菌的靈敏度為1 pg。而本研究設(shè)計(jì)的特異性引物Pc1/ITS4檢測(cè)病原菌的靈敏度為200 pg，與前人研究相比靈敏度較低，但本研究設(shè)計(jì)的特異性引物能夠?qū)⒅虏【涕俸诎卟【c亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌、中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌區(qū)分，前人所設(shè)計(jì)的針對(duì)柑橘黑斑病菌的引物也能檢測(cè)亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌和中國(guó)柑橘葉點(diǎn)霉菌，錯(cuò)誤診斷率提高，影響柑橘的銷售。

以本研究設(shè)計(jì)的特異性引物作為基礎(chǔ)，再加上本實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的針對(duì)亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌的特異性引物Pca8/ITS4[6]，再輔以雜交探針等技術(shù)，必定能夠建立完善的致病菌柑橘黑斑病菌和亞洲柑橘葉點(diǎn)霉菌快速分子檢測(cè)技術(shù)，防止柑橘黑斑病在我國(guó)和其他國(guó)家進(jìn)一步蔓延。

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MolecularDetectionofPhyllostictacitricarpaonCitrusBlackSpot

WANG Xinghong1，2

(1.Chinese Academy of Forestry，Experimental Center of Forestry in North China，Beijing 102300，China;2.College of Agriculture & Biotechnology，Zhejiang University，Hangzhou 310058，China)

In order to distinguishP.citricarpa，P.citriasiana,P.capitalensisandP.citrichinaensis，upstream primers forP.citricarpa，P.capitalensisandP.citrichinaensiswere designed in ITS1 and 18S regions，and these primers were used together with theITS4 primer.Then，the specificity and annealing temperature of primers were screened，and the sensitivity of the specific primers were verified.Screened primer was used to detectP.citricarpawhen DNA was extracted from black/tan spot lesions on fruits or leaves.The results showed that 593 bp specific fragments were only obtained fromP.citricarpaby specific primerPc1/ITS4，551 bp specific fragments were only obtained fromP.capitalensisby specific primerPct4/ITS4，and 706 bp specific fragments were only obtained fromP.citrichinaensisby specific primerPcc1/ITS4，when annealing temperature at 60 ℃.These specific primers were never amplified any fragment from the commonCitruspathogens.The sensitivity test results showed that the sensitivity of specific primersPc1/ITS4 andPct4/ITS4 was 200 pg，and the sensitivity of specific primerPcc1/ITS4 was 20 pg.The screened specific primerPc1/ITS4 could detectP.citricarpafrom DNA of black spot lesions on fruit.Therefore，using the specific primers，combined with the simple method of DNA extraction，the molecular detection for the pathogen ofCitrusblack spot could be completed in a short time.

Citrusblack spot;Phyllostictacitricarpa;Phyllostictacitrichinaensis;Phyllostictacapitalensis; Specific primers

2017-08-01

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(柑橘)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CARS-27)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目(CAFYBB2016QA013)

王興紅(1982-)，女，河北深州人，工程師，博士，主要從事植物病原真菌系統(tǒng)演化研究。

S436.66

A

1000-7091(2017)05-0130-06

10.7668/hbnxb.2017.05.020