吳月燕，明 萌，2，何靜雯，2，盧 丹，沈梓力，邱 甜，吳燕燕，謝曉鴻

(1.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

低溫脅迫下杜鵑雜交后代優(yōu)良株系的轉錄組分析

吳月燕1，明 萌1，2，何靜雯1，2，盧 丹1，沈梓力1，邱 甜1，吳燕燕1，謝曉鴻1

(1.浙江萬里學院 生物與環(huán)境學院，浙江 寧波 315100；2.上海海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，上海 201306)

為探索杜鵑抗寒的分子機制，篩選抗寒相關基因，利用人工模擬低溫，以杜鵑雜交后代優(yōu)良株系繁景-6 ℃(T)處理和25 ℃(CK)對照為試驗材料，進行轉錄組測序和數(shù)據(jù)從頭組裝及生物信息學分析，通過組裝得到 Unigenes序列122 654個，功能注釋結果顯示，有大量Unigenes可以注釋到基因本體(GO)和蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(COG) 等數(shù)據(jù)庫上，部分Unigenes無匹配信息，可能為杜鵑特有的基因序列。按GO功能分類，繁景杜鵑中的 Unigenes分為細胞組分、分子功能以及生物學過程3類，包括51個分支，其中有大量的Unigenes與代謝進程、催化活性和細胞進程相關。上調(diào)差異表達基因有6 347個，下調(diào)差異表達基因4 482個。通過對轉錄結果中差異表達顯著的4個轉錄因子家族中的24個基因，其中，上調(diào)12個，下調(diào)12個，在低溫脅迫下的表達水平驗證，發(fā)現(xiàn)其與轉錄結果基本一致，證明該轉錄組數(shù)據(jù)可靠。

杜鵑；低溫脅迫；轉錄組；抗寒基因

杜鵑花(Rhododendron)，是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬(RhododendronL.)多種植物的總稱，又稱山躑躅、山石榴、映山紅，是常綠或落葉灌木[1-2]，為浙江省重要的綠化植物。但由于受氣候條件等影響，只能用品種較單一，花色較為單調(diào)，花期大多在4-5月中下旬較為耐寒的杜鵑品種。以毛鵑春如意為母本、毛鵑琉球紅為父本進行雜交育種，獲得246株雜交后代，篩選后得到一雜交后代的優(yōu)良株系，暫命名為繁景，其花期為4月上旬，略早于大部分浙江省綠化杜鵑品種，花4～6朵簇生于枝端，花朵豐富，花色為深粉紅色，花色較為少見。但是，大多數(shù)年份，浙江部分地區(qū)年極端低溫為-2～-5 ℃，部分品種杜鵑會出現(xiàn)凍害現(xiàn)象。因此，繁景杜鵑抗寒性的研究，對其栽培和生產(chǎn)具有重要的理論指導意義。

目前，對于杜鵑耐寒的研究報道比較少，主要研究在低溫脅迫下葉片的相對電導率、丙二醛(MDA)含量、過氧化物酶(POD)活性等生理指標的變化情況[3-7]，還沒有相應杜鵑轉錄組測序等方面的研究報道。轉錄組測序是指生物在特定環(huán)境和狀態(tài)下總RNA的變化情況，是連接基因組遺傳信息與生物功能蛋白質(zhì)組的紐帶[8]，對于缺乏基因組信息的物種，采用轉錄組測序可獲得大量的數(shù)據(jù)信息，有助于挖掘重要功能基因和植物優(yōu)良性狀研究的開展，因此，對杜鵑轉錄組的測序研究具有重要的意義。本試驗以一年生繁景植株為材料，通過對低溫脅迫下繁景杜鵑轉錄組的分析，為該杜鵑雜交后代優(yōu)良株系，作為綠化材料在浙江以及環(huán)境相似地區(qū)的推廣、新品種的選育和栽培模式提供理論依據(jù)，為杜鵑的分子育種及品種改良提供了一定的理論基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

供試杜鵑(Rhododendronsp.)材料來源于寧波市北侖區(qū)柴橋鎮(zhèn)杜鵑花基地。試驗于2015年12月-2016年5月在浙江萬里學院實驗室進行。試驗隨機選擇了36株生長健壯、形態(tài)大小基本一致的繁景杜鵑。通過之前生理指標檢測及對超微結構的觀察，確定測序條件和時間點，繁景杜鵑耐受的最低溫度為-6 ℃，且在-6 ℃處理24 h后各項生理指標達到最大值，因此以-6 ℃低溫為處理(T)，以25 ℃處理為對照(CK)，處理24 h，每個處理6株，共設3組生物學重復。2016年1月12-14日，放入低溫生化培養(yǎng)箱進行人工低溫處理，生化培養(yǎng)箱內(nèi)處理與對照除溫度不同，光照和水分等環(huán)境因素保持一致，空氣相對濕度為70%～80%[9]，光照為216 μmol/(m2·s)，光周期12 h/12 h (晝/夜)，處理24 h后進行采樣。每次采樣隨機選取數(shù)片頂端葉片，置于超低溫冰箱中備用。

1.2試驗方法

1.2.1 RNA的質(zhì)量檢測 按OMEGA試劑盒說明書進行杜鵑總RNA的提取。濃度檢測方法：用NanoDrop分光光度計測定所抽提RNA樣品的A260、A280值，計算樣品濃度；樣品完整性檢測方法：1.0%變性瓊脂糖凝膠電泳定性檢測。

1.2.2 All-unigenes的統(tǒng)計與組裝 轉錄組測序由杭州晶佰生物科技有限公司完成，每個測序樣品重復一次，經(jīng)測序質(zhì)量控制，各樣品堿基準確Q20的百分比均大于98%，GC含量不超過50%，測序數(shù)據(jù)可用于組裝。

1.2.3 All-unigenes的功能注釋 通過轉錄組測序平臺，對不同樣品的Unigenes進行差異表達基因分析，并將差異表達基因與GO、COG、KEGG、COG等數(shù)據(jù)庫進行比對，整理出對應基因的功能、通路和富集情況等。

1.2.4 低溫脅迫下基因的表達 根據(jù)|log2ratio|≥1，F(xiàn)DR≤0.001基因在樣品間的篩選標準，分別找出在不同樣本間表達量上調(diào)高和表達量下調(diào)高的基因，基因的表達量代表低溫脅迫下的基因表達差異。

1.2.5 實時熒光定量PCR分析 定量檢測利用STBR試劑盒，選擇差異表達顯著的4個轉錄因子ALDH、ERF、MYB和bHLH家族中的24個轉錄因子(上調(diào)和下調(diào)各12個)和內(nèi)參基因EF-1-α(GenBank Accession為LN829627.1)，用Primer Premier 5軟件設計引物，如表1所示，進行實時熒光定量PCR分析。用2-ΔΔCT算法計算待測基因的相對表達量[10]。每組樣品3個生物學重復，每個反應各設一組空白對照(cDNA模板空白)。

2 結果與分析

2.1繁景杜鵑葉片處理和對照的表型變化

觀測CK與T的36株繁景杜鵑，隨機摘取若干片頂端葉片，如圖1所示，在低溫處理下，葉片的顏色加深，并出現(xiàn)輕微的褶皺。

2.2RNA的質(zhì)量檢測

按OMEGA試劑盒說明書提取總RNA，用Nano Drop核酸蛋白儀測定RNA樣品的濃度及樣品在260，280 nm波長下OD值的比值，并用瓊脂糖凝膠電泳定性檢測所抽提的RNA質(zhì)量。如表2所示，2組RNA完整度均較好，均符合文庫構建要求。處理與對照各3個生物學重復，用于RNA-Seq轉錄組測序。

表1 實時熒光定量PCR所用的引物Tab.1 Reaction sequences of primers used in Real-time PCR

圖1 繁景杜鵑葉片處理和對照的表型變化Fig.1 The phenotypic changes of leaf treatment and control in Fanjing Rhododendron

2.3測序數(shù)據(jù)的產(chǎn)出與組裝

每個測序樣品經(jīng)測序質(zhì)量控制，如表3所示各樣品質(zhì)量不低于20的堿基(Q20)的百分比均大于98%，堿基G和C數(shù)占總堿基數(shù)的比例(GC含量)不超過50%，測序數(shù)據(jù)可用于組裝[11]。如表4所示，組裝結果總Unigenes 122 654個，總長78 017 305 nt，平均長度636 nt，N50為1 018 nt。

2.4Contig和Unigenes的長度分布

如圖2所示，通過轉錄組測序獲得大量的序列，且組裝后Conting和Unigenes的長度增加，表明組裝的效果較好，可進一步開展后續(xù)分析。

2.5功能注釋和分類

基因本體論(簡稱GO)是一種國際標準化的基因功能分類系統(tǒng)，用來定義生物體中基因和基因產(chǎn)物。通過GO 數(shù)據(jù)庫對繁景杜鵑的 Unigenes進行功能分類，從宏觀上了解杜鵑低溫脅迫下，表達基因的功能分布特征[12]。GO分為3個本體，分別是基因的分子功能、所處的細胞位置、參與的生物過程。研究結果表明，注釋到GO數(shù)據(jù)庫的44 534個Unigenes可劃分為 51個功能組，并對每一個功能組涉及的Unigenes進行了歸類分析。如圖3所示，注釋到GO數(shù)據(jù)庫的44 534個Unigenes可劃分為 51個功能組， 21個功能組共13 516(47.8%)個Unigenes歸屬于參與的生物過程， 16個功能組共9 460(33.5%)個Unigenes歸屬于細胞組分， 14個功能組共5 294(18.7%)個Unigenes歸屬于分子功能。其中，在上調(diào)和下調(diào)表達的基因中，細胞進程、代謝進程、單生物進程、催化活性、結合活性和糖酵解功能組中涉及的Unigenes較多，而生物黏附、胞外基質(zhì)部分、類核、鳥嘌呤核苷酸交換因子活性、營養(yǎng)庫活性和蛋白標簽功能組中涉及的Unigenes較少。

表2 繁景杜鵑RNA質(zhì)檢結果Tab.2 RNA quality inspection results of Fanjing Rhododendron

表3 繁景杜鵑轉錄組測序的產(chǎn)出量Tab.3 Transcriptome sequencing yield statistics of Fanjing Rhododendron

表4 繁景杜鵑基因序列組裝統(tǒng)計結果Tab.4 Statistical results of gene sequence assembly of Fanjing Rhododendron

圖2 繁景杜鵑基因序列組裝的Contigs和Unigenes的長度分布Fig.2 Length distribution of Contigs and Unigenes in gene sequence assembly of Fanjing Rhododendron

圖3 繁景杜鵑Unigenes的GO分類Fig.3 Fanjing Rhododendron GO classification of Unigenes

2.6Unigenes的COG功能分類

蛋白質(zhì)直系同源數(shù)據(jù)庫(Cluster of orthologous groups，COG)是對基因產(chǎn)物進行直系同源分類的數(shù)據(jù)庫。所有組成COG的蛋白都被暫且認為源于同一個蛋白，這個源蛋白可能是orthologs也可能是paralogs[13-14]。將繁景杜鵑Unigenes比對到COG 數(shù)據(jù)庫上，對Unigenes的功能進行預測和分類統(tǒng)計。得知，繁景杜鵑的 81 850 個Unigenes根據(jù)其功能大致可分為 25 類，并對每一類的Unigenes進行了統(tǒng)計分析。如圖4所示，Unigenes涉及的COG功能類別比較全面，涉及了大多數(shù)的生命活動。其中一般功能預測類基因最多(12 084個)，翻譯、核糖體結構與生物合成類基因(8 682個)等也較多；而核酸結構類基因(16個)、胞外結構基因(89個)較少；其他類別基因表達各不相同。

2.7KEGG通路分析

KEGG是系統(tǒng)分析基因產(chǎn)物在細胞中的代謝途徑以及基因產(chǎn)物功能的數(shù)據(jù)庫。根據(jù) KEGG 數(shù)據(jù)庫的注釋信息能進一步得到Unigenes的Pathway注釋[15]。結合KEGG數(shù)據(jù)庫，對繁景杜鵑的52 057個Unigenes參與或涉及的代謝途徑進行了統(tǒng)計分析。如圖5所示，可將繁景杜鵑Unigenes歸屬于 5大類的代謝途徑，主要包括代謝途徑和次生代謝產(chǎn)物合成、能量代謝；蛋白折疊、脂類物質(zhì)代謝；碳水化合物代謝；氨基酸代謝；分類和降解、轉錄與翻譯、信號轉導等。

將 KEGG pathway 數(shù)據(jù)庫作為參考，可將Unigenes定位到 128 個具體的代謝途徑分支。其中，在上調(diào)和下調(diào)表達的基因中，主要涉及能量代謝的基因，蛋白折疊分類和降解途徑的基因，核苷酸代謝途徑基因，轉錄與翻譯的基因以及運輸和代謝途徑的基因等。

A.RNA的加工與修飾;B.染色體結構與動力學；C.能量產(chǎn)生和轉換；D.細胞周期調(diào)控與分裂、染色體重排；E.氨基酸運輸與代謝；F.核苷酸運輸與代謝；G.碳水化合物運輸與代謝；H.輔酶運輸與代謝；I.脂質(zhì)運輸與代謝；J.翻譯、核糖體結構與生物合成；K.轉錄；L.復制、重組與修復；M.細胞壁、膜生物合成；N.細胞運動；O.翻譯后修飾、蛋白質(zhì)折疊和分子伴侶；P.無機離子運輸與代謝；Q.次生代謝物合成、運輸和代謝；R.一般功能預測；S.未知功能；T.信號轉導機制；U.細胞內(nèi)轉運、分泌和囊泡運輸；V.防御機制；W.胞外結構；Y.核酸結構；Z.細胞骨架。

A.RNA processing and modification; B.Chromatin structure and dynamics; C.Energy production and conversion; D.Cell cycle control,cell division,chromosome partitioning; E.Amino acid transport and metabolism; F.Nucleotide transport and metabolism; G.Carbohydrate transport and metabolism; H.Coenzyme transport and metabolism; I.Lipid transport and metabolism; J.Translation,ribosomal structure and biogenesis; K.Transcription; L.Replication, recombination and repair; M.Cell wall/membrane/envelope biogenesis; N.Cell motility; O.Posttranslational modification,protein turnover,chaperones; P.Inorganic ion transport and metabolism; Q.Secondary metabolites biosynthesis,transport and catabolism; R.General function prediction only; S.Function unknown; T.Signal transduction mechanisms; U.Intracellular trafficking,secretion,and vesicular transport; V.Defense mechanisms; W.Extracellular structure;Y.Nucleic acid structure;Z.Cytoskeleton.

圖4繁景杜鵑Unigenes的COG功能分類
Fig.4FanjingRhododendronCOGclassificationofUnigenes

2.8差異表達基因分析

如圖6所示，差異表達的基因共有10 829個，其中上調(diào)表達基因6 347個，下調(diào)表達基因4 482個，上調(diào)與下調(diào)的基因相差較大，這些上調(diào)和下調(diào)的基因，為揭示杜鵑抗寒機理，及其相關代謝途徑分析提供了大量和可靠的數(shù)據(jù)。

2.9差異表達顯著的基因在低溫脅迫下的表達分析

分別取低溫脅迫處理后，上調(diào)表達和下調(diào)表達顯著的4個轉錄因子ALDH、ERF、MYB和bHLH家族中的24個基因，上調(diào)12個，下調(diào)12個(其中ALDH家族全部為上調(diào)表達的基因，ERF、MYB和bHLH家族中既有轉錄水平上調(diào)的也有轉錄水平下調(diào)的)，利用實時熒光定量PCR對其低溫脅迫處理前后表達變化進行分析。如圖7所示，熒光定量結果雖然在表達變化幅度上有些差異，但從24個基因的表達趨勢來看，除了20776基因相對表達量較低(0.2)，其余23個基因相對表達量均比較高，與轉錄組結果基本一致，且31795、10108、937 3個基因的相對表達量最高。實時熒光定量分析結果與轉錄組結果基本一致，說明本次Illumina測序所獲得的轉錄組數(shù)據(jù)可靠。

3 討論與結論

隨著新一代高通量測序技術的廣泛應用，植物基因組研究得到快速發(fā)展，但杜鵑基因組研究還很少。Illumina 高通量測序的數(shù)據(jù)量大、速度快、成本低、效率高，適合于沒有參考基因組信息的杜鵑展開轉錄組研究。本研究中通過組裝得到 Unigenes序列122 654個，說明本研究所得的數(shù)據(jù)量和數(shù)據(jù)信息較為豐富。前人應用轉錄組測序技術，分別對擬南芥在不同光強和溫度之下，分析了其分子機制及擬南芥中 872 個基因在其花粉突變體中的差異表達情況[16-17]。Liu等[18]運用Illumina 高通量測序的方法，發(fā)現(xiàn)了控制擬南芥發(fā)育出根的關鍵基因WOX11和WOX12。Li等[19]利用Illumina 測序技術分析了差異基因在越橘果皮和果肉中的表達情況，結果表明，核苷酸序列為4.8 Gb，Unigenes的平均長度為 735 bp，能夠進行基因功能注釋信息的有 25 376 個。Rowland 等[20]利用高通量測序技術研究了植物各組織之間的轉錄組信息與低溫鍛煉等的相關性，結果表明，所預測基因的表達情況和結果是一致的。根據(jù)張振亞等[21]的轉錄組數(shù)據(jù)的分析，發(fā)現(xiàn)其中有25個差異表達的基因在鹽脅迫下苜蓿和蛋白質(zhì)表達的變化趨勢相同，上調(diào)表達基因有14個，下調(diào)表達基因有11個，這些基因參與代謝、信號轉導、蛋白質(zhì)降解、防御、抗氧化、細胞骨架、膜轉運、轉錄等及一系列未知功能。孫穎等[22]利用 RNA-seq 技術對油桐 2 個不同發(fā)育時期的花芽的轉錄組進行比較分析，獲得大量差異表達的Unigenes序列，在一定程度上解析油桐花芽形態(tài)分化的分子調(diào)控模式與機制。陳娜等[23]利用高通量測序技術，通過低溫處理后芯片雜交實驗，篩選花生葉片中低溫脅迫響應轉錄因子基因。結果表明，175 個具有轉錄調(diào)控活性的基因在低溫脅迫的花生葉片中表達變化量達到 2 倍以上，其中 92 個為上調(diào)基因，83 個為下調(diào)基因。因此，通過轉錄組測序結合生物信息學分析及定量表達分析的方法尋找與杜鵑抗寒相關的基因也是可行的。

圖5 繁景杜鵑Unigenes的部分KEGG 分類Fig.5 Fanjing Rhododendron KEGG classification of Unigenes

本研究中應用Illumina高通量測序技術對杜鵑葉片轉錄組進行測序，研究其基因表達譜和挖掘低溫脅迫下的重要表達基因。本研究通過組裝得到 Unigene 序列122 654個，將測序結果與nr、Swiss-Prot、GO、KEGG等蛋白數(shù)據(jù)庫進行BlastX比對，有部分Unigenes無匹配信息，可能是片段過短或基因注釋信息匱乏等原因，也可能為杜鵑特有的基因序列。經(jīng)前人研究發(fā)現(xiàn)，GO在結構設計上的存在缺陷，同時基因的大部分功能目前并不明確，因此導致了這種基因注釋信息并不完整[24]。因此，在本研究中，繁景杜鵑通過 GO 數(shù)據(jù)庫對Unigenes所做的有關功能方面的分類等數(shù)據(jù)還不完善，仍有較多的Unigenes沒有對應相關的 GO 注釋，需要借助另外的生物信息學分析對 Unigenes功能進行進一步的分類和完整。將繁景杜鵑的Unigenes比對到 COG 數(shù)據(jù)庫，對基因的功能進行統(tǒng)計和歸類，從基因組層次，為其對銅元素的追蹤和預測未知開放閱讀框(ORF)的生物學功能提供了可能和便利，這使得基因功能的注釋更加精確。將以上Unigenes比對到KEGG 數(shù)據(jù)庫中，并對其代謝途徑進行分析，發(fā)現(xiàn)共涉及128個具體的代謝途徑分支，參與到繁景杜鵑體內(nèi)的碳水化合物代謝、能量代謝、轉錄與翻譯、信號轉導等代謝途徑中，為進一步大量挖掘杜鵑低溫脅迫下的重要表達基因，開展杜鵑的基因克隆及功能分析等研究提供了基礎數(shù)據(jù)。

圖6 繁景杜鵑差異表達基因統(tǒng)計Fig.6 Differential expression gene of Fanjing Rhododendron

圖7 低溫脅迫下差異表達顯著基因的相對表達量Fig.7 The relative expression of the differentially expressed genes under low temperature stress

通過熒光定量 PCR 結果分析發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，上調(diào)和下調(diào)表達顯著的4個轉錄因子家族中的24個基因，除了其中的20776基因相對表達量較低(0.2)，其余23個基因相對表達量均比較高，與轉錄組結果基本一致。其中31795、10108、937 3個基因的相對表達量較高，推測這3個基因可能在杜鵑低溫脅迫的過程中，行使著促進耐寒相關的功能。其中相對表達量最高的31795為醛脫氫酶(ALDH)轉錄家族中的基因，通過前人對該相關基因的研究，筆者發(fā)現(xiàn)，第一個在植物中被克隆出來的醛脫氫酶基因來自于玉米雄性不育恢復基因Rf2a，它在線粒體乙醛脫氫酶的合成中起關鍵作用[25-26]；而類似的是，通過對擬南芥AtALDH3I1基因的研究，發(fā)現(xiàn)該基因表達受多種脅迫的誘導，如干旱脅迫、高濃度鹽脅迫、重金屬脅迫以及脫落酸脅迫等[27]；Gao等[28]發(fā)現(xiàn)20個醛脫氫酶基因在水稻中，分屬于10個亞科。值得注意的是，約有12個與干旱脅迫或高濃度鹽脅迫相關的基因，表明植物中的醛脫氫酶積極地參與了植物的各類抗逆反應。目前，31795基因的生物學功能只是通過熒光定量表達分析以及通過對擬南芥、玉米和水稻中該基因功能的研究進行推斷，究竟它的功能是否如此，以及是否還參與其他生命和代謝活動，仍需進一步研究。

在本研究中，第一次利用 Illumina高通量測序技術構建了繁景杜鵑轉錄組數(shù)據(jù)庫，獲得了大量與轉錄本相關的信息，并通過序列組裝、功能注釋和分類、代謝途徑等對該基因的表達進行分析，挖掘出杜鵑低溫脅迫下轉錄組的整體表達特征。為深入研究杜鵑的基因克隆、抗逆機理以及分子標記開發(fā)提供了極大的方便，為杜鵑花科植物的分子生物學研究提供了豐富的數(shù)據(jù)資源。

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TranscriptomeAnalysisofSuperiorStrainsofRhododendronHybridsunderLowTemperatureStress

WU Yueyan1，MING Meng1，2，HE Jingwen1，2，LU Dan1，SHEN Zili1，QIU Tian1，WU Yanyan1，XIE Xiaohong1

(1.College of Biological and Environmental Sciences，Zhejiang Wanli University，Ningbo 315100，China；2.College of Fisheries and Life Science，Shanghai Ocean University，Shanghai 201306，China)

To explore the molecular mechanism of cold resistance ofRhododendron，screening of cold resistant genes，using artificial low temperature，excellent strains withRhododendronFanjing-6 ℃(T)and 25 ℃(CK)control as test materials，conduct transcriptome sequencing and de novo assembly data and bioinformatics analysis，the data obtained by assembling 122 654 Unigenes sequences，functional annotation showed that a large number of Unigenes could be annotated with GO and COG database，information，some of Unigenes，might be the unique gene sequence ofRhododendron.RhododendronFanjing transcription in the Unigenes group according to the GO function can be divided into cellular component，molecular function and biological process of 3 kinds of 51 branches，including Unigenes and metabolic process，a large number of catalytic activity and cell process. There were 6 347 up-regulated differentially expressed genes and down regulated expression genes of 4 482. The expression of 24 genes in the four transcription factors，with 12 up-regulated and 12 down-regulated at the transcription level，which were significantly different in the transcriptional results，was verified by the expression level under low temperature stress. It was found that the transcriptional data were reliable.

Rhododendron；Low temperature stress；Transcriptome；Cold-resistant genes

2017-08-16

浙江省重中之重學科“生物工程”開放基金項目(KF2015008)；寧波市重大科技專項(2014C11002)

吳月燕(1963-)，女，浙江金華人，教授，碩士，主要從事植物生理生化與分子生物學研究。

S685.21；Q78

A

1000-7091(2017)05-0052-09

10.7668/hbnxb.2017.05.009