李立新，司守霞，魏安智，劉玉林，馮世靜 ，楊途熙

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471002)

基于花椒轉(zhuǎn)錄組序列SSR分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)及花椒種質(zhì)鑒定

李立新1，司守霞2，魏安智1，劉玉林1，馮世靜1，楊途熙1

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)，陜西 楊凌 712100；2.河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471002)

為拓展分子標(biāo)記在花椒種質(zhì)資源分析中的應(yīng)用、開(kāi)發(fā)花椒EST-SSR功能性分子標(biāo)記、分析花椒DNA指紋圖譜，利用鳳縣大紅袍花椒的莖尖節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中45 057條長(zhǎng)度大于200 bp的非冗余 Unigene序列，使用MIcroSAtellite(MISA)軟件搜索SSR位點(diǎn)，分析花椒cDNA序列中SSR位點(diǎn)的頻率和密度、SSR重復(fù)基元種類(lèi)及比例、SSR重復(fù)次數(shù)與數(shù)量等分布特征；用Primer 3.0軟件在線設(shè)計(jì)SSR引物并經(jīng)PCR擴(kuò)增篩選適合的多態(tài)性引物；用Quantity One軟件統(tǒng)計(jì)多態(tài)性條帶和分子量大小；NTsys 2.0軟件分析12份花椒種質(zhì)的遺傳距離、構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖及DNA指紋圖譜庫(kù)。結(jié)果表明，45 057條序列中有3 315 條Unigene序列包含SSR位點(diǎn)，共3 814個(gè)，3 315條序列中SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為7.07%；在檢索出的 SSR位點(diǎn)中，二核苷酸、三核苷酸是主要重復(fù)類(lèi)型，分別占29.42%和58.58%，二核苷酸重復(fù)中以AG/TC、CT/GA 出現(xiàn)頻率最高，三核苷酸重復(fù)中GAA/CTT、AGA/TCT出現(xiàn)頻率最高；二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元總數(shù)隨著重復(fù)次數(shù)的增加呈明顯下降趨勢(shì)。利用Primer 3.0設(shè)計(jì)的64對(duì)EST-SSR引物中，55對(duì)引物能產(chǎn)生預(yù)期片段大小的 PCR 產(chǎn)物，其中18對(duì)引物具有多態(tài)性；利用18對(duì)引物對(duì)12份花椒種質(zhì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，共產(chǎn)生81條擴(kuò)增條帶，其中多態(tài)性條帶73條，多態(tài)率為90.12%；各花椒種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)為0.552 6～0.894 7，平均為0.725 0；經(jīng)UPGMA聚類(lèi)分析在相似系數(shù)0.70處12份花椒種質(zhì)共分為3類(lèi)，即頂壇花椒為Ⅰ類(lèi)、竹葉椒為Ⅱ類(lèi)、其他花椒為Ⅲ類(lèi)；指紋圖譜分析中，8對(duì)引物在5份種質(zhì)中能擴(kuò)增出特征帶型，最少用3對(duì)引物進(jìn)行組合即可將12份花椒種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。成功在鳳縣大紅袍花椒的莖尖節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組cDNA 序列中開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記，設(shè)計(jì)并篩選出8對(duì)能擴(kuò)增出特征帶型的引物，最少用3對(duì)引物進(jìn)行組合即可將12份花椒種質(zhì)區(qū)分開(kāi)，這為今后花椒遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等方面提供新的引物序列并奠定了基礎(chǔ)。

花椒；EST-SSR；引物開(kāi)發(fā)；指紋圖譜

花椒(ZanthoxylumbungeanumMaxim)為蕓香科花椒屬植物，是我國(guó)的特色辛香料和中藥材，也是目前退耕還林中重要的生態(tài)型山地栽培經(jīng)濟(jì)樹(shù)種[1]。花椒為單性結(jié)實(shí)，無(wú)融合生殖率較高[2]，因此遺傳穩(wěn)定性較高，這對(duì)花椒的良種選育提供了有力的理論依據(jù)。目前關(guān)于花椒的研究主要集中在花椒精油提取與分析、成分功能及開(kāi)發(fā)利用等方面[3-5]，在DNA分子水平上對(duì)花椒的研究雖然已有RAPD[6]、ISSR[7]、SRAP[8]及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[9]等方面的報(bào)道，但尚未見(jiàn)有關(guān)EST-SSR的報(bào)道。

EST-SSR(Expressed sequence tag based simple sequence repeat)是基于EST序列或cDNA數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)的一種標(biāo)記[10]；它來(lái)源于功能基因，可直接反映功能基因的多樣性，具備基因組SSR標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn)和引物開(kāi)發(fā)成本低、通用性好等特點(diǎn)，而且與生理生化特征和某些形態(tài)特征相關(guān)聯(lián)[11]；現(xiàn)已廣泛應(yīng)用在植物遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建及分子標(biāo)記輔助育種等方面的研究[12]。該標(biāo)記已在小麥[10-13]、柑橘[14-15]、枳殼[16]、蘋(píng)果[17-19]等植物中得到開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的進(jìn)展，基于EST序列的SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)也在日趨增加[20]，收錄的EST數(shù)目也由1991年的不足2 000條發(fā)展到2010年的65 255 769條(共涉及1 978個(gè)物種)，目前，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的植物EST的數(shù)量已多達(dá)76 165 384條。

但是，迄今為止NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中收錄的花椒EST 序列數(shù)量還很少，可供選擇性范圍較??；鑒于此，本試驗(yàn)對(duì)獲得的花椒cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中非冗余序列進(jìn)行了SSR信息發(fā)掘和EST-SSR標(biāo)記引物開(kāi)發(fā)，分析了花椒指紋圖譜，希望能為花椒EST-SSR分子標(biāo)記的研究、遺傳圖譜構(gòu)建及品種鑒定、良種選育提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

轉(zhuǎn)錄組序列樣本材料為鳳縣大紅袍花椒的莖尖節(jié)點(diǎn)，共包含45 057條 Unigenes序列。SSR擴(kuò)增所用花椒樣品(種質(zhì))來(lái)源于國(guó)家林業(yè)局花椒工程技術(shù)研究中心鳳縣花椒試驗(yàn)示范站 (表1)。

選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的植株進(jìn)行采樣。每個(gè)樣品取5株重復(fù)。采樣時(shí)，采集不同花椒種質(zhì)的新鮮嫩葉，用冰袋保鮮，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-70 ℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1 花椒基因組DNA提取 試驗(yàn)方法參照李曉等[21]的CTAB法對(duì)花椒嫩葉進(jìn)行基因組DNA提取，取1.5 μL 所提取的DNA 于超微量核酸分析儀上測(cè)定其在紫外光波長(zhǎng)260，280 nm處的吸光比值以檢測(cè)所提取DNA的純度和DNA濃度。將基因組DNA于-20 ℃保存，用于后續(xù)SSR-PCR分析。

1.2.2 序列搜索及SSR位點(diǎn)查找 cDNA序列來(lái)源于蔣弘剛等[9]使用二代高通量測(cè)序技術(shù)獲得的鳳縣大紅袍花椒莖尖節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，以組裝出來(lái)的 Unigene 作為參考序列，使用 MIcroSAtellite(MISA)軟件找出所有的 SSR位點(diǎn)[22]。本試驗(yàn)SSR位點(diǎn)的查找參照劉博等[23]SSR位點(diǎn)搜索的標(biāo)準(zhǔn)：二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)分別大于或等于6，5，4，4，3次；一般查找到的SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)越多，相關(guān)的多態(tài)性也就越高[24]，并分析 SSR 在cDNA序列中的分布特征。

表1 花椒試驗(yàn)材料Tab．1 Zanthoxylum bungeanum accessions used in this study

1.2.3 EST-SSR引物設(shè)計(jì) 引物設(shè)計(jì)參照崔海榮等[25]引物開(kāi)發(fā)的方法和原則：cDNA序列的長(zhǎng)度大于100 bp；選擇二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)分別大于或等于10，6，5，5，4 次的序列且SSR位點(diǎn)的開(kāi)始和結(jié)束位置距5′和3′端均不少于50 bp；引物GC 含量為40%～60%，最佳為50%；退火溫度為50～ 60 ℃，最佳溫度為55 ℃，上下游引物相差不大于5 ℃；引物長(zhǎng)度為 18～25 bp，最佳為20 bp；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度100～500 bp；應(yīng)盡量避免引物二聚體(Dimer)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)(Hairpin)以及連續(xù)6個(gè)堿基配對(duì)的出現(xiàn)；用Primer 3.0[26]軟件在線設(shè)計(jì)SSR 側(cè)翼區(qū)域引物，其他參數(shù)采用默認(rèn)值。引物設(shè)計(jì)時(shí)先用中括號(hào)將 SSR 位點(diǎn)括起來(lái)，以確保產(chǎn)物序列中包括 SSR 位點(diǎn)。引物由生工生物工程(上海)公司合成。

1.2.4 PCR擴(kuò)增及多態(tài)性引物篩選及檢測(cè) 本試驗(yàn)PCR反應(yīng)體系為：總體積為20 μL：包含10 μL 2×TaqMasterMix(CWBIO北京生物技術(shù)有限公司(中國(guó))有限公司)，正反向引物(10 μmol/L)各1 μL，雙蒸水7 μL和基因組DNA(50 ng/μL)1 μL。PCR循環(huán)參照Feng 等[8]的程序。擴(kuò)增產(chǎn)物用10%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳[25]、0.5×TBE的緩沖液、穩(wěn)壓250 V、室溫電泳4 h、銀染顯色、膠片觀察燈照相觀察的方法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 選取可重復(fù)且清晰可辨的擴(kuò)增條帶，有譜帶計(jì)為1，無(wú)譜帶計(jì)為0，構(gòu)建初始數(shù)據(jù)矩陣，計(jì)算擴(kuò)增條帶和多態(tài)性條帶及比率；用NTSYS-pc2.10e軟件[27]SimQual 程序求 Jaccard 相似系數(shù)，用SHAN 程序中的 UPGMA(非加權(quán)平均法)進(jìn)行聚類(lèi)分析。并通過(guò) Treeplot模塊生成聚類(lèi)圖，并對(duì)其進(jìn)行Cophenetic相關(guān)性檢驗(yàn)；使用POPGENE[28]軟件計(jì)算花椒種質(zhì)的遺傳多樣性指標(biāo)，觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s遺傳多樣性(H)以及Shannon′s信息指數(shù)(I)；根據(jù)條帶特征分析花椒DNA指紋圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1花椒cDNA序列SSR位點(diǎn)分布特征

2.1.1 花椒EST-SSR頻率和密度 在鳳縣大紅袍花椒莖尖節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及數(shù)據(jù)分析得到的cDNA 序列中，長(zhǎng)度大于200 bp的非冗余Unigene序列共45 057條，其總長(zhǎng)度約為32.5 Mbp，平均長(zhǎng)度為610 bp；在全部的 Unigene 序列中有3 315條包含簡(jiǎn)單重復(fù)序列，占全部序列的 7.36%，其中422 條包含2個(gè)及2個(gè)以上簡(jiǎn)單重復(fù)基元的序列，占全部序列的0.94%；在全部非冗余序列中共檢測(cè)到3 814個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR的出現(xiàn)頻率為 7.07%，平均分布距離約7.2 kb，花椒的SSR位點(diǎn)分布距離比楊樹(shù)(Populus)14.0 kb[29]、杜仲11.6 kb[30]、銀杏(Ginkgobiloba) 12.02 kb[31]的要大，比柑橘(Citrus) 5.7 kb[32]、茶樹(shù)(Camelliasinensis) 3.68 kb[33]、橡膠樹(shù)(Heveabrasiliensis)3.93 kb[34]等木本植物的分布距離要小。

2.1.2 花椒EST-SSR重復(fù)基元及比例 在獲得的SSR位點(diǎn)中，二-六核苷酸重復(fù)基元都能被檢出，但出現(xiàn)的頻率有明顯的差異。其中，二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元分別有 5，31，29，42，175共5種類(lèi)型(表2)。SSR重復(fù)類(lèi)型最多的為三核苷酸，共有1 866個(gè)，占全部SSR的58.58%，出現(xiàn)頻率為4.14%；其次是二核苷酸重復(fù)類(lèi)型，共有937個(gè)，占全部SSR的29.42%，出現(xiàn)頻率為2.08%；五核苷酸重復(fù)類(lèi)型出現(xiàn)頻率較低，共64個(gè)，占全部SSR總數(shù)的2.01%，出現(xiàn)頻率0.14%。可見(jiàn)，在花椒SSR位點(diǎn)中，二、三核苷酸重復(fù)類(lèi)型占主導(dǎo)地位(圖1-A)。

在含有二核苷酸重復(fù)基元的花椒 EST 序列中，AG/TC和CT/GA在二核苷酸重復(fù)基元，分別占二核苷酸總數(shù)的42.53%和37.81%，所占比例最高；在花椒三核苷酸重復(fù)基元中，GAA/CTT基序出現(xiàn)頻率最高，其次為AGA/TCT和ACT/TGA，這3類(lèi)重復(fù)基元占三核苷酸重復(fù)類(lèi)型總量的33.58%，27.03%和13.69%(圖1-B、C)。

表2 花椒EST-SSR類(lèi)型及分布頻率Tab.2 Repeat types and frequency of the EST-SSR in Zanthoxylum bungeanum

A.核苷酸重復(fù)類(lèi)型及比例；B.二核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)基元所占比例；C.三核苷酸重復(fù)中不同重復(fù)基元所占比例；D.不同 SSR 重復(fù)基元的數(shù)量與其重復(fù)次數(shù)。A.The nucleotide repeat type and proportion；B.The proportion of different repeating primers in the dinucleotide repeats；C.The proportion of different repeat motifs in trinucleotide repeats；D.The number of repetitive primitives for different SSRs and their number of repetitions.

在四核苷酸重復(fù)基元中AAGA/TTCT和ATAC/TATG基序出現(xiàn)頻率最高，分別占四核苷酸總數(shù)的14.29%和10.00%。五核苷酸基元中TTCTT/AAGAA出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)5次，出現(xiàn)頻率為7.81%；六核苷酸重復(fù)基元中GCAACA/CGTTGT出現(xiàn)頻率最高，出現(xiàn)7次，出現(xiàn)頻率為2.82%。

2.1.3 花椒EST-SSR重復(fù)次數(shù)與數(shù)量 由圖1-D可知，不同SSR重復(fù)基元的數(shù)量與其重復(fù)次數(shù)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明：重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)在4～12次，二核苷酸重復(fù)次數(shù)種類(lèi)最多，重復(fù)次數(shù)在6～12次；六核苷酸重復(fù)次數(shù)種類(lèi)最少，只有重復(fù)次數(shù)4次這一種；在所有重復(fù)基元中以5次重復(fù)的核苷酸最多，占SSR總數(shù)的29.98%；另外，在重復(fù)基元相同時(shí)，隨著重復(fù)基元重復(fù)次數(shù)(或 SSR 長(zhǎng)度)的增加，EST-SSR 的數(shù)量減少，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，二、三、四、五核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量和重復(fù)基元總數(shù)均呈明顯下降趨勢(shì)。

2.2花椒DNA提取及SSR產(chǎn)物有效性檢測(cè)

本試驗(yàn)所提取樣本 DNA 吸光度比值OD260/280均為1.8～2.0，試驗(yàn)結(jié)果表明，CTAB法能提取到純度較高的DNA。本試驗(yàn)隨機(jī)挑選了符合篩選條件的序列，用Primer 3.0在線設(shè)計(jì)了包括二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)基元的SSR位點(diǎn)在內(nèi)的共64 對(duì)引物來(lái)檢測(cè)所發(fā)掘出的 EST-SSR 標(biāo)記的可利用性。以12份花椒材料DNA 為模板對(duì)64對(duì)SSR引物進(jìn)行多態(tài)性引物及其最適 PCR 退火溫度的篩選。其中，55對(duì)引物能擴(kuò)增出理想產(chǎn)物，擴(kuò)增產(chǎn)物大小符合預(yù)期；其中18對(duì)引物能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶(表3)，占可擴(kuò)增出的34.55%，占設(shè)計(jì)引物總數(shù)的29.68%。18對(duì)引物共擴(kuò)增出81條清晰可見(jiàn)的條帶，其中多態(tài)性條帶73條，平均多態(tài)率為90.12%，DNA片段大小為120～300 bp，平均每對(duì)引物的擴(kuò)增條帶數(shù)為4.5條。多態(tài)性引物所對(duì)應(yīng)的重復(fù)基元結(jié)果表明：二核苷酸重復(fù)類(lèi)型有1個(gè)，三核苷酸重復(fù)類(lèi)型8個(gè)，四核苷酸重復(fù)類(lèi)型有6個(gè)，五核苷酸重復(fù)類(lèi)型有1個(gè)，六核苷酸重復(fù)類(lèi)型有2個(gè)。說(shuō)明利用花椒EST序列開(kāi)發(fā)EST-SSR標(biāo)記是高效可行的。

表 3 花椒 18 對(duì) EST-SSR 引物信息Tab.3 Information of 18 pairs of EST-SSR primers from Zanthoxylum bungeanum Maxim

2.3花椒種質(zhì)間遺傳多樣性分析

花椒的遺傳相似系數(shù)結(jié)果表明：各花椒種質(zhì)間遺傳相似系數(shù)為0.552 6～0.894 7，平均為0.725 0。其中頂壇花椒與油椒、頂壇花椒與竹葉椒、無(wú)刺花椒與竹葉椒之間的遺傳相似系數(shù)最小均為0.552 6，鳳縣大紅袍與武都大紅袍、山西盂縣大紅袍與黃金椒之間的遺傳相似系數(shù)最大均為0.894 7。遺傳相似系數(shù)能很好地體現(xiàn)了花椒種質(zhì)之間的親緣關(guān)系(表4)，且12份花椒種質(zhì)總的觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei′s遺傳多樣性H以及Shannon′s信息指數(shù)(I)分別為1.763 2，1.399 3，0.240 1，0.367 9，結(jié)果表明花椒種質(zhì)具有較強(qiáng)的遺傳多樣性[35]。

表4 12份花椒種質(zhì)的遺傳相似系數(shù)Tab.4 Genetic similarity coefficient of 12 Zanthoxylum varieties

用NTSYS-pc2.10軟件UPGMA法得聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖(圖2)。由圖2可知，在相似系數(shù)為0.70處，所有的花椒樣品可以聚為3類(lèi)：頂壇花椒為第Ⅰ類(lèi)，竹葉椒為第Ⅱ類(lèi)，其他花椒為第Ⅲ類(lèi)。該結(jié)果與Feng等[8]報(bào)道的結(jié)果一致，說(shuō)明所開(kāi)發(fā)的花椒EST-SSR是高效可行的。

圖2 基于SSR標(biāo)記的12份花椒種質(zhì)聚類(lèi)圖Fig.2 Cluster result of 12 Zanthoxylum varieties based on SSR markers

聚類(lèi)分析的相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3：相關(guān)性分析r=0.89，t=6.56，P=1.00，說(shuō)明遺傳是正相關(guān)，即遺傳相似系數(shù)越大，親緣關(guān)系越近，說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果是可靠的。

圖3 聚類(lèi)分析的相關(guān)性Fig.3 Correlation analysis of cluster analysis

2.4花椒指紋圖譜分析

采用以上18對(duì)引物對(duì)12份花椒種質(zhì)進(jìn)行指紋分析，5份種質(zhì)具有特征譜帶(表5)，僅用1個(gè)特征引物即可與其他種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。其中，無(wú)刺花椒、鳳縣大紅袍、漢源花椒具有 1 個(gè)特征引物，頂壇花椒具有2個(gè)特征引物，竹葉椒具有 4個(gè)特征引物。引物FX-27在頂壇花椒、鳳縣大紅袍上均表現(xiàn)出特征譜帶，表明該引物不僅多態(tài)性豐富，且特征譜帶也多，在進(jìn)行品種指紋鑒定時(shí)可優(yōu)先采用(圖4)。從18對(duì)引物中挑選多態(tài)性相對(duì)豐富的引物進(jìn)行組合鑒別，選擇FX-15、FX-27和FX-40以及FX-60、FX-40和FX-15 2組引物進(jìn)行組合，根據(jù)特征引物對(duì)應(yīng)特定種質(zhì)所擴(kuò)增出的特征條帶的相對(duì)位置可以將12份花椒種質(zhì)完全區(qū)分開(kāi)。

表5 具有特征譜帶的花椒種質(zhì)及對(duì)應(yīng)引物Tab.5 Corresponding primers with specific amplifications for Zanthoxylum varieties

圖4 引物 FX-27對(duì) 12 份花椒種質(zhì)的擴(kuò)增結(jié)果Fig. 4 DNA fragments amplified by SSR primer FX-27 in 12 Zanthoxylum varieties

3 討論與結(jié)論

3.1花椒cDNA序列SSR位點(diǎn)特征分析

本試驗(yàn)所得花椒的SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率為7.07%，低于同科植物柑橘EST-SSRs出現(xiàn)頻率(21.73%)，高于枳殼EST-SSRs出現(xiàn)頻率(2.96%)，造成這種位點(diǎn)差異的原因：一可能由于基因組中轉(zhuǎn)錄部分的比例及低拷貝序列出現(xiàn)的頻率不同、基因組大小不同、重復(fù)DNA序列所占的比例不同，二可能是由于搜索SSR位點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)(SSR重復(fù)類(lèi)型、長(zhǎng)度等)不同等原因[36]，如李小白[37]研究發(fā)現(xiàn)把油菜(Brassicanapus)EST-SSR 最小SSR長(zhǎng)度標(biāo)準(zhǔn)由12 bp增加到20 bp，EST-SSR 的頻率從15. 58%降低到11. 61%。

本研究發(fā)現(xiàn)，三核苷酸是SSR重復(fù)基元中的主導(dǎo)類(lèi)型，且出現(xiàn)頻率最多的是(GAA/CTT)n，這與對(duì)同科植物柑橘[38]、甜橙[39]中的研究結(jié)果一致。從目前報(bào)道的各類(lèi)研究論文結(jié)果來(lái)看，大多數(shù)植物EST-SSRs的主導(dǎo)重復(fù)基元都是以二、三核苷酸為主，但主導(dǎo)重復(fù)基元的類(lèi)型不同。以二核苷酸為主導(dǎo)重復(fù)基元的植物主要有獼猴桃[40]、茶樹(shù)[41]、白菜等[42]；以三核苷酸為主導(dǎo)重復(fù)基元的植物有水稻[43]、葡萄[44]、百合[45]等。這是因?yàn)镋ST序列大部分由外顯子組成，是表達(dá)序列，且功能單位密碼子是由3個(gè)核苷酸組成，在轉(zhuǎn)錄翻譯成蛋白質(zhì)的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生移碼突變使三核苷酸發(fā)生位移，但是在基因表達(dá)的過(guò)程中不會(huì)影響表達(dá)基因的閱讀框的位移[46]。在谷類(lèi)作物的相關(guān)研究中已經(jīng)驗(yàn)證了該理論[47]，本研究與前人研究結(jié)果一致。

3.2花椒SSR引物多態(tài)性分析

18對(duì)多態(tài)性引物所對(duì)應(yīng)的重復(fù)基元中，二核苷酸重復(fù)基元有1個(gè)，三核苷酸重復(fù)基元有8個(gè)，四核苷酸重復(fù)基元有6個(gè)，五核苷酸重復(fù)基元有1個(gè)，六核苷酸重復(fù)基元有2個(gè)。有研究發(fā)現(xiàn)，多態(tài)性與SSR重復(fù)基元的長(zhǎng)度有關(guān)。由短重復(fù)基元組成的SSR獲得(或失去)重復(fù)基元的速率要比長(zhǎng)重復(fù)基元組成的SSR快，將具有更高的多態(tài)性[48]，本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果是一致的。早在2002年，Eujayl[49]通過(guò)對(duì)來(lái)自基因組和 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的 SSR 多態(tài)性的比較，就發(fā)現(xiàn)了來(lái)自 EST 數(shù)據(jù)庫(kù)的 SSR 多態(tài)性(25%)低于來(lái)自基因組的 SSR 多態(tài)性(53%)，本試驗(yàn)獲得了與Eujayl同樣的結(jié)果。

從本試驗(yàn)的研究結(jié)果來(lái)看，花椒EST-SSRs出現(xiàn)頻率較高，且類(lèi)型豐富；所建立的cDNA數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列也具有較高的可用性，所設(shè)計(jì)引物的多態(tài)性較高而且可信。EST-SSR具有引物開(kāi)發(fā)成本低、信息含量豐富、應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)。本試驗(yàn)研究結(jié)果為花椒EST-SSR標(biāo)記鑒定了基礎(chǔ)，豐富了花椒分子標(biāo)記類(lèi)型，篩選出EST-SSR引物可用于花椒遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建等，為花椒的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

3.3花椒遺傳多樣性分析

3.3.1 花椒相似性系數(shù)分析 相似系數(shù)也稱(chēng)為遺傳一致度，是衡量品種之間遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近的一個(gè)重要參數(shù)，通過(guò)遺傳相似系數(shù)能對(duì)個(gè)體或品種間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近有一個(gè)大概的了解。相似系數(shù)分析結(jié)果表明：不同地理來(lái)源的花椒遺傳相似系數(shù)差異較大，為0.552 6～0.894 7，說(shuō)明花椒種質(zhì)之間的遺傳多樣性還是很豐富的，Nei′s遺傳多樣性H也支撐了這個(gè)結(jié)論，本試驗(yàn)材料遺傳背景比較復(fù)雜，這可能是因?yàn)榛ń窡o(wú)融合生殖、單性結(jié)實(shí)的特點(diǎn)造成的；其中頂壇花椒、竹葉椒與其他花椒之間的遺傳相似系數(shù)小，即青花椒與紅花椒之間遺傳相似系數(shù)小。本試驗(yàn)結(jié)果與前人研究結(jié)果一致[50]。

3.3.2 花椒聚類(lèi)結(jié)果分析 由基于SSR標(biāo)記建立的不同來(lái)源的花椒種質(zhì)樹(shù)狀聚類(lèi)圖可知：所有供試材料的遺傳距離都大于零，又能夠聚類(lèi)在一起，說(shuō)明不同花椒種質(zhì)之間既有相同遺傳背景但又相互之間存在著差異。樹(shù)狀圖顯示不同花椒種質(zhì)的遺傳距離為0.64～0.89，在遺傳距離0.70處除頂壇花椒和竹葉椒之外，其他紅花椒聚為一類(lèi)，說(shuō)明紅花椒之間的親緣關(guān)系較近。在聚類(lèi)圖上不同花椒種質(zhì)相互交錯(cuò)排布，即來(lái)自同一省份的花椒與來(lái)自其他省份的花椒相互交織，花椒間的遺傳距離與其生長(zhǎng)的實(shí)際地理位置之間的關(guān)系不明顯，是因?yàn)椴煌》葜g由于長(zhǎng)期的引種過(guò)程造成品種的變異，所以出現(xiàn)這種結(jié)果。

3.4花椒指紋圖譜分析

DNA 指紋圖譜分析主要有 3 種方法，即引物組合法、特征譜帶法與核心引物組合法[51]。本研究中，8對(duì)引物在5份花椒種質(zhì)上具有特征譜帶，僅用1對(duì)特征引物即可鑒別相應(yīng)的種質(zhì)，在進(jìn)行DNA指紋檢測(cè)時(shí)，使用起來(lái)簡(jiǎn)單方便。本研究中，只有少部分種質(zhì)具有特征引物，需進(jìn)行大量的引物篩選工作獲取其他種質(zhì)的特征引物，隨著種質(zhì)范圍的擴(kuò)大，原來(lái)在某種質(zhì)上表現(xiàn)為特征帶的引物，有可能在其他種質(zhì)上出現(xiàn)相同帶型，即所謂特征譜帶是相對(duì)的，只有在固定的材料范圍內(nèi)有效，鑒別能力相對(duì)有限。引物組合法通過(guò)不同引物的有限組合，可以在很大程度上提高引物的鑒別能力，本研究采用3對(duì)引物組合進(jìn)行鑒別可將12份花椒完全區(qū)分開(kāi)，隨著種質(zhì)資源數(shù)量的進(jìn)一步增加，這3對(duì)引物組合的鑒別能力可能會(huì)逐漸減低，可根據(jù)實(shí)際檢測(cè)情況適當(dāng)增加引物組合的數(shù)量。

3.5結(jié)論

在花椒cDNA全部非冗余序列中共檢測(cè)到3 814個(gè)SSR位點(diǎn)。在花椒SSR位點(diǎn)中，二、三核苷酸重復(fù)類(lèi)型占主導(dǎo)地位，其中：TC/AG和CT/GA基序在二核苷酸重復(fù)基元中所占比例最高，GAA/CTT基序在三核苷酸重復(fù)基元中出現(xiàn)頻率最高；不同SSR重復(fù)基元的重復(fù)次數(shù)在4～12次，隨著重復(fù)次數(shù)的增加，二、三、四、五核苷酸重復(fù)基元的數(shù)量和重復(fù)基元總數(shù)均呈明顯下降趨勢(shì)；利用花椒 EST 序列開(kāi)發(fā) EST-SSR 標(biāo)記高效與可行；指紋圖譜分析中，8對(duì)引物在5份種質(zhì)中能擴(kuò)增出特征帶型，最少用3對(duì)引物進(jìn)行組合即可將12份花椒種質(zhì)區(qū)分開(kāi)。本研究成功開(kāi)發(fā)花椒EST-SSR標(biāo)記，并應(yīng)用于花椒遺傳多樣性研究和指紋圖譜構(gòu)建中，表明利用花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開(kāi)發(fā)SSR標(biāo)記是可行的，本研究開(kāi)發(fā)的引物將為花椒遺傳多樣性分析、育種群體的建立、分子標(biāo)記輔助育種等奠定基礎(chǔ)。

[1] 畢 君，王春榮，趙京獻(xiàn)，等. 北方花椒主產(chǎn)區(qū)種質(zhì)資源考察報(bào)告[J]. 河北林果研究，2003，18(2)：165-168.

[2] 王雙貴，趙京獻(xiàn)，畢 君，等. 國(guó)內(nèi)外花椒的研究現(xiàn)狀及其發(fā)展趨勢(shì)[J]. 內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2003(2)：32-34.

[3] 白小鳴，王 華，曾小峰，等. 氣相色譜-質(zhì)譜法結(jié)合保留指數(shù)對(duì)比初步分析梁平柚麻味物質(zhì)的組成成分[J]. 食品科學(xué)，2015，18(36)：103-107.

[4] 楊 靜，趙 鐳，史波林，等. 青花椒香氣快速氣相電子鼻響應(yīng)特征及GC-MS物質(zhì)基礎(chǔ)分析[J]. 食品科學(xué)，2015，36(22)：69-74.

[5] 游玉明，任文瑾，劉慶慶，等. 花椒精有效成分對(duì)高脂膳食大鼠脂質(zhì)代謝的影響[J]. 營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2015(3)：288-293.

[6] 鄭海星，李周岐，薛惠丹，等. 花椒種質(zhì)資源的RAPD分析[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2011，26(2)：96-100.

[7] 漢素珍，王有科，李 捷，等. 甘肅省主產(chǎn)花椒品種ISSR遺傳多樣性分析[J]. 甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46(6)：46-51.

[8] Feng S J，Yang T X，Liu Z S，et al. Genetic diversity and relationships of wild and cultivatedZanthoxylumgermplasms based on sequence-related amplified polymorphism (SRAP) markers[J]. Genetic Resources and Crop Evolution，2015，62(8)：1193-1204.

[9] 蔣弘剛，魏安智，楊途熙，等. 花椒莖尖節(jié)點(diǎn)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及基因注釋[J]. 西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，29(6)：94-99.

[10] 潘海濤，汪俊君，王盈盈，等. 小麥EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)和遺傳作圖[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，43(3)：452-461.

[11] 孟清照，李仕金，董轉(zhuǎn)年，等. SSR引物開(kāi)發(fā)方法概述[J]. 大眾科技，2007(12)：116-117，107.

[12] 楊東娟，馬瑞君. SSR分子標(biāo)記在作物遺傳多樣性研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀[J]. 甘肅科技，2007，23(8)：99-102.

[13] Zhuang L F，Song L X，F(xiàn)eng Y G，et al. Development and chromosome mapping of new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat[J]. Acta Agronomica Sinica，2008，34(6)：926-933.

[14] Chai L J，Biswas M K，Yi H L，et al. Transferability，polymorphism and effectiveness for genetic mapping of the Pummelo (CitrusgrandisOsbeck) EST-SSR markers[J]. Scientia Horticulturae，2013，155(155)：85-91.

[15] 曾柏全，鄧子牛，熊興耀，等. 湖南寬皮柑橘EST-SSR反應(yīng)體系研究[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25(21)：244-247.

[16] 楊春霞，溫 強(qiáng)，葉金山，等. 枳殼EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 分子植物育種，2011(1)：123-127.

[17] Yao L H，Zheng X Y，Cai D Y，et al. Exploitation ofMalusEST-SSRs and the utility in evalution of genetic diversity inMalusandPyrus[J].Genetic Resources and Crop Evolution,2010，57(6)：841-851.

[18] 張俊娥. 蘋(píng)果EST中微衛(wèi)星分析[J]. 廣西農(nóng)業(yè)生物科學(xué)，2008，27(4)：378-380.

[19] Celton J M，Tustin D S，Chagné D，et al. Construction of a dense genetic linkage map for apple rootstocks using SSRs developed fromMalusESTs andPyrusgenomic sequences[J]. Tree Genetics & Genomes，2009，5(1)：93-107.

[20] 許玉蘭，蔡年輝，康向陽(yáng)，等. EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及其在木本植物中的分布特點(diǎn)[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2012，28(4)：1-7.

[21] 李 曉，楊途熙，魏安智，等. 花椒DNA提取方法的研究[J]. 北方園藝，2011(7)：130-132.

[22] Mortazavi A，Williams B A，Mccue K，et al. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq[J]. Nature Methods，2008，5(7)：621-628.

[23] 劉 博，邵艷卿，滕爽爽，等. 縊蟶(Sinonovaculaconstricta)EST-SSR分布特征及引物開(kāi)發(fā)利用[J]. 海洋與湖沼，2012，43(1)：132-137.

[24] 曾慶國(guó)，陳藝燕. 微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選方法綜述[J]. 生態(tài)科學(xué)，2005，24(4)：368-372.

[25] 崔海榮，劉金義，佟兆國(guó)，等. 砂梨EST-SSR引物開(kāi)發(fā)及其應(yīng)用[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2010，30(8)：1551-1556.

[26] Rozen S，Skaletsky H. Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers[J]. Methods in Molecular Biology，2000，132(3)：365-386.

[27] Rohlf F J. NTSYSpc：numerical taxonomy and multivariate analysis system，version2.02.[M].New York:Exeter software，1998：2010-2015.

[28] Yeh F C，Yang R C，Boyle T B，et al. POPGENE，the user-friendly shareware for population genetic analysis[M]. Edmonton:University of Alberta，1997.

[29] Cardle L，Ramsay L，Milbourne D，et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants[J]. Genetics，2000，156(2)：847-854.

[30] 黃海燕，杜紅巖，烏云塔娜，等. 基于杜仲轉(zhuǎn)錄組序列的SSR分子標(biāo)記的開(kāi)發(fā)[J]. 林業(yè)科學(xué)，2013，49(5)：176-181.

[31] 樊洪泓，李廷春，李正鵬，等. 銀杏EST序列中微衛(wèi)星的分布特征[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2009，28(5)：869-873.

[32] Chen C，Zhou P，Choi Y A，et al. Mining and characterizing microsatellites fromCitrusESTs[J]. Theoretical and Applied Genetics，2006，112(7)：1248-1257.

[33] 楊 華，陳 琪，韋朝領(lǐng)，等. 茶樹(shù)轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)的信息分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，38(6)：882-886.

[34] 安澤偉，趙彥宏，程 漢，等. 橡膠樹(shù)EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用[J]. 遺傳，2009，31(3)：311-319.

[35] 吳岐奎，邢世巖，王 萱，等. 核用銀杏品種遺傳關(guān)系的AFLP分析[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2015，42(5)：961-968.

[36] Morgante M，Hanafey M，Powell W. Microsatellites are preferentially associated with nonrepetitive DNA in plant genomes[J]. Nature Genetics，2002，30(2)：194-200.

[37] 李小白. 油菜(BrassicanapusL.)EST-SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用研究[D]. 杭州：浙江大學(xué)，2007.

[38] Zhuang L. Development and chromosome mapping of 81 new wheat EST-SSR markers and application for characterizing rye chromosomes added in wheat[J]. Acta Agronomica Sinica，2008，34(6)：926-933.

[39] Chen C A. Mining and characterizing microsatellites fromcitrusESTs[J].Theoretica and Applied Genetics，2006，7(112)：1248-1257.

[40] Fraser L G，Harvey G H，Crowhurst R N. et al. EST-derived microsatellites fromActinidiaspecies and their potential for mapping [J].Theoretical and Applied Genetics,2004，108(6)：1010-1016.

[41] 王麗鴛，姜燕華，段云裳，等. 茶樹(shù)EST-SSRs分布特征及引物開(kāi)發(fā)[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2009，10(4)：511-516.

[42] 忻 雅，崔海瑞，張明龍，等. 白菜EST-SSR標(biāo)記的通用性[J]. 細(xì)胞生物學(xué)雜志，2006，28(2)：248-252.

[43] Kantetyr V，Larotam L，Matthewsd E，et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley，maize，rice，sorghum and wheat[J]. Plant Molecular Biology，2002，48(5-6)：501-510.

[44] Cordeiro G M，Casu R，Mcintyre C L，et al. Microsatellite markers from sugarcane (Saccharumspp.) ESTs cross transferable to erianthus and sorghum[J]. Plant Science，2001，160(6)：1115-1123.

[45] 楊素麗，明 軍，劉 春，等. 基于EST信息的百合SSR標(biāo)記的建立[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2008，35(7)：1069-1074.

[46] Metzgar D，Bytof J，Wills C. Selection against frameshift mutations limits microsatellite expansion in coding DNA[J]. Genome Research，2000，10(1)：72-80.

[47] Gao L F，Jing R L，Huo N X，et al. One hundred and one new microsatellite loci derived from ESTs (EST-SSRs) in bread wheat[J]. Theoretical and Applied Genetics，2004，108(7)：1392-1400.

[48] 李淑嫻，張新葉，王英亞，等. 桉樹(shù)EST序列中微衛(wèi)星含量及相關(guān)特征[J]. 植物學(xué)報(bào)，2010，45(3)：363-371.

[49] Eujayl I,Sorrells M E,Baum M,et al. Isolation of EST-derived microsatellite marker for genotying the A and B genomes of wheat[J].Theor Appl Genet，2002,104(2-3)：399-407.

[50] Thiel T，Michalek W，Varshney R K，et al. Exploiting EST databases for the development and characterization of gene-derived SSR-markers in barley (HordeumvulgareL.[J]. Theoretical and Applied Genetics，2003，106(3)：411-422.

[51] 王鳳格，趙久然，郭景倫，等. 比較三種DNA指紋分析方法在玉米品種純度及真?zhèn)舞b定中的應(yīng)用[J]. 分子植物育種，2003，1(5)：655-661.

StudyonDevelopmentofSSRMolecularMarkersBasedonTranscriptomeSequencingandGermplasmIdentificationinZanthoxylumGermplasm

LI Lixin1，SI Shouxia2，WEI Anzhi1，LIU Yulin1，F(xiàn)ENG Shijing1，YANG Tuxi1

(1.Northwest Agriculture and Forestry University，Yangling 712100，China；2.Henan Forestry Vocational College，Luoyang 471002，China)

To improve the application of molecular markers in theZanthoxylumgenus，the stuty developed functional EST-SSR markers and analyzed DNA fingerprint ofZanthoxylumgermplasm.Microsatellite software was used to scan the SSR loci from 45 057 non-redundant Unigenes among length above 200 bp derived from the node tissue of stem tip transcriptome sequences ofZanthoxylumbungeanumMaxim Fengxiandahongpao. Then the frequency and density of SSR loci，the type and proportion of SSR motifs and the number of SSR repetitions were also analysed. The SSR primers were then designed by Primer 3.0 online and polymorphic primer were screened by PCR；the polymorphic bands and molecular size were evaluated by using Quantity One software；the genetic distance and clustering map were analyzed by using software NTsys 2.0 and then constructed Fingerprints by Quantity One. The results showed that 3 315 Unigene sequences contained a total of 3 814 SSR loci(7.07%) and the dinucleotide repeat and trinucleotide repeat were the main types and accounted for 29.42% and 58.58% of the total SSRs，respectively. Among dinucleotides，AG/TC and CT/GA were the most frequent repeats；among trinucleotides，GAA/CTT and AGA/TCT appeared high frequency；with the increased of the number of repetition，the total number of repeat motifs showed a clear downward trend. 64 pairs of SSR primers were designed and 55 primer pairs were successfully amplifying DNA fragments. Out of 55 primer pairs，18 pairs of polymorphic primer were used for PCR amplification in 12Zanthoxylumgermplasm. A total of 81 clear bands were amplified and the percentage of polymorphic bands was 90.12%.Genetic similarity coefficients of eachZanthoxylumgermplasm among 0.552 6-0.894 7，with an average of 0.725 0. The UPGMA clustering showed that all theZanthoxylumgermplasm was divided into three main groups at the similarity coefficient 0.70：(Ⅰ)ZanthoxylumarmatumDC，(Ⅱ)ZanthoxylumbungeanumMaxim，and (Ⅲ)Zanthoxylumplanispinumvar. dingtanensis；In the fingerprint analysis，8 pairs of primers could amplify characteristic bands on 5Zanthoxylumgermplasms and 3 pairs of primers could be used to separate the 12Zanthoxylumgermplasm at least. We successfully developed SSR markers in the node tissue of stem tip transcriptome sequences ofZanthoxylumbungeanumMaxim Fengxiandahongpao. 8 pairs of primers could amplify characteristic bands were designed and screened，a minimum of 3 pairs of primers could be used to separate 12 pepper cultivars，these new EST-SSR markers fromZanthoxylumgermplasm provided a new primer sequence，basis for genetic analysis and fingerprint construction ofZanthoxylumgermplasm.

ZanthoxylumbungeanumMaxim；EST-SSR；Primer development；Fingerprint

2017-08-16

國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)(201304706)；西北農(nóng)林科技大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)集成與示范推廣(TGZX 2016-08)；西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)示范站(基地)科技成果推廣專(zhuān)項(xiàng)(TGZX2015-46)

李立新(1990-)，女，河北滄州人，在讀碩士，主要從事林木遺傳育種研究。

楊途熙(1963-)，男，陜西楊凌人，教授，碩士，主要從事林木遺傳育種研究。

Q78；S573.03

A

1000-7091(2017)05-0069-09

10.7668/hbnxb.2017.05.011