許崇利，許崇波，宮語晨，歐陽紅生

(1.吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林132022； 2.韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)院，粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān)512005； 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118； 4.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1654-1660

許崇利，許崇波，宮語晨，等. 肝過表達(dá)hNPC1L1促進(jìn)脂質(zhì)過氧化[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(10): 1654-1660.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.09

2016-10-12

國家科技支撐計(jì)劃(2011BA115B02)

許崇利(1974—)，男，黑龍江雞東人，博士，教授，研究方向?yàn)槲⑸锓肿由飳W(xué)。E-mail: xcl902@163.com

*通信作者，歐陽紅生，E-mail: ouyh@jlu.edu.cn

肝過表達(dá)hNPC1L1促進(jìn)脂質(zhì)過氧化

許崇利1，許崇波2，宮語晨3，歐陽紅生4，*

(1.吉林化工學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，吉林 吉林132022； 2.韶關(guān)學(xué)院 英東生命科學(xué)院，粵北生豬生產(chǎn)及疫病防控協(xié)同創(chuàng)新發(fā)展中心，廣東 韶關(guān)512005； 3.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118； 4.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130062)

利用體細(xì)胞核移植技術(shù)將構(gòu)建的肝過表達(dá)hNPC1L1的小型豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，構(gòu)建了肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬，PCR和RT-PCR鑒定表明hNPC1L1特異性地表達(dá)于肝組織。對(duì)轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬進(jìn)行了初步研究，脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物丙二醛(MDA)檢測(cè)表明：轉(zhuǎn)基因豬MDA含量(7.51±0.09)nmol·mL-1顯著高于非轉(zhuǎn)基因豬(3.56±0.16)nmol·mL-1(P<0.001)，說明肝組織發(fā)生了嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化。超氧化物歧化酶(SOD)活性檢測(cè)表明：SOD活性為(131±4.61)U·mg-1顯著低于非轉(zhuǎn)基因豬[(229.2±4.39)U·mg-1](P<0.001)，說明肝臟清除自由基和抗氧化能力大大下降。試驗(yàn)揭示出在肝臟過表達(dá)hNPC1L1導(dǎo)致嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化，表明NPC1L1在脂代謝紊亂和肝臟疾病中扮演著重要的角色，有望成為肝臟疾病治療新的靶標(biāo)。

hNPC1L1；過表達(dá)；體細(xì)胞核移植；脂質(zhì)過氧化

膽固醇是組成細(xì)胞膜的必需部分，在類固醇激素、膽汁酸合成及細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生物學(xué)過程都發(fā)揮著重要作用[1-3]。膽固醇在體內(nèi)承擔(dān)著關(guān)鍵的信號(hào)分子作用，其必須維持動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦膽固醇平衡被打破或者其調(diào)控機(jī)制發(fā)生紊亂都會(huì)對(duì)人體健康造成極大影響，比如血膽固醇濃度過高就會(huì)引起動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病等心腦血管疾病[4-5]。研究發(fā)現(xiàn)，作為依澤替米貝(Ezetimibe)的分子靶標(biāo)，NPC1L1(Niemann-Pick C1-Like 1)在膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收過程中扮演著重要角色。NPC1L1位于腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜和肝臟膽小管膜上，調(diào)控著體內(nèi)膽固醇代謝平衡[6-7]。與NPC1L1緊密相關(guān)的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)在許多代謝性疾病中都起著關(guān)鍵作用，比如非酒精性脂肪肝、胰島素抗性、糖尿病、肥胖癥及心腦血管疾病[8-11]。但NPC1L1在導(dǎo)致肝臟疾病的脂代謝紊亂中的分子機(jī)制并沒有完全被闡明。先前的研究表明，NPC1L1與脂肪肝密切相關(guān)。脂質(zhì)過氧化在心血管疾病、糖尿病、高血壓、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化等許多慢性疾病中所起的作用越來越被研究者所重視，脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒產(chǎn)物丙二醛(MDA)，其能激活一些受體、調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)通路從而引起各種疾病，因此丙二醛已經(jīng)成為疾病診斷的標(biāo)記物[12-14]?，F(xiàn)有的研究表明，NPC1L1與肝脂代謝紊亂必然存在某種聯(lián)系，因此有必要構(gòu)建一個(gè)NPC1L1轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物，以期闡明其在脂代謝中作用的分子機(jī)制，從而為由此引發(fā)的肝臟疾病找尋新的治療途徑。

近年來，隨著原核顯微注射、胚胎干細(xì)胞介導(dǎo)、核移植、精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移(sperm-mediated gene transfer，SMGT)和體細(xì)胞核移植(somatic cell nuclear transfer，SCNT)等轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，轉(zhuǎn)基因豬在各種疾病研究中發(fā)揮了重要作用[15-18]。SCNT已成功克隆了多種動(dòng)物并且克隆豬在生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域已獲得豐碩成果，尤其在研究疾病以及基因和環(huán)境因素相互作用的生物特性方面，比如肥胖癥、抑郁癥和心血管疾病，轉(zhuǎn)基因豬都具有寶貴價(jià)值。本研究利用體細(xì)胞核移植技術(shù)將構(gòu)建的肝過表達(dá)hNPC1L1的小型豬胎兒成纖維細(xì)胞作為核供體細(xì)胞，構(gòu)建了肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬，并對(duì)轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物丙二醛含量和清除氧自由基的超氧化物歧化酶(SOD)活性以及其他生理生化指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)，以期揭示肝臟過表達(dá)hNPC1L1在脂質(zhì)過氧化中作用。

1 材料與方法

1.1 載體、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

小型豬胎兒成纖維細(xì)胞和pLiv-11-Neor/Kanr-hNPC1L1重組質(zhì)粒由吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，代孕的雌性巴馬小型豬由第三軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物教研室提供。

1.2 試劑

D2000、DNA Marker Ⅲ、Proteinase K、SpeI酶、TIANamp Genomic DNA Kit基因組DNA 提取試劑盒、TRNzol Reagent總RNA 提取試劑盒、Quant一步法RT-PCR試劑盒、2×TaqPlatinum PCR MasterMix購自北京天根生化科技有限公司；Biospin質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒購自杭州博日科技有限公司；游離脂肪酸(NEFA)測(cè)試盒、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法測(cè)定試劑盒、豬HMG-CoA還原酶(HMGCR)酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自南京建成生物工程研究所；FuGENE?HD Transfection Reagent購自Roche公司；胎牛血清(FBS)、NP-40、DMEM購自 Invitrogen公司；二甲基亞砜(DMSO)和G418購自 Sigma 公司。

1.3肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的構(gòu)建

肝過表達(dá)hNPC1L1重組質(zhì)粒pLiv-11-Neor/Kanr-hNPC1L1主要的表達(dá)構(gòu)件包括apoE啟動(dòng)子、apoE增強(qiáng)子、apoE肝內(nèi)調(diào)控區(qū)。apoE增強(qiáng)子和apoE肝內(nèi)調(diào)控區(qū)，用于增強(qiáng)在肝內(nèi)特異性表達(dá)。重組質(zhì)粒經(jīng)SpeI單酶切線性化后，體積比75%乙醇純化回收，F(xiàn)uGENE?6轉(zhuǎn)染至小型豬胎兒成纖維細(xì)胞，800 μg·mL-1G418 選擇培養(yǎng)基，篩選獲得陽性細(xì)胞克隆，將鑒定為陽性的細(xì)胞克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)并凍存。收集屠宰場(chǎng)豬卵巢并制備成熟卵母細(xì)胞。采用盲吸法去除成熟卵母細(xì)胞核，再用注射針吸取供體細(xì)胞注射進(jìn)卵周間隙進(jìn)行重組胚的電融合。選取雌性巴馬小型豬作為代孕受體，戊巴比妥鈉水溶液和異氟烷麻醉后，經(jīng)手術(shù)將胚胎移植到輸卵管內(nèi)，抗生素消炎1周，定期觀察胎兒發(fā)育狀況，3個(gè)月后檢測(cè)產(chǎn)仔情況。

1.4 轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的PCR和RT-PCR鑒定

以提取的基因組作為模板，根據(jù)hNPC1L1基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物進(jìn)行基因組水平的鑒定。另外分別提取轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬肝、心、脾、肺、腎、胃、胰、腸、肌肉組織的總RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，檢測(cè)hNPC1L1在各組織中的表達(dá)情況。以GAPDH為內(nèi)參，同時(shí)以pLiv-11-Neor/Kanr-hNPC1L1質(zhì)粒為陽性對(duì)照，以非轉(zhuǎn)基因豬和不加模板的水為陰性對(duì)照。鑒定的引物序列見表1。

1.5 轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的生理生化指標(biāo)檢測(cè)

轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因豬隔夜禁食，采取新鮮血液和肝組織常規(guī)方法制備血清和肝勻漿，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase,,ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)。血清游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)采用銅染色法測(cè)定，空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管分別加入ddH2O、棕櫚酸和待測(cè)樣本，加入相應(yīng)的緩沖液。混勻抽提2 min，3 500g離心10 min，棄去上層藍(lán)色液體及蛋白凝塊，吸取下層抽提液至新的試管中。取試管下層抽提液2 mL，分別加入0.25 mL顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)。用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，按下列公式計(jì)算血清FFA含量：

1.6 轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬肝脂質(zhì)過氧化檢測(cè)

1.6.1 脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛(malondialdehyde，MDA)測(cè)定

采用TBA法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde，MDA)，常規(guī)方法制備肝組織勻漿，將肝組織用PBS漂洗干凈，吸水紙吸干，稱取200 mg放入勻漿器內(nèi)并置于冰上，加入1.8 mL PBS，勻漿混勻，3 000g離心10 min，取上清備用。標(biāo)準(zhǔn)管和測(cè)定管中分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本后加入相應(yīng)緩沖液混勻，95 ℃ 40 min，涼水冷卻，4 000g離心10 min，取上清用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值，按下列公式計(jì)算MDA含量：

MDA濃度單位為nmol·mgprot-1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度單位為10 nmol·mL-1、待測(cè)樣本蛋白濃度單位為mgprot·mL-1。

1.6.2 肝勻漿超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測(cè)定

采用WST-1法測(cè)定SOD活性，常規(guī)方法制備肝組織勻漿待用。在96孔酶標(biāo)板中，對(duì)照孔和測(cè)定孔分別加入20 μL ddH2O和待測(cè)樣本，接著分別加入20 μL酶工作液，200 μL底物應(yīng)用液混勻，37 ℃孵育20 min，酶標(biāo)儀讀數(shù)，反應(yīng)體系中SOD 抑制率達(dá)50%時(shí)所對(duì)應(yīng)的酶量為一個(gè)SOD活力單位(U)。按下列公式計(jì)算SOD活力。

表1PCR和RT-PCR鑒定的引物序列

Table1Primer sequences for PCR and RT-PCR

引物Primer上游引物Upstreamprimersequence(5′→3′)下游引物Downstreamprimersequence(5′→3′)PCRTAATGCAACAAGGCTTGGAAGGCTAACCTGCATGGCTCGAGTAATCGATACCGTCGACTAGRT?PCRTATTTCCAGAACAACCGCACGCTCTGGGCAGGTCTTCAGCTGTGGTGCGGAPDHCATGGTCTACATGTTCCAGTATGCCACAGCCTTGGCAGCGCCGGTAG

SOD活力(U·mgprot-1)=SOD抑制率÷50%×(反應(yīng)體系稀釋倍數(shù))÷(待測(cè)樣本蛋白濃度)

1.7 3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase，HMGCR)測(cè)定

采用雙抗體夾心法測(cè)定HMGCR活性，常規(guī)方法制備肝組織勻漿待用。標(biāo)準(zhǔn)孔和測(cè)定孔分別加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品混勻，37 ℃孵育30 min，棄去液體甩干，每孔加滿洗滌液靜置30 s后棄去，重復(fù)5次，每孔加50 μL酶標(biāo)試劑，37 ℃孵育30 min，洗滌液清洗5次，加顯色劑A和B各50 μL混勻，37 ℃避光顯色10 min，每孔加50 μL終止液，測(cè)定吸光度D值，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，D值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測(cè)樣本的D值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度。

1.8 Real-Time PCR檢測(cè)肝中基因表達(dá)情況

用TRIzol提取肝組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA作為PCR模板，使用熒光定量試劑盒進(jìn)行Real-Time PCR。根據(jù)GenBank檢索的NPC1L1、ABCA1、ABCG5、ABCG8、FAS、HMGCR和SREBP-1c基因編碼序列設(shè)計(jì)引物，引物序列見表2，反應(yīng)體系25 μL，包括2×SYBR Mix 12.5 μL、上下游引物各0.5 μL、TaqDNA Polymerase 0.15 μL、模板2.0 μL和ddH2O 9.35 μL。反應(yīng)條件：95 ℃ 3 min，95 ℃ 10 s，49～58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，40循環(huán)。以ΔΔCt值法，以GAPDH為內(nèi)參定量上述基因表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的制備與鑒定

重構(gòu)胚移植到受體母豬，110 d后獲得了 11頭健康的巴馬克隆豬，如圖1所示。以提取的轉(zhuǎn)基因豬基因組作為模板，利用引物擴(kuò)增出4 267 bp目的條帶，并設(shè)立陽性對(duì)照和陰性對(duì)照，結(jié)果如圖2所示7頭克隆豬為陽性。分別提取轉(zhuǎn)基因豬和非轉(zhuǎn)基因豬肝、心、脾、肺、腎組織的總RNA，進(jìn)行RT-PCR分析，結(jié)果如圖3所示，只在轉(zhuǎn)基因豬的肝中擴(kuò)增出427 bp目的基因片段，其他組織和非轉(zhuǎn)基因肝中均未擴(kuò)增出目的基因片段，說明hNPC1L1只在轉(zhuǎn)基因豬的肝中表達(dá)。GAPDH作為內(nèi)參，其擴(kuò)增產(chǎn)物為470 bp。

2.2肝過表達(dá)hNPC1L1對(duì)血清和肝勻漿血脂的影響

轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因豬隔夜禁食，采取新鮮血液和肝組織常規(guī)方法制備血清和肝勻漿，檢測(cè)TG、TC、HDL-C、LDL-C、ALT、AST、FFA，結(jié)果如表4所示，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組對(duì)比，血清FFA和AST顯著升高(P<0.01)，其他指標(biāo)無明顯差異。

表2Real-time PCR引物序列

Table2Primer sequence for real-time PCR

引物Primer上游引物Upstreamprimersequence(5′→3′)下游引物Downstreamprimersequence(5′→3′)產(chǎn)物長(zhǎng)度Productlength/bpNPC1LTGGGTGGACGACTTCATTGCGCCTTTGGGACATTTGA226ABCA1ACCTGCTCAGCGGTATGGACCAAAGGGTGGCACAATCAAG198ABCG5TTATCCCAACTCTTGTCATCCTGTCACATGGCATCCTTTTTCTC153ABCG8CCCAGGTGCCTTGGTTTGTGCCCGTTGATCCAGATTT226FASCTGTATCGCTGGACCACTGGCACTCAGACTCCCTTT101HMGCRAACTCACAGGATGAAGTAAGGGAGAACACGAAGTAGGTGGCGA183SREBP?1cAAGCGGACGGCTCACAATCAAGACGGCGGATTTATTCA120GAPDHATTCCACGGCACAGTCAAGGACATACTCAGCACCAGCATCG120

圖1 克隆巴馬小型豬照片F(xiàn)ig.1 Photograph of clone Bama miniature pig

M， DNA marker Ⅲ; 1， 陰性對(duì)照; 2， 水對(duì)照; 3， 陽性對(duì)照; 4～8、13～14， 陽性克隆豬M， DNA marker Ⅲ; 1， Negative control; 2， Water control; 3， Positive control; 4-8 and 13-14， Positive cloned pig圖2 轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的PCR鑒定Fig.2 Identification of transgenic Bama miniature pig by PCR

M， D2000 DNA Marker；1， 轉(zhuǎn)基因肝；2， 轉(zhuǎn)基因肝GAPDH；3， 非轉(zhuǎn)基因肝；4， 非轉(zhuǎn)基因肝GAPDH；5， 轉(zhuǎn)基因心；6， 轉(zhuǎn)基因心GAPDH；7， 非轉(zhuǎn)基因心；8， 非轉(zhuǎn)基因心GAPDH；9， 轉(zhuǎn)基因脾；10， 轉(zhuǎn)基因脾GAPDH；11， 非轉(zhuǎn)基因脾；12， 非轉(zhuǎn)基因脾GAPDH；13， 轉(zhuǎn)基因肺；14， 轉(zhuǎn)基因肺GAPDH；15， 非轉(zhuǎn)基因肺；16， 非轉(zhuǎn)基因肺GAPDH；17， 轉(zhuǎn)基因腎；18， 轉(zhuǎn)基因腎GAPDH；19， 非轉(zhuǎn)基因腎；20， 非轉(zhuǎn)基因腎GAPDH；21， 水對(duì)照；22， 陽性對(duì)照M， D2000 DNA Marker; 1， Transgenic liver; 2， Transgenic liver GAPDH; 3， Non-transgenic liver; 4， Non-transgenic liver GAPDH; 5， Transgenic heart; 6， Transgenic heart GAPDH; 7， Non-transgenic heart; 8， Non-transgenic heart GAPDH; 9， Transgenic spleen; 10， Transgenic spleen GAPDH; 11， Non-transgenic spleen; 12， Non-transgenic spleen GAPDH; 13， Transgenic lung; 14， Transgenic lung GAPDH; 15， Non-transgenic lung; 16， Non-transgenic lung GAPDH; 17， Transgenic kidney; 18， Transgenic kidney GAPDH; 19， Non-transgenic kidney; 20， Non-transgenic kidney GAPDH; 21， Water control; 22， Positive control圖3 轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬的RT-PCR鑒定Fig.3 Identification of transgenic Bama miniature pig by RT-PCR

2.3 肝勻漿MDA、SOD、HMGCR水平變化

采取轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因豬肝組織制備肝勻漿，檢測(cè)MDA、SOD、HMGCR，結(jié)果如表5所示，轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組對(duì)比MDA顯著升高(P<0.001)，SOD顯著降低(P<0.001)，HMGCR無明顯差異。說明肝過表達(dá)hNPC1L1促進(jìn)了肝臟脂質(zhì)過氧化，造成肝損傷。

2.4 Real-time PCR檢測(cè)肝中脂代謝相關(guān)基因的表達(dá)

為了揭示肝過表達(dá)hNPC1L1引起肝脂質(zhì)過氧氧化發(fā)生的機(jī)制，利用Real-time PCR 檢測(cè)肝中與膽固醇和脂肪代謝密切相關(guān)基因表達(dá)情況，結(jié)果如圖4所示，SREBP-1c(P<0.05)和FAS(P<0.01)均顯著增加，但pNPC1L1、ABCA1、ABCG5、ABCG8、HMGCR并沒有顯著差異。

表4血清和肝勻漿血脂檢測(cè)結(jié)果

Table4Test results of serum and liver homogenate lipid

基因型Genotype樣品數(shù)Samplenumber轉(zhuǎn)基因豬Transgenicpig非轉(zhuǎn)基因豬Non?transgenicpig肝勻漿TGliverhomogenateTG/(mmol·L-1)5114±047116±034肝勻漿TCliverhomogenateTC/(mmol·L-1)5029±01023±003血清TGserumTG/(mmol·L-1)5060±008081±021血清TCserumTC/(mmol·L-1)5263±017227±007血清HDL?CserumHDL?C/(mmol·L-1)5090±011066±007血清LDL?CserumLDL?C/(mmol·L-1)5133±01013±011血清FFAserumFFA/(μmol·L-1)563770±953??54040±2546血清ALTserumALT/(U·L-1)55800±2835060±584血清ASTserumAST/(U·L-1)520080±2231??9240±1555

**和***分別表示同行數(shù)據(jù)(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤)差異在P<0.01和P<0.001水平上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。下同。

** and *** indicated significant difference among values (meam±SE) in the same row atP<0.01 andP<0.001， respectively. The same as below.

表5肝勻漿MDA、SOD、HMGCR檢測(cè)結(jié)果

Table5Test results of homogenate MDA， SOD and HMGCR in liver

基因型Genotype樣品數(shù)Samplenumber轉(zhuǎn)基因豬Transgenicpig非轉(zhuǎn)基因豬Non?transgenicpigMDA/(nmol·mL-1)5751±009???356±016SOD/(U·mg-1)513100±461???22920±439HMGCR/(U·L-1)5210200±9740220200±8685

圖4 pNPC1L1，ABCA1，ABCG5，ABCG8，F(xiàn)AS，HMGCR，SREBP-1c mRNA表達(dá)變化Fig.4 mRNA expression level of pNPC1L1， ABCA1， ABCG5， ABCG8， FAS， HMGCR， SREBP-1c

3 討論

NPC1L1在代謝類疾病中起著關(guān)鍵作用，NPC1L1基因敲除小鼠即使喂飼高脂肪和高膽固醇也不會(huì)產(chǎn)生脂肪肝。NPC1L1是依澤替米貝的分子靶標(biāo)，依澤替米貝對(duì)喂飼高脂肪和高膽固醇的小鼠肝脂肪變性可起到有效的治療作用，其肝臟中的脂肪含量顯著降低，相關(guān)酶類和脂類水平都得到有效改善。肝臟的脂肪變性與胰島素耐受性密切相關(guān)，而依澤替米貝和NPC1L1基因敲除都可改善胰島素敏感性從而抑制肝臟脂肪變性。上述研究表明NPC1L1在代謝類疾病的發(fā)病機(jī)制中起著關(guān)鍵作用，它的生理學(xué)作用不僅僅是簡(jiǎn)單的介導(dǎo)腸道膽固醇吸收。抑制NPC1L1表達(dá)或者切斷NPC1L1轉(zhuǎn)運(yùn)膽固醇途徑對(duì)于非酒精性脂肪肝和2型糖尿病等代謝類疾病都會(huì)起到有效的預(yù)防和治療作用。

脂質(zhì)過氧化指體內(nèi)多不飽和脂肪酸和脂質(zhì)的氧化變質(zhì)，其對(duì)脂蛋白、細(xì)胞膜和其他含脂質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)造成嚴(yán)重的損害作用，改變細(xì)胞膜流動(dòng)性和滲透性、損壞蛋白質(zhì)和DNA，從而影響細(xì)胞功能。人類的許多疾病如心血管疾病、非酒精性脂肪肝、糖尿病、高血壓、癌癥和動(dòng)脈粥樣硬化等許多慢性疾病都與體內(nèi)的脂質(zhì)過氧化密切相關(guān)。脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生對(duì)細(xì)胞有毒產(chǎn)物丙二醛(MDA)可直接破壞細(xì)胞膜，激活一些受體從而調(diào)控基因表達(dá)和信號(hào)通路而引起各種疾病，MDA水平可反映出組織受氧化損傷的程度，測(cè)定體內(nèi)MDA含量可指示出體內(nèi)氧自由基代謝情況及細(xì)胞受自由基攻擊的程度，因此MDA已經(jīng)成為疾病診斷的標(biāo)記物。超氧化物歧化酶(SOD)可清除體內(nèi)的氧自由基，是有機(jī)體的抗氧化系統(tǒng)成員之一，可以有效避免氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害作用。

現(xiàn)有的研究表明NPC1L1與肝脂代謝紊亂必然存在某種聯(lián)系，因此有必要構(gòu)建一個(gè)NPC1L1轉(zhuǎn)基因模型動(dòng)物，以期闡明其在脂代謝中作用的分子機(jī)制，從而為由此引發(fā)的肝臟疾病找尋新的治療途徑。本研究在成功構(gòu)建了肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬并對(duì)其進(jìn)行了初步研究。在肝過表達(dá)hNPC1L1轉(zhuǎn)基因巴馬小型豬中，作為肝臟脂肪合成基因關(guān)鍵的調(diào)控因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(SREBP-1c)表達(dá)顯著增加，從而激活脂肪酸合酶活性，導(dǎo)致游離脂肪酸增加。過多的游離脂肪酸能引起線粒體腫脹、膜通透性增加和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，尤其是高濃度游離脂肪酸還可引發(fā)脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致肝損傷，發(fā)展成脂肪性肝炎、肝纖維化，最終形成肝硬化。作為脂質(zhì)過氧化標(biāo)記物的丙二醛，具有細(xì)胞毒性和遺傳毒性，檢測(cè)結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因組與非轉(zhuǎn)基因組對(duì)比MDA顯著升高(P<0.001)，SOD顯著降低(P<0.001)，表明肝臟發(fā)生了脂質(zhì)過氧化。本研究揭示出在肝臟過表達(dá)hNPC1L1導(dǎo)致嚴(yán)重的脂質(zhì)過氧化，表明NPC1L1在脂代謝紊亂和肝臟疾病中扮演著重要的角色，有望成為肝臟疾病治療新的靶標(biāo)。

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OverexpressionofhumanNiemann-PickC1-Like1inliversaccelerateslipidperoxidation

XU Chongli1， XU Chongbo2, GONG Yuchen3, OUYANG Hongsheng4，*

(1.CollegeofBiologyandFoodEngineering，JilinInstituteofChemicalTechnology，Jilin132022，China; 2.NorthGuangdongCollaborativeInnovationandDevelopmentCenterforSwineFarmingandDiseaseControl，YingdongCollegeofLifeSciences，ShaoguanUniversity，Shaoguan512005，China; 3.CollegeofAnimalScience，JilinAgriculturalUniversity，Changchun130118，China; 4.CollegeofVeterinaryMedicine，JilinUniversity，Changchun130062，China)

The transgenic Bama miniature pigs in which human Niemann-Pick C1-Like 1(hNPC1L1) was overexpressed in the livers were constructed by using somatic cell nuclear transfer technique with the minipig fetal fibroblast cells as the nuclear donor cells. ThehNPC1L1 was specifically expressed in transgenic liver tissues as revealed by PCR and reverse transcriptase (RT)-PCR analysis. A preliminary study on transgenic Bama miniature pigs was carried out， and the marker malondialdehyde (MDA) of lipid peroxidation was detected. The result showed that the level of MDA in transgenic pigs [(7.51±0.09) nmol·mL-1] was significantly higher than that in non-transgenic pigs [(3.56±0.16) nmol·mL-1] (P<0.001)， but SOD level in transgenic pigs [(131±4.61)U·mg-1] was significantly lower than that in non-transgenic pigs [(229.2±4.39)U·mg-1] (P<0.001). All of these suggested that severe lipid peroxidation occurred in the liver and the oxygen free radical scavenging and antioxidant capacity were significantly reduced. This study revealed that overexpression of NPC1L1 in the liver led to severe lipid peroxidation， which indicated that NPC1L1 played an important role in lipid metabolism disorders and liver diseases and could be a new target for liver disease treatment.

human Niemann-Pick C1-Like 1; overexpression; somatic cell nuclear transfer; lipid peroxidation

S828；Q512

A

1004-1524(2017)10-1654-07

（責(zé)任編輯盧福莊)