潘順祥，趙美愛，裴玉賀，郭新梅，宋希云

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266019；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

玉米雄穗長(zhǎng)的全基因組關(guān)聯(lián)分析

潘順祥1，3，趙美愛1，3，裴玉賀2，3，郭新梅2，3，宋希云2，3

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)與植物保護(hù)學(xué)院，山東 青島 266019；3.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)，青島市主要農(nóng)作物種質(zhì)創(chuàng)新與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266109)

為了闡明雄穗長(zhǎng)的遺傳基礎(chǔ)并定位相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)，利用289份常用玉米自交系為試驗(yàn)材料，在自然條件下測(cè)量并分析玉米的株高、穗位高、雄穗柄長(zhǎng)與雄穗長(zhǎng)的相關(guān)性，并利用全基因組關(guān)聯(lián)分析對(duì)雄穗長(zhǎng)進(jìn)行初步定位。結(jié)果表明，玉米雄穗長(zhǎng)與3個(gè)農(nóng)藝性狀呈顯著相關(guān)或極顯著相關(guān)，其中與雄穗柄長(zhǎng)關(guān)聯(lián)最密切，相關(guān)系數(shù)最高達(dá)到0.717。同時(shí)共定位出13個(gè)與玉米雄穗長(zhǎng)相關(guān)的標(biāo)記位點(diǎn)，分別位于Bin1.05、Bin7.02、Bin8.03、Bin10.05處。采用全基因組關(guān)聯(lián)分析的方法發(fā)掘雄穗長(zhǎng)基因位點(diǎn)及候選基因，對(duì)揭示雄穗的遺傳機(jī)理，加速玉米育種進(jìn)程具有重要的意義。

雄穗長(zhǎng)；相關(guān)性分析；全基因組關(guān)聯(lián)分析

玉米雄穗是重要的生殖器官，也是玉米育種中被研究的重要農(nóng)藝性狀。較小的雄穗，不僅減少對(duì)養(yǎng)分的消耗，而且能夠增加下層葉片的透光性，從而提高產(chǎn)量[1]。玉米雄穗在最頂端，具有頂端優(yōu)勢(shì)，而且早于雌穗發(fā)育，與雌穗存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系[2]。長(zhǎng)期的玉米生產(chǎn)實(shí)踐表明，在玉米育種中雄穗具有減小的趨勢(shì)[3]。雄穗的長(zhǎng)短與雄穗大小密切相關(guān)，雄穗較短，對(duì)應(yīng)的雄穗相對(duì)較小。但在玉米育種過程中，卻要選擇有發(fā)達(dá)雄穗的父本，才能保證有足夠的花粉，提高育種質(zhì)量和降低成本[4]。因此，了解雄穗的遺傳規(guī)律，揭示雄穗發(fā)育的分子機(jī)理，對(duì)加速玉米育種進(jìn)程具有重要的意義。

玉米雄穗性狀屬于數(shù)量性狀，受多基因控制[5]。隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，QTL定位方法大量應(yīng)用于數(shù)量性狀的研究。借助QTL作圖，確定控制玉米雄穗長(zhǎng)的基因位點(diǎn)，為玉米育種改良提供理論依據(jù)。高世斌等[6]檢測(cè)玉米組合(N87-1×9526)F3家系，在正常和干旱條件下共同檢測(cè)到1個(gè)QTL位點(diǎn)位于2號(hào)染色體。許瀚元[7]以DH1M × T877雜交衍生的F2群體為作圖群體，在1號(hào)和9號(hào)染色體上各檢測(cè)到1個(gè)QTL位點(diǎn)。賈波等[8]以蘇玉16(JB×Y53)的F2：3家系為試驗(yàn)材料，在5號(hào)染色體檢測(cè)到2個(gè)玉米雄穗長(zhǎng)的QTL位點(diǎn)。但受到標(biāo)記密度的限制，QTL檢測(cè)的置信區(qū)間較大、有效性較低，難以為育種提供優(yōu)良等位基因的信息。而全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study，GWAS)具有高分辨率、高通量的優(yōu)勢(shì)，有利于鑒定種質(zhì)資源中的有利基因[9-10]。本研究利用全基因組關(guān)聯(lián)分析結(jié)合玉米自然條件下的農(nóng)藝性狀對(duì)雄穗長(zhǎng)進(jìn)行初步定位，以期為玉米育種父本的選擇提供科學(xué)的理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1試驗(yàn)材料

供試材料為289份玉米自交系構(gòu)建的自然群體，包括我國骨干自交系及國外引進(jìn)的優(yōu)良自交系、青島農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的骨干自交系。

1.2田間試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2014年在膠州、棗莊，2015年在青州、洛陽種植289份玉米自交系，3 m行長(zhǎng)，0.6 m行寬，每行15株，每個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)3個(gè)重復(fù)。在玉米開花后15 d測(cè)量全部植株的株高、穗位高、雄穗長(zhǎng)、雄穗柄長(zhǎng)。

1.3表型數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

利用SPSS 2.0軟件對(duì)玉米株高、穗位高、雄穗長(zhǎng)、雄穗柄長(zhǎng)的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)做相關(guān)性分析，同時(shí)對(duì)玉米雄穗長(zhǎng)的表現(xiàn)型數(shù)據(jù)進(jìn)行描述統(tǒng)計(jì)分析，獲得不同環(huán)境下雄穗長(zhǎng)的均值、方差、標(biāo)準(zhǔn)差、偏度、峰度及直方圖。

1.4玉米葉片總DNA的提取及基因型分析

在玉米六葉期時(shí)，每個(gè)自交系隨機(jī)選6株在葉片中部用打孔器取樣，參照CTAB法提取DNA[11]，送到美國先鋒公司利用MaizeSNP50基因芯片進(jìn)行基因分型。該芯片包括55 126個(gè)SNP標(biāo)記，均勻分布玉米B73的全基因組。SNP基因型檢測(cè)參照Illumina公司提供的操作指南，采用Illumina BeadStation 500 G SNP分型系統(tǒng)完成。參照Weng等[12]控制基因型數(shù)據(jù)質(zhì)量。

1.5SNP基因型的關(guān)聯(lián)分析

從55 126個(gè)SNP中剔除缺失率大于20%、雜合率大于10%和最小基因頻率低于0.05的標(biāo)記，剩余25 331個(gè)基因型Marker，利用TASSEL 5.0軟件對(duì)玉米雄穗長(zhǎng)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。在P<0.000 1水平上，判定SNP標(biāo)記與玉米雄穗長(zhǎng)的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1玉米雄穗長(zhǎng)的表型數(shù)據(jù)分析

將已獲得的玉米雄穗長(zhǎng)表現(xiàn)型數(shù)據(jù)導(dǎo)入軟件SPSS進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，同時(shí)得到不同環(huán)境下的直方圖，如表1、圖1所示。膠州、棗莊、青州、洛陽4個(gè)環(huán)境玉米雄穗長(zhǎng)的均值分別為34.81，35.23，25.35，29.70 cm，方差分別為23.327，44.849，17.321，11.470，標(biāo)準(zhǔn)差分別為4.551，6.697，4.162，3.387(表1)。4個(gè)環(huán)境下玉米雄穗長(zhǎng)表現(xiàn)型數(shù)據(jù)雖然存在一定差異，但整體呈正態(tài)分布，植株具有一定的代表性，符合全基因組關(guān)聯(lián)分析的要求，如圖2所示。

表1 不同環(huán)境下玉米雄穗長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)分析Tab.1 Statistical analysis of tassel length in maize under different environments

2.2玉米雄穗長(zhǎng)與株高、穗位高、雄穗柄長(zhǎng)的相關(guān)性分析

用SPSS做出2014，2015年雄穗長(zhǎng)與主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)性分析如表2。由表2可以看出，2014年膠州雄穗長(zhǎng)與株高、雄穗柄長(zhǎng)均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.505，0.553，與穗位高呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.151。2014年棗莊雄穗長(zhǎng)與株高、雄穗柄長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.430，0.393，與穗位高呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.157。2015年洛陽雄穗長(zhǎng)與株高、穗位高、雄穗柄長(zhǎng)呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.399，0.191，0.252。2015年青州雄穗長(zhǎng)與株高、雄穗柄長(zhǎng)均呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.251，0.717，與穗位高呈顯著相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.152。

A.2014年膠州雄穗長(zhǎng)；B.2014年棗莊雄穗長(zhǎng)；C.2015年青州雄穗長(zhǎng)；D.2015年洛陽雄穗長(zhǎng)。A.Tassel length in Jiaozhou during 2014；B.Tassel length in Zaozhuang during 2014；C. Tassel length in Qingzhou during 2015；D.Tassel length in Luoyang during 2015.

圖2 玉米雄穗長(zhǎng)全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖Fig.2 Quantile-quantile plot of genome-wide association analysis

2.3玉米雄穗長(zhǎng)的全基因組關(guān)聯(lián)分析

將25 331個(gè)基因Marker與雄穗長(zhǎng)用TASSEL5.0的MLM模型進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析。圖2為全基因組關(guān)聯(lián)分析的Q-Q圖，橫軸表示經(jīng)過負(fù)的常數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的期望P值，縱軸表示經(jīng)過負(fù)的常數(shù)對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換的觀察到的P值。圖3為4個(gè)環(huán)境的曼哈頓圖，縱軸間接表示各個(gè)標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)性。在2014年膠州篩選出5個(gè)標(biāo)記，分布在2，4，7號(hào)染色體，如圖3-A、表3。2014年棗莊篩選出5個(gè)標(biāo)記，分布在2，4，10號(hào)染色體，如圖3-B、表3。2015年洛陽篩選出11個(gè)標(biāo)記，分布在1，2，4，5，7，8，9號(hào)染色體，如圖3-C、表3。2015年青州篩選出13個(gè)標(biāo)記，分布在4，5，7，8，10號(hào)染色體，如圖3-D、表3。

表2 雄穗長(zhǎng)與主要農(nóng)藝性狀的相關(guān)分析Tab.2 Analysis on the correlation between the tassel length and the main agronomic traits cm

注：**.在 0.01 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)；*.在 0.05 水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

Note：**.Correlation is significant at the 0.01 level；*.Correlation is significant at the 0.05 level.

2.4玉米雄穗長(zhǎng)的候選基因分析

結(jié)合前人的研究結(jié)果[13-14]，共篩選出13個(gè)標(biāo)記，分布在Bin1.05、Bin7.02、Bin8.03和Bin10.05處。其中在Bin1.05處篩選出1個(gè)標(biāo)記，在Bin7.02處篩選出10個(gè)標(biāo)記，在Bin8.03處篩選出1個(gè)標(biāo)記，在Bin10.05處篩選出1個(gè)標(biāo)記(表4)。

3 討論

3.1雄穗長(zhǎng)定位結(jié)果比較分析

GWAS是一種以連鎖不平衡為基礎(chǔ)，將SNP均勻分布于全基因組，借助統(tǒng)計(jì)學(xué)工具分析某一群體目標(biāo)性狀遺傳變異的方法。目前，GWAS大量應(yīng)用于鑒定植物病害、開花期、籽粒性狀、株高等性狀的研究[12，15-17]。本研究采用289份玉米自交系組成的關(guān)聯(lián)作圖群體對(duì)玉米雄穗長(zhǎng)進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)分析，在4個(gè)環(huán)境中共檢測(cè)到34個(gè)與玉米雄穗長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)(P< 0.000 1)的SNP。

A.2014年膠州雄穗長(zhǎng)曼哈頓圖；B.2014年棗莊雄穗長(zhǎng)曼哈頓圖；C.2015年洛陽雄穗長(zhǎng)曼哈頓圖；D.2015年青州雄穗長(zhǎng)曼哈頓圖。A.Manhatton plot of tassel length in Jiaozhou during 2014；B.Manhatton plot of tassel length in Zaozhuang during 2014；C.Manhatton plot of tassel length in Luoyang during 2015；D.Manhatton plot of tassel length in Qingzhou during 2015.

染色體Chromosome12345678910總數(shù)Sum膠州Jiaozhou-1-2--2---5棗莊Zaozhuang-1-3-----15洛陽Luoyang11-22-311-11青州Qingzhou---13-62-113

Tuberosa等[18]提出，相同性狀的QTL在不同環(huán)境下檢測(cè)到，且效應(yīng)方向相同，置信區(qū)間、標(biāo)記區(qū)間重疊，可認(rèn)為是同一QTL位點(diǎn)，Tian等[19]認(rèn)為連鎖定位和關(guān)聯(lián)分析都可以檢測(cè)數(shù)量性狀位點(diǎn)，2種方法檢測(cè)到的位點(diǎn)在位置上大部分具有一致性。本研究檢測(cè)到的13個(gè)標(biāo)記中，有3個(gè)位于已定位的QTL區(qū)段內(nèi)。PZE_101121282位于Bin1.05內(nèi)，與許瀚元[7]和王玉民[13]的研究結(jié)果一致；PZE_108043283位于Bin8.03內(nèi)，與王玉民[13]的研究結(jié)果一致；SYN4826位于Bin10.05內(nèi)，與付家鋒[14]的研究結(jié)果一致。4個(gè)環(huán)境在4號(hào)染色體都檢測(cè)到玉米雄穗長(zhǎng)的相關(guān)基因位點(diǎn)，說明此染色體極大可能存在與玉米雄穗長(zhǎng)相關(guān)的基因位點(diǎn)。進(jìn)一步研究時(shí)，可以在此區(qū)間適量加大標(biāo)記密度。但本研究檢測(cè)到的顯著位點(diǎn)并非都與已經(jīng)定位的QTL重疊，可能是因?yàn)榍叭瞬捎玫碾p親QTL作圖法受親本種質(zhì)背景或檢測(cè)微效QTL功效較低的影響。這表明采用全基因組關(guān)聯(lián)分析策略是一種解析雄穗長(zhǎng)遺傳結(jié)構(gòu)的有效方法[17]。

表4 13個(gè)與雄穗長(zhǎng)顯著相關(guān)的SNP位點(diǎn)Tab.4 The 13 SNP associated with tassel length

3.2候選基因分析

本研究檢測(cè)出的13個(gè)與玉米雄穗長(zhǎng)顯著關(guān)聯(lián)的SNP標(biāo)記位點(diǎn)進(jìn)行掃描分析，得到SNP對(duì)應(yīng)的候選基因。其中crt2為鈣網(wǎng)蛋白，該蛋白是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)/肌漿網(wǎng)主要的Ca2+結(jié)合蛋白，通過協(xié)助蛋白質(zhì)正確折疊和維持細(xì)胞Ca2+穩(wěn)態(tài)而參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、黏附、類固醇敏感性基因表達(dá)和自身免疫反應(yīng)等[20]。LOC103632297編碼磷脂酰肌醇轉(zhuǎn)移蛋白(PITP)，該蛋白普遍存在于真核生物細(xì)胞中，PITP能夠結(jié)合并交換一分子的磷脂酰肌醇(Phosphatidylinositol，PI)或磷脂酰膽堿(Phosphatidylcholine，PC)，并促進(jìn)這兩類脂分子在細(xì)胞內(nèi)膜組分間的轉(zhuǎn)移。PITP對(duì)細(xì)胞內(nèi)膜組分間脂類的運(yùn)輸和代謝、分泌囊泡的形成和運(yùn)輸、磷脂酶C(Phospholipase，PLC)調(diào)節(jié)的信號(hào)傳導(dǎo)以及神經(jīng)退化等生理生化過程具有重要的影響[21]。上述基因信息可能為克隆相關(guān)基因提供參考借鑒。

玉米雄穗長(zhǎng)為多基因控制的數(shù)量性狀，且受環(huán)境影響較大，研究過程比較復(fù)雜、可控性差，本試驗(yàn)結(jié)果可以為今后研究玉米雄穗長(zhǎng)的基因位點(diǎn)提供參考依據(jù)，同時(shí)為進(jìn)一步進(jìn)行玉米雄穗長(zhǎng)相關(guān)基因位點(diǎn)的精細(xì)定位、候選基因的功能及表達(dá)分析奠定理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為玉米育種提供參考借鑒。

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Genome-wideAssociationAnalysisofTasselLengthinMaize

PAN Shunxiang1，3，ZHAO Meiai1，3，PEI Yuhe2，3，GUO Xinmei2，3，SONG Xiyun2，3

(1.College of Life Science，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；2.College of Agronomy and Plant Protection，Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，China；3.Qingdao Agricultural University，Qingdao Key Lab of Germplasm Innovation and Application of Major Crops，Qingdao 266109，China)

In order to explain the genetic basis of tassel length and locate the related QTLs，289 maize inbred lines were used as the experimental material，the correlation between the tassel length of maize and plant height，ear height，tassel stem length were measured and analyzed under natural conditions，and genome association analysis was also applied to initially map the length of tassel. The results showed that tassel length and the three agronomic traits were significantly or extremely significantly correlated，therein，tassel length had the most significant correlation with tassel stem length，and the highest correlation coefficient has reached 0.717.At the same time，a total of 13 marker sites correlated with tassel length were identified and they were located on Bin1.05，Bin7.02，Bin8.03 and Bin10.05. Genome-wide association analysis was used to explore the long locus and candidate genes，which had an important significance to reveal the genetic mechanism of tassel and accelerate the process of maize breeding.

Tassel length；Correlation analysis；Genome-wide association analysis

2017-07-10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31371636)；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系玉米產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-01-022-01)；山東省農(nóng)業(yè)良種工程；山東省農(nóng)業(yè)生物資源創(chuàng)新利用研究課題和青島市應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目(14-2-4-13-jch)

潘順祥(1990-)，男，山東濰坊人，碩士，主要從事作物遺傳育種研究。

宋希云(1961-)，男，山東濰坊人，教授，博士，主要從事玉米遺傳育種、生化與分子生物學(xué)研究。

Q78；S513.03

A

1000-7091(2017)05-0031-06

10.7668/hbnxb.2017.05.006