劉 輝，韋永選，鄧 治，代龍軍，楊 洪，李德軍

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

巴西橡膠樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因HbWRKY41的克隆與表達(dá)分析

劉 輝，韋永選，鄧 治，代龍軍，楊 洪，李德軍

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 橡膠研究所，農(nóng)業(yè)部橡膠樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 儋州 571737)

為闡明巴西橡膠樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因HbWRKY41的分子特征及表達(dá)特性，利用RT-PCR方法從巴西橡膠樹中克隆了該基因。HbWRKY41開放閱讀框1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)蛋白分子量為38.48 kDa，理論等電點(diǎn)為5.52。HbWRKY41含有1個(gè)WRKY保守結(jié)構(gòu)域和1個(gè)C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)，與蓖麻、棉花、大豆及擬南芥WRKY41蛋白聚為一類，屬于Ⅲ類 WRKY 轉(zhuǎn)錄因子家族成員。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明，HbWRKY41在巴西橡膠樹根、樹皮、膠乳、葉和花等組織中均有表達(dá)，以在衰老葉片中的表達(dá)最高，而在膠乳和樹皮中的表達(dá)相對(duì)較低。干旱、低溫及高鹽脅迫均可上調(diào)HbWRKY41的表達(dá)，其中以低溫或鹽脅迫下HbWRKY41的表達(dá)持續(xù)升高。HbWRKY41可能在巴西橡膠樹葉片衰老和非生物脅迫應(yīng)答中起著重要調(diào)控作用。

巴西橡膠樹；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；基因克隆；表達(dá)分析；非生物脅迫

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，其名稱源于一段高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，由約60個(gè)氨基酸殘基組成。該結(jié)構(gòu)域N端具有極其保守的WRKYGQK氨基酸序列，C端通常有鋅指結(jié)構(gòu)(Zinc-finger motif)，能通過(guò)與啟動(dòng)子區(qū)域的W-box(TTGACT/C)等順式作用元件結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)下游目標(biāo)基因的表達(dá)[1-2]。根據(jù)WRKY 結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型，WRKY轉(zhuǎn)錄因子被分為3類(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)[1]。Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)目為2，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH)，如桃PpWRKY1[3]；Ⅱ和Ⅲ類都只含有1個(gè)WRKY結(jié)構(gòu)域，不同的是Ⅱ類的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH)，而Ⅲ類的鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC(Cx7Cx23HxC)，如蘋果MdWRKY25(Ⅱ)和MdWRKY116(Ⅲ)[4]。根據(jù)氨基酸核心序列差異，Ⅱ類又劃分為5亞組：Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd和Ⅱe[5]。

植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子在許多生物進(jìn)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，包括生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、生物及非生物脅迫應(yīng)答等[1-2，5-6]，如AtWRKY46、AtWRKY54和AtWRKY70正調(diào)控?cái)M南芥生長(zhǎng)發(fā)育，負(fù)調(diào)控干旱脅迫應(yīng)答[7]；過(guò)表達(dá)GmWRKY31能提高大豆對(duì)疫霉病的抗性[8]。鑒于WRKY轉(zhuǎn)錄因子的重要生物學(xué)功能，該基因家族已經(jīng)在許多植物物種中被鑒定出來(lái)，如桃[3]、蘋果[4]、胡蘿卜[9]等。巴西橡膠樹含有81個(gè)WRKY基因[10]，但僅有少數(shù)幾個(gè)有進(jìn)一步的研究報(bào)道，包括HbWRKY1[11-12]、HbWRKY3[13]、HbWRKY9[14]、HbWRKY27[15]、HbWRKY75[16]HbWRKY7和HbWRKY11[17]等。通過(guò)對(duì)巴西橡膠樹轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，本研究獲得了一個(gè)WRKY基因序列，本研究從巴西橡膠樹中克隆了該基因(HbWRKY41)，并分析了其分子特性及表達(dá)特征，以期為下一步解析其生物學(xué)功能提供參考。

1 材料和方法

1.1植物材料與處理

本研究所使用的組織樣品均采自巴西橡膠樹品系熱研7-33-97，除根采自培育6個(gè)月的組培苗外，其他組織樣品(成熟葉、衰老葉、莖尖、雄花、雌花、膠乳和樹皮)均采自中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)1990年定植的巴西橡膠樹。每份組織樣品3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每份樣品采自3株巴西橡膠樹。樣品采集后液氮速凍，-80 °C保存。

非生物脅迫處理材料為移栽培養(yǎng)6個(gè)月的組培苗。低溫處理在4 °C人工氣候箱中進(jìn)行；干旱和鹽脅迫處理是將植株從育苗袋中取出，洗凈栽培基質(zhì)，根部浸沒(méi)于30% PEG6000或1 mol/L NaCl 溶液中。低溫和干旱脅迫處理分別在0(對(duì)照)，3，6，12，24，48 h采集第2，3片葉，鹽脅迫在0(對(duì)照)，4，24，48 h采集第2，3片葉。以上各處理時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3次生物學(xué)重復(fù)，每重復(fù)4株組培苗。樣品采集后液氮速凍，用于總RNA提取。

1.2總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄及HbWRKY41基因克隆

采用通用植物總RNA提取試劑盒(北京百泰克生物技術(shù)有限公司)和PrimeScript?RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒(TaKaRa)提取各樣品總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，具體方法參照說(shuō)明書。

從GenBank下載登錄號(hào)為AJJZ011014562.1的序列，采用SoftBerry網(wǎng)站中的FGENESH程序 (http：//linux1.softberry.com/berry.phtml)預(yù)測(cè)基因ORF(Open reading frame，開放閱讀框)。根據(jù)基因預(yù)測(cè)結(jié)果，通過(guò)Primer 3(http：//primer3.ut.ee/)在線程序設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的特異性引物(5′-ATGGATA

GTTGTTGGAACTTGG-3′和5′-TTAAGAGAAAAATCC

TGGCATG-3′)。目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的反應(yīng)總體系25 μL，含5 μL 5×TransStart?FastPfu Buffer、0.5 μL TransStart?FastPfu DNA Polymerase(2.5 U/μL)、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、1 μL各組織等量混合的cDNA模板、0.5 μL正向引物(10 μmol/L) 、0.5 μL反向引物(10 μmol/L)以及15.5 μL ddH2O。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性20 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，采用膠回收試劑盒(OMEGA)回收純化目標(biāo)片段，并與pEASY?-Blunt Simple Cloning Vector(北京全式金生物技術(shù)有限公司)連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，PCR篩選陽(yáng)性克隆送賽默飛世爾科技有限公司廣州分公司測(cè)序。

1.3HbWRKY41序列及進(jìn)化分析

使用DNAMAN 4.0軟件推導(dǎo)HbWRKY41基因編碼氨基酸序列。蛋白等電點(diǎn)和分子量預(yù)測(cè)采用在線程序Compute pI/Mw(http：//web.expasy.org/compute_pi/)；蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)使用InterProScan(http：//www.ebi.ac.uk/interpro/)；采用NCBI BlastP進(jìn)行蛋白序列比對(duì)分析，并下載不同物種不同類型的WRKY轉(zhuǎn)錄因子，使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，算法選用Neighbor-Joining，Bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000。

1.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

使用Primer 3程序設(shè)計(jì)HbWRKY41和內(nèi)參基因HbUBC4的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)引物。HbWRKY41 qPCR正、反向引物序列分別為5′-GAAGGA

CCCCATGATGACGG-3′和5′-TGTAGCCCAGCAGTTC

AAGG-3′；HbUBC4 qPCR正、反向引物序列分別為5′-TCACCCTGAACCTGATAGCC-3′和5′-TTTCTTTGG

TGACGCTGCAA-3′。qPCR反應(yīng)體系如下：SYBR?Premix Ex TaqTM(2×) (TaKaRa)10 μL，正、反向引物各1 μL，模板2 μL，補(bǔ)ddH2O至20 μL。每樣品3次重復(fù)。qPCR在Bio-Rad CFX96 qPCR 儀進(jìn)行，程序設(shè)置為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)行溶解曲線分析，以確定引物的特異性。2-ΔΔCt法計(jì)算目標(biāo)基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SigmaPlot 12.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，數(shù)據(jù)結(jié)果為3次生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。采用t-test進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1HbWRKY41蛋白序列特征

通過(guò)對(duì)巴西橡膠樹樹皮轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，獲得了一個(gè)WRKY基因部分序列。利用該序列對(duì)NCBI中巴西橡膠樹相關(guān)的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)分析，本研究獲得了包含完整ORF的基因序列，GenBank登錄號(hào)為AJJZ011014562.1。根據(jù)該序列，設(shè)計(jì)擴(kuò)增全長(zhǎng)ORF的特異引物，并通過(guò)PCR從巴西橡膠樹品系熱研7-33-97中克隆了該基因(圖1)。瓊脂糖凝膠電泳、測(cè)序分析及基因預(yù)測(cè)結(jié)果表明，該基因ORF長(zhǎng)度為1 020 bp，編碼339個(gè)氨基酸。蛋白序列比對(duì)表明，該蛋白與蓖麻、棉花、大豆及擬南芥等WRKY41蛋白序列一致性較高。故將該基因命名為HbWRKY41。

M.DNA分子質(zhì)量標(biāo)志物DL2000；N.空白對(duì)照；H.HbWRKY41。M.DL2000 DNA Marker；N. Negative control；H. HbWRKY41 PCR product.

預(yù)測(cè)HbWRKY41蛋白分子量為38.48 kDa，理論等電點(diǎn)為5.52。蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)結(jié)果表明，HbWRKY41在130-191位氨基酸之間擁有一個(gè)由62個(gè)氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，含有一段高度保守的WRKYGQK七肽序列；同時(shí)含有C2HC型(Cx7Cx23HxC)鋅指結(jié)構(gòu)(圖2)。以上結(jié)果表明，HbWRKY41屬于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。此外，HbWRKY41含有核定位信號(hào)基序(KKRK)，位于107-110位氨基酸 (圖2)。

單下劃線部分為WRKY結(jié)構(gòu)域；灰色背景標(biāo)出的為保守的WRKYGQK七肽序列；雙下劃線標(biāo)出的為核定位信號(hào)基序；三角形標(biāo)出的為鋅指結(jié)構(gòu)的C和H殘基。

The single underlined region indicate WRKY domain；The conserved WRKYGQK amino acids are showed in gray background；The double underlined region indicate the nuclear localization signal；The C and H residues in the zinc-finger motif are marked by a triangle.

圖2HbWRKY41全長(zhǎng)ORF序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列
Fig.2Full-lengthORFsequenceanddeducedaminoacidsofHbWRKY41

2.2HbWRKY41系統(tǒng)進(jìn)化分析

為解析HbWRKY41與其他植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系，采用MEGA 6.0軟件構(gòu)建了HbWRKY41和其他植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示，植物WRKY蛋白分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類，其中Ⅱ類又進(jìn)一步分為Ⅱa、Ⅱb、Ⅱc、Ⅱd 和Ⅱe 5 個(gè)亞類，這與前人對(duì)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的分類結(jié)果一致。HbWRKY41與蓖麻(RcWRKY41)、棉花(GhWRKY41)、大豆(GmWRKY41)及擬南芥(AtWRKY41)劃為一類，同屬于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員。

2.3HbWRKY41的組織表達(dá)特性

采用qPCR分析了HbWRKY41在橡膠樹膠乳、樹皮、根、莖尖、成熟葉、衰老葉、雄花和雌花等組織中的表達(dá)。如圖4所示，HbWRKY41在以上各組織中均有表達(dá)，但是在不同組織中的表達(dá)存在明顯差異。以在衰老葉片中的表達(dá)量最高，其次是莖尖。膠乳和樹皮中HbWRKY41的表達(dá)相對(duì)較低。

2.4HbWRKY41的表達(dá)受非生物脅迫誘導(dǎo)

為探究HbWRKY41在橡膠樹非生物脅迫響應(yīng)中的作用，采用qPCR分析了低溫、干旱及高鹽脅迫下，葉片中HbWRKY41基因的表達(dá)變化。PEG誘導(dǎo)

的干旱脅迫下，HbWRKY41的表達(dá)逐步升高，在處理6 h，達(dá)到最高值，較處理前(0 h)上調(diào)29.3倍；此后，HbWRKY41的表達(dá)逐步降低，處理48 h，HbWRKY41的表達(dá)恢復(fù)到脅迫處理前的正常水平(圖5)。低溫脅迫下，HbWRKY41的表達(dá)持續(xù)升高；處理6 h后，其表達(dá)量均極顯著高于處理前；處理48 h，HbWRKY41的表達(dá)較脅迫處理前上調(diào)117.7倍(圖5)。鹽脅迫下，HbWRKY41的表達(dá)持續(xù)升高，在各處理時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)均極顯著高于脅迫處理前，處理48 h，HbWRKY41的表達(dá)較脅迫處理前上調(diào)317.5倍(圖6)。以上結(jié)果表明，HbWRKY41的表達(dá)受低溫、干旱和高鹽等非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。

圖3 進(jìn)化樹分析HbWRKY41與其他植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化關(guān)系Fig.3 Phylogenetic tree showing the evolutionary relationship between HbWRKY41 and other plant WRKY transcription factors

圖4 巴西橡膠樹HbWRKY41基因的組織表達(dá)譜分析Fig.4 Tissue expression pattern analysis of HbWRKY41 gene in Hevea brasiliensis

**.處理與對(duì)照(0 h)在0.01水平上差異顯著。圖6同。**. Significant difference at P<0.01 level between the treatment and control (0 h) groups.The same as Fig.6.

圖6 鹽脅迫下HbWRKY41的表達(dá)模式Fig.6 Expression pattern of HbWRKY41 under salt stress

3 討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，被分為Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ 3大類。橡膠樹基因組中含有81個(gè)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類的數(shù)目分別為16，51，14[10]。本研究克隆的HbWRKY41含有典型的WRKY保守結(jié)構(gòu)域和C2HC型鋅指結(jié)構(gòu)，屬于Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。序列比對(duì)及進(jìn)化分析表明，HbWRKY41同擬南芥、蓖麻、棉花、大豆等的WRKY41蛋白同源性較高，處于同一進(jìn)化分支。Ding等[18]研究證實(shí)，擬南芥AtWRKY41通過(guò)直接調(diào)控ABI3(Abscisic acid Insensitive 3)的表達(dá)調(diào)控種子休眠。棉花GhWRKY41則通過(guò)調(diào)控氣孔關(guān)閉和抗氧化相關(guān)基因的表達(dá)正調(diào)控植物的耐鹽和抗旱性[19]。HbWRKY41是否具有類似于AtWRKY41或GhWRKY41的功能仍需通過(guò)基因工程手段進(jìn)一步研究。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物葉片衰老中發(fā)揮重要調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄組分析表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是參與擬南芥葉片衰老調(diào)控的第二大類轉(zhuǎn)錄因子，僅次于NAC轉(zhuǎn)錄因子[5]。近年來(lái)，利用正向和反向遺傳學(xué)等方法分離鑒定的許多調(diào)控植物衰老的WRKY基因，如OsWRKY42[20]、AtWRKY22[21]、AtWRKY54和AtWRKY70[22]等。陳曉麗等[16]研究發(fā)現(xiàn)，橡膠樹HbWRKY75基因的表達(dá)隨著葉片的衰老顯著升高，衰老晚期葉片中HbWRKY75的表達(dá)量最高，認(rèn)為HbWRKY75可能是橡膠樹葉片衰老過(guò)程的正調(diào)控因子。本研究中的組織表達(dá)譜分析表明，HbWRKY41在衰老葉片中的表達(dá)量最高，推測(cè)HbWRKY41可能參與了橡膠樹葉片衰老調(diào)控。

天然橡膠是重要的工業(yè)原料和戰(zhàn)略物資，其主要來(lái)源于巴西橡膠樹。我國(guó)植膠業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展才能保障天然橡膠的穩(wěn)定自給。我國(guó)能植膠的區(qū)域有限，僅限海南、云南和廣東部分地區(qū)，均屬于非傳統(tǒng)植膠區(qū)，巴西橡膠樹種植過(guò)程中經(jīng)常遭受干旱和低溫等非生物逆境脅迫。解析巴西橡膠樹非生物脅迫響應(yīng)的分子機(jī)制將為其非生物脅迫抗性遺傳改良奠定基礎(chǔ)。越來(lái)越多的研究表明，當(dāng)植物遭遇低溫、干旱、高鹽、高溫或滲透脅迫時(shí)，WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過(guò)轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與了植物非生物脅迫應(yīng)答信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，在各種脅迫誘導(dǎo)信號(hào)通路中扮演著重要角色[1，23]。迄今為止，在擬南芥、水稻、棉花、小麥、大豆、玉米、葡萄等許多植物中分離鑒定了調(diào)控非生物脅迫應(yīng)答的WRKY基因[23-24]。近年來(lái)，在巴西橡膠樹中也發(fā)現(xiàn)了一些受低溫或干旱等非生物脅迫調(diào)控的WRKY基因，如HbWRKY1[25-26]、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4[26]、HbWRKY9[14]、HbWRKY7和HbWRKY11[17]等。其中，HbWRKY1、HbWRKY2、HbWRKY3、HbWRKY4已被證實(shí)超量表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植株的抗旱/耐鹽性[25-26]。本研究發(fā)現(xiàn)HbWRKY41的表達(dá)受低溫、干旱和高鹽脅迫誘導(dǎo)；在低溫或高鹽脅迫下，該基因表達(dá)量持續(xù)增加，處理48 h其表達(dá)量上調(diào)百倍以上，推測(cè)HbWRKY41可能在橡膠樹非生物脅迫響應(yīng)中起著重要調(diào)控作用。關(guān)于HbWRKY41在橡膠樹非生物脅迫應(yīng)答中的功能及其調(diào)控機(jī)制仍需要進(jìn)一步的研究。

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CloningandExpressionAnalysisofaWRKYTranscriptionFactorGeneHbWRKY41inHeveabrasiliensis

LIU Hui，WEI Yongxuan，DENG Zhi，DAI Longjun，YANG Hong，LI Dejun

(Rubber Research Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Rubber Tree，Ministry of Agriculture，Danzhou 571737，China)

To reveal the molecular characterization and expression patterns of the WRKY transcription factor geneHbWRKY41 inHeveabrasiliensis(para rubber tree)，this gene was cloned from para rubber tree by RT-PCR.HbWRKY41 contained an open reading frame of 1 020 bp encoding a protein of 339 amino acids. The molecular weight and isoelectric point of HbWRKY41 were 38.48 kDa and 5.52，respectively. HbWRKY41 possessed a conserved WRKY domain and a C2HC-type zinc-finger motif，and it was clustered into the group Ⅲ of the WRKY family with WRKY41 proteins from castor，cotton，soybean andArabidopsisthaliana. Quantitative Real-time PCR analysis showed thatHbWRKY41 was expressed in root，bark，latex，leaf and flower of para rubber tree，with the highest expression in senescent leaf and relatively low expression in latex and bark.HbWRKY41 expression was up-regulated by cold，drought and salt stresses，its expression was continuously increased during cold or salt stress.HbWRKY41 may play important roles in regulating leaf senescence and abiotic stress responses in para rubber tree.

Heveabrasiliensis；WRKY transcription factor；Gene cloning；Expression analysis；Abiotic stress

2017-06-29

中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng) (1630022017028；1630022014006)

劉 輝(1986-)，男，安徽亳州人，助理研究員，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

李德軍(1975-)，男，遼寧朝陽(yáng)人，研究員，博士，主要從事橡膠樹分子生物學(xué)研究。

Q78；S794.03

A

1000-7091(2017)05-0091-06

10.7668/hbnxb.2017.05.014