梁 倩,李 璐,周雅莉,安 茜,王計(jì)平
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801)
紫蘇PfDGAT2基因生物信息學(xué)及表達(dá)特性分析
梁 倩,李 璐,周雅莉,安 茜,王計(jì)平
(山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,山西 太谷 030801)
為研究二酯酰甘油?;D(zhuǎn)移酶2(PfDGAT2)在紫蘇種子油脂合成過程中的調(diào)控作用,對紫蘇DGAT2基因及其編碼的蛋白質(zhì)進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析,并研究了該基因在不同紫蘇品種中的表達(dá)特性。結(jié)果表明,PfDGAT2基因cDNA全長1 249 bp,共編碼329個氨基酸;DGAT2蛋白的等電點(diǎn)為9.46,屬于堿性蛋白質(zhì);二級結(jié)構(gòu)預(yù)測表明,紫蘇DGAT2蛋白的主要結(jié)構(gòu)元件是無規(guī)則卷曲(34.65%)和α-螺旋(30.09%);系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明,紫蘇與芝麻和煙草的親緣關(guān)系較近,與油橄欖的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。通過研究PfDGAT2基因在含油量不同的2個紫蘇品種種子發(fā)育的不同時(shí)期表達(dá)特性,結(jié)果表明,該基因在開花后30 d形成的種子中表達(dá)量最高,但是二者又具有一定差異,晉紫蘇1號(含油量46.88%)表達(dá)量為開花后10 d的1.63倍,并紫蘇1號(含油量35.60%)為0.75倍,因此,推測DGAT2在紫蘇TAG生物合成中起重要調(diào)控作用。
紫蘇;二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶2(DGAT2);生物信息學(xué);表達(dá)特性分析
紫蘇(Perillafrutescens)又名桂荏、白蘇,系唇形科紫蘇屬一年生草本植物,是國家衛(wèi)生部首批頒發(fā)的既是食品又是藥品的中藥植物之一[1-3]。在紫蘇籽油中,α-亞麻酸含量高達(dá)62.73%,亞油酸為15.43%,油酸為12.01%,是目前所知α-亞麻酸含量最高的新型油料作物之一[4]。因此,紫蘇植物油被認(rèn)為是深海魚油的良好替代品[5-7]。
植物油作為食用油,不飽和脂肪酸含量較高,可以降低人體血液中膽固醇含量,降低動脈硬化發(fā)生的概率[8]。植物油脂主要以三酰甘油(TAG)的形式貯藏在種子中,在TAG的合成積累過程中二酯酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶基因(DGAT2)起重要調(diào)控作用。目前,在植物中已發(fā)現(xiàn)有3種不同類型的DGAT基因,分別為DGAT1、DGAT2和DGAT3,廣泛存在于葉片、花瓣、果實(shí)、花粉囊以及發(fā)育的種子等不同器官中[9],DGAT1在植物各器官中均有表達(dá)[10],油桐DGAT2主要在種子發(fā)育時(shí)期高量表達(dá)[11]。DGAT2是生物體內(nèi)一種非常重要的酶,它被認(rèn)為是控制高甘油三酯(TAG)所致疾病,如肥胖癥、高血糖、糖尿病、脂肪肝等的潛在標(biāo)靶[12]。
本研究較為詳細(xì)地分析了紫蘇PfDGAT2基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)及該基因的表達(dá)特性,旨在為深入研究該基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
1.1植物材料
從晉蘇1號紫蘇根、莖、葉、花及種子混合樣品轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挑選出功能注釋為DGAT2的基因,根據(jù)不同物種間同源基因的核酸序列相對保守的特點(diǎn),將紫蘇中該基因序列與擬南芥DGAT2同源序列進(jìn)行比對分析,最后得到紫蘇DGAT2基因全長cDNA序列。
選取含油量不同的2個紫蘇品種(中北大學(xué)張志軍老師提供):晉紫蘇1號(含油量46.88%)和并紫蘇1號(含油量35.60%),對發(fā)育不同時(shí)期的種子(開花后10,20,30,40 d)PfDGAT2基因表達(dá)特性進(jìn)行分析,研究該基因表達(dá)對紫蘇種子含油量的影響。
1.2試驗(yàn)方法
1.2.1 紫蘇DGAT2基因序列及蛋白功能分析 通過在線分析軟件ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對紫蘇DGAT2基因編碼蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析;利用TMHMM-2.0(http:// www.cbs.dtu.dk/ servi ces/ TMHMM-2.0/)軟件和SignalP 4.1(http:// www. cbs. dtu. dk/services/ SignalP/)對紫蘇DGAT2的跨膜域、信號肽進(jìn)行分析;采用在線軟件SOPMA對紫蘇DGAT2二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測;采用在線分析軟件Swiss-Model(http://www.swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行紫蘇DGAT2三級結(jié)構(gòu)分析及建模。運(yùn)用MEGA 6.0多序列比對軟件對紫蘇及其近緣種的DGAT2蛋白進(jìn)行比對,并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。
1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 根據(jù)紫蘇DGAT2基因的cDNA序列設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異引物,cDNA第1鏈合成采用TaKaRa公司試劑盒,實(shí)時(shí)熒光定量采用康潤公司GenStar試劑盒。以紫蘇18SrRNA作為內(nèi)參基因[13],進(jìn)行熒光定量PCR檢測。反應(yīng)體系(10 μL):2×RealStar Green Power Mixture 5 μL,RNase-free H2O 4.2 μL,上下游引物各0.2 μL,ROX Reference Dye(50×)0.2 μL,模板cDNA 0.2 μL;采用2步法Real-time PCR,反應(yīng)過程為:95 ℃ 10 min;95 ℃ 15 s,57 ℃ 1 min,40個循環(huán)。
2.1PfDGAT2基因全長cDNA序列及編碼蛋白的生物信息學(xué)分析
紫蘇DGAT2基因全長cDNA序列1 249 bp,開放閱讀框(ORF)為990 bp,起始密碼子ATG位于167 bp處,終止密碼子TAA位于1 156 bp處,共編碼329個氨基酸殘基(圖1),其中,亮氨酸含量最多(10%),谷氨酰胺含量最少(0.9%);原子總數(shù)5 293,相對分子量為37.017 7 kDa;預(yù)測紫蘇DGAT2蛋白等電點(diǎn)為9.46,不穩(wěn)定系數(shù)為41.59,脂溶系數(shù)為100.09,總平均親水系數(shù)為0.272,因此,推測其為親水性脂溶蛋白。
圖1 PfDGAT2基因的全長序列以及編碼的氨基酸序列Fig.1 Full-length cDNA of PfDGAT2 gene and amino acid sequences translated
紫蘇DGAT2蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)顯示(圖2),DGAT2蛋白在29-51位、53-75位氨基酸之間形成了2個典型的跨膜螺旋區(qū),表明PfDGAT2蛋白可能是一個與細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的膜受體蛋白。
使用SignalP 4.1對紫蘇DGAT2蛋白進(jìn)行信號肽及切割位點(diǎn)預(yù)測(圖3),結(jié)果顯示,該蛋白沒有信號肽。
圖2 PfDGAT2蛋白跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig.2 The prediction of transmembrane domain for DGAT2 protein in Perilla frutescens
圖3 PfDGAT2蛋白信號肽預(yù)測結(jié)果Fig.3 Predicted signal peptide of DGAT2 protein in Perilla frutescens
運(yùn)用SOPMA對紫蘇DGAT2蛋白進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)預(yù)測,結(jié)果顯示,該蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要由4種結(jié)構(gòu)元件組成:無規(guī)則卷曲(34.65%)、α-螺旋(30.09%)、延伸鏈(23.71%)、β-轉(zhuǎn)角(11.55%)。利用SWISS-MODEL在線軟件對該蛋白三級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測結(jié)果如圖4所示。
使用MEGA 6.0多序列比對軟件對紫蘇(Perillafrutescens)及其芝麻(Sesamumindicum)、油橄欖(Oleaeuropaea)、向日葵(Helianthusannuus)、煙草(Nicotianatabacum)等DGAT2基因編碼蛋白序列進(jìn)行比對分析并構(gòu)建進(jìn)化樹,分析結(jié)果顯示,紫蘇與芝麻、煙草親緣關(guān)系較近,與油橄欖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(圖5)。
圖4 PfDGAT2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 4 The tertiary structure prediction of DGAT2 protein in Perilla frutescens
圖5 PfDGAT2與不同物種DGAT2蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig.5 Phylogenetic tree analysis of PfDGAT2 and DGAT2 protein in different species
2.2PfDGAT2基因表達(dá)特性分析
為了進(jìn)一步了解DGAT2基因在紫蘇種子不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)特性與種子含油量的關(guān)系,本研究選取含油量不同的2個紫蘇品種晉紫蘇1號(含油量46.88%)和并紫蘇1號(含油量35.60%),對DGAT2基因在種子發(fā)育不同時(shí)期進(jìn)行表達(dá)特性分析(圖6)。熒光定量PCR分析結(jié)果顯示,該基因在2個品種開花后10 d的表達(dá)量都比較高,然后降低,到開花后30 d表達(dá)量又達(dá)到高峰,分別以并紫蘇1號、晉紫蘇1號開花后10 d作為對照,并紫蘇1號開花后30 d表達(dá)量為開花后10 d的0.75倍,而晉紫蘇1號為1.63倍。
a、b表示在0.05水平方差分析差異顯著性。 a and b indicates significant difference at 0.05 level.
在植物中,三酰甘油(TAG)是油料作物種子中能量貯存的主要形式,其主要機(jī)制是使二酰甘油加上脂肪酸?;o酶A以共價(jià)鍵結(jié)合形成三酰甘油。DGAT2被認(rèn)為是多種植物中調(diào)控種子油含量的關(guān)鍵酶,對于調(diào)節(jié)種子脂肪酸組成具有重要作用[14]。為進(jìn)一步了解DGAT2基因在紫蘇油脂合成過程中的功能,本研究對該基因進(jìn)行了詳細(xì)的生物信息學(xué)分析,結(jié)果表明,該基因cDNA全長序列為1 249 bp,共編碼329個氨基酸殘基,相對分子量為37.017 7 kDa,屬于親水性脂溶蛋白;跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測DGAT2為膜受體蛋白;無規(guī)則卷曲和α-螺旋是二級結(jié)構(gòu)中最主要的結(jié)構(gòu)元件;對DGAT2蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析,紫蘇與芝麻、煙草親緣關(guān)系較近,與油橄欖親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。
TAG是大多數(shù)植物和動物體內(nèi)最重要的油脂貯藏形式,DGAT是TAG合成反應(yīng)的限速酶之一,對于種子油脂合成起重要調(diào)控作用[9]。DGAT2存在于動物、植物和酵母中,經(jīng)試驗(yàn)證明,DGAT2在大豆等轉(zhuǎn)基因油料作物中過量表達(dá)均能提高種子的含油量[15]。Shockey等[11]研究證明,DGAT2對種子三酰甘油的合成起著關(guān)鍵作用,雖然DGAT2與DGAT1都能催化二酰甘油結(jié)合CoA形成三酰甘油,在大多數(shù)高等植物的各組織器官中DGAT1基因均有表達(dá),但DGAT2更側(cè)重于特殊脂肪酸的積累,在一些含有稀有脂肪酸的植物中,DGAT2可能對于種子油脂積累具有更重要的作用[16-18]。Lardizabal等[14]將拉曼毛霉(Umbelopsisramanniana)DGAT2A(UrDGAT2A)在大豆中高量表達(dá),結(jié)果使得種子含油量提高了1.5%。紫蘇籽的油脂含油率達(dá)40%~50%[19-20],并且主要以TAG形式存在,為了研究DGAT2基因在紫蘇種子油脂積累過程中的作用,本研究對含油量不同的2個紫蘇品種不同發(fā)育時(shí)期的種子進(jìn)行表達(dá)特性分析,結(jié)果表明,DGAT2基因在晉紫蘇1號、并紫蘇1號2個品種種子發(fā)育不同時(shí)期中均有表達(dá),在開花后30 d表達(dá)量達(dá)到最高,并且晉紫蘇1號開花后30 d表達(dá)量為開花后10 d的1.63倍,高于并紫蘇1號,表明DGAT2基因在紫蘇種子TAG生物合成過程中起重要作用。
[1] 陸潔靜,任文彬. 紫蘇的研究概況[J]. 農(nóng)產(chǎn)品加工·學(xué)刊,2009(6):32-34.
[2] 張曉彬,姜文鑫,張 琳,等.紫蘇的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā),2015(7):140-143.
[3] 張燕平,王維華,董貴玲. 紫蘇中天然抗氧化物質(zhì)的提取及增效作用的研究[J]. 西部糧油科技,2000,25(2):36-39.
[4] Nitta M,Kobayashi H,Ohnishi-Kameyama M,et al. Essential oil variation of cultivated and Wild perilla analyzed by GC/MS[J]. Biochemical Systematics and Ecology,2006,34(1):25-37.
[5] 李麗萍,韓 濤. 富含α-亞麻酸植物資源的開發(fā)與利用[J]. 食品科學(xué),2007,28(11):614-618.
[6] 王麗梅,葉 誠,吳 晨,等.紫蘇油對衰老模型大鼠的抗衰老作用研究[J].食品科技,2013(1):280-284.
[7] 李會珍,孫子文,李曉君,等.紫蘇種子性狀與主要營養(yǎng)成分相關(guān)性分析[J].中國糧油學(xué)報(bào),2013,28(10):55-59.
[8] 彭小平,熊勁松.我國紫蘇產(chǎn)業(yè)化研究現(xiàn)狀與展望[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(16):8709- 8711.
[9] Saha S,Enugutti B,Rajakumari S,et al. Cytosolic triacylglycerol biosynthetic pathway in oil seeds.Molecular cloning and expression of peanut cytosolic diacylglycerol acyltransferase[J]. Plant Physiology,2006,141(4):1533-1543.
[10] 朱紅霞,胡利宗,鄧小莉,等. 三種豆科植物DGAT1基因家族的分子特征與進(jìn)化分析[J]. 生物技術(shù)通報(bào),2011(10):163-166.
[11] Shockey J M,Gidda S K,Chapital D C,et al. Tung tree DGAT1 and DGAT2 have nonredundant functions in triacylglycerol biosynthesis and are localized to different subdomains of the endoplasmic reticulum[J]. The Plant Cell,2006,18(9):2294-2313.
[12] Chen H C, Farese R V. Inhibition of triglyceride synthesis as a treatment strategy for obesity: lessons from DGAT1-deficient mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2005,25(3):482-486.
[13] 王計(jì)平,張玲慧,李潤植,等. 紫蘇種子脂肪酸代謝及關(guān)鍵酶基因調(diào)控油脂合成規(guī)律的研究[J]. 中國糧學(xué)報(bào),2016,31(3):91-95.
[14] Lardizabal K,Effertz R,Levering C,et al. Expression ofUmbelopsisramannianaDGAT2Ain seed increases oil in soybean[J]. Plant Physiol,2008,148(1):89-96.
[15] 劉貴芹,邵 群,黃榮峰,等. 大豆DGAT基因家族的鑒定和表達(dá)分析[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(12):55-61.
[16] 鄭 玲,史靈敏,田?,?,等. 花生AhDGAT2a基因啟動子的克隆和功能驗(yàn)證[J]. 作物學(xué)報(bào),2016,42(7):1094-1099.
[17] Chi X, Hu R, Zhang X, et al. Cloning and functional analysis of three diacylglycerol acyltransferase genes from peanut (ArachishypogaeaL.)[J].PLoS One,2014,9:e105834.
[18] 王龍龍.花生二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶(DGAT)基因的克隆與分析[D].濟(jì)南:山東師范大學(xué),2010.
[19] 張 洪,黃建韶,趙東海. 紫蘇營養(yǎng)成分的研究[J]. 食品與機(jī)械,2006,22(2):41-43.
[20] 張春平,何 平,何俊星,等.不同處理對藥用紫蘇種子萌發(fā)特性的影響[J].中草藥,2010,41(8):1361-1365.
BioinformaticsandExpressionAnalysisofPfDGAT2GeneinPerillafrutescens
LIANG Qian,LI Lu,ZHOU Yali,AN Xi,WANG Jiping
(College of Agronomy,Shanxi Agricultural University,Taigu 030801,China)
In order to study the regulatory role of Diacylgycerol Acyltransferase 2 (PfDGAT2) in the process of oil and lipid synthesis ofPerillafrutescensseeds, the structure and functions of the protein were analyzed by bioinformatics methods, and the gene expression characteristics were studied in differentPerillafrutescensvarieties. The results showed thatPfDGAT2 gene full-length cDNA was 1 249 bp,encoding 329 amino acid.PfDGAT2 protein isoelectric point was 9.46,belonging to the basic protein. The secondary structure prediction showed that the main components of PfDGAT2 protein were random coil (34.65%) and alpha helix (30.09%). Phylogenetic tree analysis indicated thatPerillafrutescenshad closer genetic relationship withSesamumindicumandNicotianatabacum,and had farther relationship withOleaeuropaea. By studying the expression characteristics ofPfDGAT2 gene in two differentPerillafrutescensvarieties, the relationship betweenPfDGAT2 gene expression and oil content was analyzed. The results showed that the expression level of the gene was the highest at 30 days after flowering, but there was a certain difference between two varieties. The expression level of Jinzisu 1 (oil content 46.88%) was 1.63 times of that of 10 days after flowering, but Bingzisu 1 (oil content 35.60%) was 0.75 times.It suggested thatDGAT2 gene played a major regulatory role in TAG biosynthesis ofPerillafrutescens.
Perillafrutescens;Diacylgycerol acyltransferase 2(DGAT2);Bioinformatics;Expression analysis
2017-08-26
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31201266);山西省晉中市科技重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(農(nóng)業(yè))項(xiàng)目(Y172007-5)
梁 倩(1990-),女,山西臨汾人,在讀碩士,主要從事紫蘇脂肪酸代謝機(jī)理研究。
王計(jì)平(1974-),女,山西陽泉人,副教授,博士,碩士生導(dǎo)師,主要從事植物油脂代謝機(jī)理研究。
S565.03;Q78
A
1000-7091(2017)05-0086-05
10.7668/hbnxb.2017.05.013