張雪薇，劉 侖，魯黎明，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

煙草磷酸酶基因NtPP2C16的克隆、表達(dá)載體構(gòu)建及表達(dá)分析

張雪薇，劉 侖，魯黎明，李立芹

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，四川 成都 611130)

2C型絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶(PP2C-type protein phosphatases，PP2C)是ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵組分，在植物生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)及應(yīng)對(duì)逆境脅迫的過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。為探究PP2C基因在煙草適應(yīng)非生物脅迫中的功能，從煙草栽培品種K326中克隆到了一個(gè)PP2C同源基因，該基因開(kāi)放閱讀框?yàn)? 617 bp，編碼538個(gè)氨基酸殘基。同源性分析結(jié)果顯示，該基因所編碼的蛋白與絨毛狀煙草PP2C16的親緣關(guān)系最近，故命名為NtPP2C16。生物信息學(xué)分析表明，NtPP2C16催化區(qū)域上具有PP2C家族進(jìn)化中相對(duì)保守的11個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)。qRT-PCR研究分析結(jié)果表明：該基因的表達(dá)顯著受ABA和H2O22種信號(hào)分子誘導(dǎo)，并且響應(yīng)干旱、高鹽、低溫和低鉀脅迫。成功構(gòu)建NtPP2C16-pBI121過(guò)表達(dá)載體，為解析NtPP2C16參與煙草非生物逆境脅迫響應(yīng)提供一定的理論依據(jù)。

煙草；NtPP2C16；克??；序列分析；表達(dá)

蛋白磷酸酶和蛋白激酶參與催化的蛋白質(zhì)可逆磷酸化反應(yīng)不僅是存在于生物體內(nèi)的一種最為普遍的調(diào)節(jié)方式，也是植物細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中的重要機(jī)制之一[1]。蛋白磷酸酶根據(jù)底物分子去磷酸化氨基酸殘基的不同，主要可分為三大類(lèi)：Ser/Thr型蛋白磷酸酶(Protein serine/threonine phosphatases，PSPs)、Tyr型蛋白磷酸酶(Protein tyrosine phosphatases，PTPs)和雙重底物特異性蛋白磷酸酶(Dual specific protein phosphatase，DSPs )，近年研究還發(fā)現(xiàn)His型蛋白磷酸酶，能催化His殘基的去磷酸化，PP2C蛋白是一類(lèi)依賴Mg2+或Mn2+的單體Ser/Thr蛋白磷酸酶[2-3]。PP2Cs是一類(lèi)多基因家族，廣泛的參與逆境信號(hào)的傳遞過(guò)程，目前已經(jīng)從模式植物擬南芥和水稻中分別鑒定到80，78個(gè)PP2C家族成員[4]。

研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中PP2C類(lèi)蛋白磷酸酶參與脫落酸(Abscisic acid，ABA)、茉莉酸(Jasmonic acid，JA)、水楊酸(Salicylic acid，SA)等多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[5-7]。擬南芥PP2C類(lèi)蛋白A亞族成員ABI1、ABI2、HAB1、HAB2、AHG1、PP2CA等，能與一種正調(diào)控因子SnRK2(SNF1-related protein kinase)蛋白激酶互作，在ABA信號(hào)通路參與的植物對(duì)逆境脅迫的適應(yīng)性反應(yīng)過(guò)程中起負(fù)調(diào)控作用[8-10]。擬南芥中G類(lèi)PP2C蛋白AtPP2CG1能夠調(diào)控?cái)M南芥對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，且該調(diào)控依賴于ABA，AtPP2CG1是鹽脅迫和ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)控因子[11]。擬南芥中AtPP2CA能夠與保衛(wèi)細(xì)胞外向K+通道GORK相互作用，調(diào)節(jié)K+的轉(zhuǎn)運(yùn)和氣孔關(guān)閉[12]。水稻中編碼一類(lèi)PP2C蛋白的基因OsPP18過(guò)表達(dá)能增強(qiáng)水稻對(duì)滲透和氧化脅迫的耐受性，該途徑不依賴于ABA[13]。玉米ZmPP2C2基因過(guò)表達(dá)能提高轉(zhuǎn)基因植株對(duì)低溫的耐受性，通過(guò)激活抗氧化系統(tǒng)降低胞內(nèi)H2O2的積累量[14]。擬南芥PP2C蛋白能與一種微管相關(guān)蛋白MASP1結(jié)合，在干旱脅迫中起負(fù)調(diào)控作用[15]。綜上所述，PP2C家族基因的功能與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、非生物逆境脅迫以及細(xì)胞內(nèi)H2O2水平密切相關(guān)。

煙草作為我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物之一，保障我國(guó)煙草產(chǎn)區(qū)的產(chǎn)量和質(zhì)量對(duì)于我國(guó)財(cái)政收入以及煙區(qū)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)發(fā)展尤為重要。低鉀、干旱、鹽堿、冷害等非生物脅迫嚴(yán)重影響煙葉的產(chǎn)量及品質(zhì)[16]。PP2C類(lèi)蛋白磷酸酶在植物適應(yīng)或抵制非生物脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，本研究從煙草K326中克隆到一個(gè)NtPP2C16基因，對(duì)NtPP2C16基因編碼的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)相關(guān)分析，運(yùn)用qRT-PCR分析該基因在不同組織中的表達(dá)水平以及在信號(hào)分子和非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式，并成功構(gòu)建NtPP2C16-pBI121過(guò)表達(dá)載體。對(duì)于闡明煙草響應(yīng)外界非生物脅迫的分子機(jī)制和相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑具有重要意義，為有效利用基因工程技術(shù)改良品種提供一定的理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料及主要試劑

供試植物材料為煙草栽培品種K326(Nicotianatabacumcv.K326)，由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存。將煙草種子進(jìn)行表面消毒，75%乙醇1 min，20%次氯酸鈉溶液20 min，無(wú)菌水反復(fù)清洗5次，隨后將種子置于MS培養(yǎng)基上發(fā)芽生長(zhǎng)15 d，挑取長(zhǎng)勢(shì)一致的煙草幼苗分別進(jìn)行H2O2、ABA、干旱、高鹽、低溫及低鉀處理，每個(gè)處理設(shè)有3個(gè)重復(fù)，處理相應(yīng)時(shí)間(0，3，6，12，24 h)后進(jìn)行整株取樣。H2O2、ABA、干旱、高鹽處理培養(yǎng)基是在MS培養(yǎng)基中分別加入H2O2(10 mmol/L)、ABA(1 μmol/L)、PEG6000(5%)、NaCl(200 mmol/L)。低溫處理時(shí)將待處理材料放置4 ℃的光照培養(yǎng)箱中。低鉀處理時(shí)將待處理材料轉(zhuǎn)移至低鉀MS培養(yǎng)基中，低鉀MS培養(yǎng)基是將MS培養(yǎng)基中的KH2PO4替換為NH4H2PO4，并去掉KNO3。其余成分相同，經(jīng)測(cè)定鉀離子濃度為10 μmol/L。

E.coli感受態(tài)DH5α購(gòu)自Vazyme Biotech公司，TRIzol試劑、高保真酶Pfu、pMD19-T和pBI121載體、cDNA 合成試劑盒，SYBR Green Master Mix、限制性內(nèi)切酶、DNA Ligation Kit 2.0等試劑購(gòu)自TaKaRa，通用型DNA純化回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN，引物合成與測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)有限公司完成。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 目的基因克隆 運(yùn)用同源克隆的方法，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)收錄的絨毛狀煙草PP2C16序列(LOC104108656)，設(shè)計(jì)一對(duì)NtPP2C16引物：NtPP2C16-F：5′-TCTAGAATGGAGGAGTTGTCTCCAGC-3′，

NtPP2C16-R：5′-CCCGGGTTAACATTTGCTCTTGAATT-3′，下劃線部分分別為XbaⅠ和SmaⅠ酶切位點(diǎn)。以煙草葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一條鏈為模板，PCR擴(kuò)增NtPP2C16的ORF全長(zhǎng)，擴(kuò)增反應(yīng)條件為：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，34 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。目的片段經(jīng)回收純化、補(bǔ)A、連接pMD19-T克隆載體、轉(zhuǎn)化E.coliDH5α 后，氨芐青霉素抗性篩選，菌落PCR 鑒定陽(yáng)性克隆，送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 生物信息學(xué)分析 ProtParam(http：//web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)NtPP2C16蛋白的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)；SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/)和SWISS-MODEL (https：//swissmodel.expasy.org/)在線預(yù)測(cè)NtPP2C16蛋白的二三級(jí)結(jié)構(gòu)；SMART(http：//smart.embl-heidelberg.de/)分析蛋白的保守結(jié)構(gòu)域；NetPhos3.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)分析蛋白磷酸化位點(diǎn)；PSORT(http：//psort1.hgc.jp/form.html)預(yù)測(cè)NtPP2C16的亞細(xì)胞定位；Signal-P4.1(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；BlastP比對(duì)分析，MEGA5軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 表達(dá)分析 Primer 5.0設(shè)計(jì)NtPP2C16基因qRT-PCR引物：NtPP2C16-qF：5′-GCCTCTGAACCTATT

GCC-3′，NtPP2C16-qR：5′-TGCCACGATAAAGGACTG-3′；

煙草18 SrRNA為內(nèi)參，引物序列為18S-F：5′-CCTACGCTCTGTATACATTAGC-3′；18S-R：5′-GTGTTGA

GTCAAATTAAGCCGC-3′?；虻南鄬?duì)表達(dá)量計(jì)算方法為2-ΔΔCt法，每組樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體 重組克隆載體NtPP2C16-pMD19-T與表達(dá)載體pBI121用內(nèi)切酶XbaI和SmaⅠ進(jìn)行雙酶切，酶切體系10 μL：10×T Buffer 1 μL，BSA 1 μL，XbaⅠ 1 μL，SmaⅠ 1 μL，NtPP2C16-pMD19-T/pBI121載體4 μL，ddH2O 2 μL。目的片段回收純化、連接pBI121表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α，卡那霉素抗性篩選，菌落PCR檢測(cè)鑒定陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，酶切檢測(cè)并送至上海生工生物工程技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1NtPP2C16基因克隆

以煙草幼苗葉片RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA第一條鏈為模板，PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物大小為1 500～2 000 bp(圖1)，長(zhǎng)度大小與預(yù)期目標(biāo)相符?；厥占兓康钠魏?，連接pMD19-T載體，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α。運(yùn)用菌落PCR方法鑒定陽(yáng)性克隆，挑選陽(yáng)性克隆送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：目的片段大小為1 617 bp。

M.Marker 2000 bp；1.NtPP2C16基因。M.Marker 2000 bp；1.NtPP2C16 gene PCR product.

2.2構(gòu)建NtPP2C16-pBI121過(guò)表達(dá)載體

將重組克隆載體NtPP2C16-pMD19-T與表達(dá)載體pBI121分別進(jìn)行雙酶切，連接轉(zhuǎn)化E.coli感受態(tài)后，挑選單菌落進(jìn)行菌落PCR，篩選構(gòu)建成功的陽(yáng)性克隆，搖菌提取質(zhì)粒，XbaⅠ和SmaⅠ雙酶切進(jìn)行檢測(cè)(圖2)。并送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果顯示：目的片段大小為1 617 bp，表明NtPP2C16-pBI121過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建成功。

M.Marker 2000 bp；1.NtPP2C16基因酶切片段。M.Marker 2000 bp；1.NtPP2C16 gene digested fragments.

2.3NtPP2C16蛋白序列分析

2.3.1 NtPP2C16蛋白理化性質(zhì)及疏水性分析 ProtParam預(yù)測(cè)NtPP2C16蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，該蛋白編碼538個(gè)氨基酸殘基：絲氨酸Ser (55，10.2%)、纈氨酸Val(51，9.5%)、亮氨酸Leu(48，8.9%)、谷氨酸Glu(46，8.6%)、丙氨酸Ala(38，7.1%)，而酪氨酸Tyr(7，1.3%)和色氨酸Trp(7，1.3%)含量較低。該蛋白預(yù)測(cè)的分子量為58.4 kDa，理論等電點(diǎn)pI為4.82，不穩(wěn)定系數(shù)(Instability index)是43.17，該蛋白可能是一個(gè)不穩(wěn)定的蛋白。該蛋白總的親水性平均指數(shù)為-0.108，DNAMAN軟件進(jìn)行的疏水性分析結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)該蛋白屬于親水性蛋白(圖3)。

圖3 NtPP2C16疏水區(qū)預(yù)測(cè)Fig.3 Hydrophobic region prediction of NtPP2C16

2.3.2 NtPP2C16蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) IBCP在線工具SOPMA預(yù)測(cè)NtPP2C16蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示：該蛋白中36.99%的氨基酸參與無(wú)規(guī)則卷曲(Random coil)，31.41%氨基酸參與α-螺旋(Alpha helix)，22.49%的氨基酸參與延伸鏈(Extended strand)，僅有9.11%的氨基酸參與β-轉(zhuǎn)角(Beta turn)，由此可見(jiàn)，該蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的最大元件為無(wú)規(guī)則卷曲。SWISS-MODEL預(yù)測(cè)NtPP2C16蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)進(jìn)行比照，結(jié)果較為統(tǒng)一(圖4)。

A.二級(jí)結(jié)構(gòu)；B.三級(jí)結(jié)構(gòu)。A.Secondary structure；B.Tertiary structure.

2.3.3 NtPP2C16蛋白磷酸化位點(diǎn)分析 NetPhos 3.1是利用神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)真核細(xì)胞蛋白質(zhì)中絲氨酸(Serine) 、蘇氨酸(Threonine)和酪氨酸(Tyrosine)磷酸化位點(diǎn)工具，NetPhos中的內(nèi)設(shè)閾值為0.5，高于0.5，被認(rèn)為是可能的磷酸化位點(diǎn)。NetPhos 3.1對(duì)NtPP2C16蛋白中磷酸化位點(diǎn)分析結(jié)果表明(圖5)，NtPP2C16中含有35個(gè)Ser激酶磷酸化位點(diǎn)，5個(gè)Thr激酶磷酸化位點(diǎn)和3個(gè)Tyr激酶磷酸化位點(diǎn)。說(shuō)明NtPP2C16蛋白能被激酶所磷酸化，從而參與非生物逆境脅迫響應(yīng)過(guò)程的調(diào)控。

圖5 NtPP2C16的磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.5 Phosphorylation site prediction of NtPP2C16

2.3.4 NtPP2C16蛋白保守結(jié)構(gòu)域及亞細(xì)胞定位分析 SMART軟件分析NtPP2C16蛋白保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果表明(圖6)，該蛋白含有PP2C家族典型的結(jié)構(gòu)域，位于第210-528位氨基酸。對(duì)蛋白質(zhì)信號(hào)肽的分析有助于蛋白質(zhì)功能域的區(qū)分及蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位，利用Signal-P4.1軟件預(yù)測(cè)結(jié)果表明：該蛋白不是分泌蛋白，不存在信號(hào)肽。利用PSORT在線預(yù)測(cè)NtPP2C16的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，在質(zhì)膜上占0.460，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上占0.100，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中占0.100，預(yù)測(cè)NtPP2C16可能定位在質(zhì)膜上。

圖6 NtPP2C16的結(jié)構(gòu)域分析Fig.6 Structure domain analysis of NtPP2C16

2.3.5 NtPP2C16同源性分析 通過(guò)與模式植物擬南芥中PP2C蛋白ABI1、ABI2、HAB1和HAB2進(jìn)行多重序列對(duì)比，發(fā)現(xiàn)NtPP2C16具有PP2C家族典型的結(jié)構(gòu)特征，即催化區(qū)域上含有進(jìn)化中相對(duì)保守的11個(gè)結(jié)構(gòu)亞區(qū)[17](圖7-A)，NtPP2C16蛋白的C端比較保守，N端含有一段保守性較弱的延伸區(qū)域。將NtPP2C16氨基酸序列與其他植物同源性比較近的PP2C16序列進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果表明，NtPP2C16與絨毛狀煙草PP2C16、林煙草PP2C16、漸窄葉煙草PP2C16等具有較高的氨基酸序列同源性，分別為99%，99%，97%；與中國(guó)白梨PP2C16、蘋(píng)果PP2C16的同源性最低，為61%(圖7-B)。

A.NtPP2C16蛋白多重序列比對(duì)；B.NtPP2C16蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。A.Multiple sequence alignment of NtPP2C16；B. Phylogenetic tree of NtPP2C16.

2.4NtPP2C16的組織表達(dá)分析

提取K326幼苗期的根、莖、葉以及成熟期的花RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA為模板，進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，分析NtPP2C16在各個(gè)組織的表達(dá)量，分析結(jié)果表明(圖8-A)，NtPP2C16的表達(dá)量在葉中較高，莖中次之，根中表達(dá)量最低。說(shuō)明NtPP2C16基因在煙草K326各個(gè)組織中均有表達(dá)，但主要在煙草植株的葉和莖中表達(dá)，在不同組織中的表達(dá)豐度不同表明該基因的表達(dá)存在組織特異性。

2.5NtPP2C16在信號(hào)分子處理下的表達(dá)分析

10 mmol/L H2O2及1 μmol/L ABA處理煙草K326幼苗，對(duì)NtPP2C16基因的表達(dá)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，H2O2和ABA處理的早期3 h時(shí)，NtPP2C16基因的表達(dá)量都上升到最大值，分別為對(duì)照(0 h)的3.19倍(圖8-B)和2.99倍(圖8-C)。這些結(jié)果表明，NtPP2C16能夠響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)的信號(hào)分子調(diào)控，其表達(dá)顯著受到H2O2和ABA的誘導(dǎo)(P<0.05)。

圖8 NtPP2C16的不同組織及信號(hào)分子處理下的表達(dá)模式Fig.8 Expression pattern of NtPP2C16 in different tissues and under signal molecular treatment

2.6NtPP2C16在非生物逆境脅迫處理下的表達(dá)分析

5%PEG6000、200 mmol/L NaCl、4 ℃及10 μmol/L K+模擬干旱、高鹽、低溫及低鉀脅迫，對(duì)NtPP2C16在逆境脅迫下的表達(dá)模式進(jìn)行分析。結(jié)果表明，PEG、NaCl和低溫處理后，該基因的表達(dá)量都在6 h時(shí)達(dá)到最大值，分別為對(duì)照(0 h)的2.19倍(圖9-A)、8.60倍(圖9-B)和4.70倍(圖9-C)。低鉀處理下，NtPP2C16的表達(dá)在處理早期3 h受到顯著抑制(P<0.05)，僅為對(duì)照(0 h)的0.24倍(圖9-D)。上述結(jié)果表明，NtPP2C16基因能夠參與非生物逆境脅迫，其表達(dá)響應(yīng)干旱、高鹽、低溫以及低鉀處理。

圖9 NtPP2C16在非生物逆境脅迫下的表達(dá)模式Fig. 9 Expression pattern of NtPP2C16 under abiotic stress

3 討論

本研究從普通煙草栽培品種K326中克隆到一個(gè)PP2C家族成員NtPP2C16的cDNA序列，其ORF為1 617 bp，編碼538個(gè)氨基酸。SMART分析和多重序列對(duì)比發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白具有PP2C家族保守的功能結(jié)構(gòu)域，包含11個(gè)蛋白激酶催化結(jié)構(gòu)域，其中包括與二價(jià)金屬離子結(jié)合的MED、DGH、DG、D殘基和與磷酸鹽離子結(jié)合的R殘基。該蛋白的氨基酸同源區(qū)域主要位于C端的催化結(jié)構(gòu)域，而N端的保守性相對(duì)較弱，含有一段延伸區(qū)域，此區(qū)域可能參與調(diào)控PP2C的活性或者在底物的特異性識(shí)別過(guò)程中起作用，包括一些轉(zhuǎn)錄因子特征序列和激酶互作區(qū)域等，PP2C結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性賦予它不同的功能[18]。

組織表達(dá)分析結(jié)果表明，NtPP2C16基因的表達(dá)具有組織特異性，在煙草葉和莖中的表達(dá)量較高，在根中的表達(dá)量最低，與水稻OsBIPP2C1和OsBIPP2C2的組織表達(dá)模式較為一致[19]。白菜BcABI1的表達(dá)量在花和葉片中較高，在莖中最低[20]，擬南芥AtPP2C46基因的表達(dá)量在花中最高，在根中最低[21]。盡管PP2C同源基因序列較為保守，但PP2C家族中不同成員的組織表達(dá)模式存在差異，不同物種間PP2C同源基因的功能也存在差異，并發(fā)揮著特定的作用。

植物遭受外界逆境脅迫會(huì)引起體內(nèi)代謝水平的變化，ABA、H2O2、乙烯等一些信號(hào)分子會(huì)顯著積累，這些信號(hào)分子通過(guò)參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的交互作用，形成復(fù)雜的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)調(diào)控植物對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答，在植物應(yīng)對(duì)生物和非生物逆境脅迫的適應(yīng)性過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。qRT-PCR分析結(jié)果表明：ABA信號(hào)分子處理后，NtPP2C16的表達(dá)受到顯著誘導(dǎo)，與歐美楊PdPP2C在ABA處理后的表達(dá)模式類(lèi)似[22]，而玉米ZmPP2C在ABA處理后的表達(dá)卻受到顯著抑制[23]。H2O2信號(hào)分子處理后，NtPP2C16在誘導(dǎo)的早期轉(zhuǎn)錄水平就達(dá)到最大值，與二穗短柄草BdPP2C1在H2O2處理后的表達(dá)模式不同，BdPP2C1的表達(dá)受到H2O2的顯著抑制[24]。

非生物逆境脅迫下，NtPP2C16的轉(zhuǎn)錄水平均出現(xiàn)顯著變化，該基因的表達(dá)受干旱、高鹽和低溫脅迫誘導(dǎo)，這一結(jié)果與雙子葉植物擬南芥中的一些PP2C基因的表達(dá)模式相似。大多數(shù)的擬南芥A類(lèi)PP2C家族基因的轉(zhuǎn)錄水平都能被滲透、高鹽、低溫等非生物脅迫和ABA誘導(dǎo)[25]。而與小麥、水稻、玉米等單子葉植物中的一些PP2C基因的表達(dá)模式不同，小麥TaPP2C59的表達(dá)受到低溫和高鹽脅迫抑制[26]，水稻中5個(gè)A類(lèi)PP2C基因能被低溫脅迫抑制[27]，玉米ZmPP2C的表達(dá)受干旱抑制[23]。因此，猜測(cè)PP2C基因家族的表達(dá)模式可能在單子葉和雙子葉植物中發(fā)生了分化。NtPP2C16的表達(dá)還顯著受低鉀脅迫的抑制，擬南芥中AtPP2CA能與鉀離子通道AKT2和AKT3互作，調(diào)控鉀離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和膜極化[28-29]。因此，猜測(cè)NtPP2C16參與煙草抵御干旱、高鹽、低溫及低鉀非生物脅迫刺激的應(yīng)答反應(yīng)，調(diào)控著相關(guān)信號(hào)分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。研究NtPP2C16將有助于理解煙草對(duì)逆境脅迫的應(yīng)答機(jī)制。在隨后的研究工作中，將利用CRISPR基因編輯技術(shù)或過(guò)量表達(dá)的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因株系。通過(guò)分析轉(zhuǎn)基因株系應(yīng)對(duì)非生物脅迫的表型，并測(cè)定相關(guān)的生理指標(biāo)和檢測(cè)Marker 基因的表達(dá)，同時(shí)利用酵母雙雜交試驗(yàn)驗(yàn)證與鉀離子通道蛋白的互作，闡明NtPP2C16在非生物逆境脅迫中的功能及作用機(jī)制。

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Cloning，ConstructionofExpressionVectorandExpressionAnalysisofNtPP2C16inNicotianaTabacum

ZHANG Xuewei，LIU Lun，LU Liming，LI Liqin

(College of Agronomy，Sichuan Agricultural University，Chengdu 611130，China)

2C protein phosphatase (PP2C) is a key component in the ABA signal transduction pathway and plays a pivotal role in plant growth and development，cell cycle regulation and adaptation to adversity stresses.To explore the function of thePP2Cgene in tobacco adaptation to abiotic stress，aPP2Chomologous gene was cloned from the tobacco cultivar K326，which contained a 1 617 bp ORF encoding 538 amino acid. The homology analysis showed that the gene had high homology with PP2C16 ofNicotianatomentosiformis. So it was namedNtPP2C16. Bioinformatics analysis showed that the NtPP2C16 catalytic region had 11 structural sub-regions which were relatively conservative in the PP2C family evolution. qRT-PCR analysis revealed that the expression of this gene was significantly induced by ABA and H2O2signal molecules，and responded to drought，high salt，low temperature and low potassium stresses.NtPP2C16-pBI121 overexpression vector was constructed successfully，the results provided some basis for analysis ofNtPP2C16 responsing to abiotic stresses in tobacco.

Tobacco；NtPP2C16；Cloning；Sequence analysis；Expression

2017-08-11

植物生理學(xué)與生物化學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(SKLPPBKF1505；SKLPPBKF1506)

張雪薇(1993-)，女，四川自貢人，在讀碩士，主要從事煙草分子生物學(xué)研究。

李立芹(1974-)，女，山東東阿人，副教授，博士，碩士生導(dǎo)師，主要從事植物分子生物學(xué)研究。

Q78；S572.03

A

1000-7091(2017)05-0078-08

10.7668/hbnxb.2017.05.012