陳 穎，鄭圣晗，孔令琳，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌

(揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1648-1653

陳穎，鄭圣晗，孔令琳，等. 不同雞品種BNK基因序列比較分析[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(10)： 1648-1653.

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2017-01-19

國家自然科學(xué)基金(31372297)；江蘇省六大人才高峰項(xiàng)目(2015-NY-019)

陳穎(1991—)，女，山東菏澤人，碩士研究生，從事家禽遺傳育種研究。E-mail: 984662816@qq.com

*通信作者，常國斌，E-mail: passioncgb@163.com

不同雞品種BNK基因序列比較分析

陳 穎，鄭圣晗，孔令琳，朱鵬飛，吳 允，郭其新，陳國宏，常國斌*

(揚(yáng)州大學(xué) 動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009)

BNK(C-type lectin-like receptor 2)基因?yàn)镃型凝結(jié)素受體基因中的抑制性基因，與禽類先天免疫性能關(guān)系密切。本研究以NCBI中GallusgallusBNK基因序列為參考，利用MEGA6軟件對24個雞品種的BNK基因進(jìn)行序列比較分析，篩選出外顯子和內(nèi)含子上的SNPs位點(diǎn)、Indels以及氨基酸變化，并對24個雞品種進(jìn)行系統(tǒng)聚類。研究發(fā)現(xiàn)，SNPs位點(diǎn)大多發(fā)生在Exon3、Exon5和Exon6上，且多為錯義突變。內(nèi)含子上的SNPs位點(diǎn)大多發(fā)生在Intron1、Intron2和Intron4上。插入缺失發(fā)生在Intron2、Intron4和Exon5上，并且大多數(shù)品種Indels序列基本一致，國內(nèi)外雞品種之間并無顯著差異。系統(tǒng)聚類分析將這些雞品種分為3類，狼山雞、羅斯雞、隱性白羽肉雞、茶花雞和如皋黃雞為一類；其次，雪山雞、安卡雞、斗雞和蕭山雞聚為一類；固始雞單獨(dú)為一類，表明固始雞的BNK基因?yàn)閱为?dú)起源。綜上表明，BNK基因在我國地方雞品種中具有豐富的遺傳多樣性，與不同雞品種的先天免疫性能存在關(guān)聯(lián)，這為家禽的免疫遺傳學(xué)和抗病育種提供了參考依據(jù)。

雞；BNK基因；抗病性；SNPs；Indels

BNK(Blec2)基因?yàn)镃型凝結(jié)素受體基因中的抑制性基因，在胞內(nèi)區(qū)含有一個單獨(dú)的ITSM結(jié)構(gòu)域，在淋巴組織中大量表達(dá)，而且是唯一證明表達(dá)于自然殺傷(natural killer，NK)細(xì)胞的C型凝結(jié)素受體蛋白基因[1]。雞是非哺乳動物中禽類的代表動物，但是目前對雞NK細(xì)胞的研究并不多，而雞C型凝結(jié)素受體是最早發(fā)現(xiàn)的NK細(xì)胞受體，且C型凝結(jié)素在免疫應(yīng)答中具有多種功能，起非常重要的作用[2-4]。研究表明，雞C型凝結(jié)素受體與哺乳動物C型凝結(jié)素受體一樣，分為抑制性受體和活化性受體，存在于3個不同的區(qū)域，位于16號染色體上的主要相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)(B基因座的B-F/B-L區(qū)域)便為其中一個[5-6]。研究發(fā)現(xiàn)，在類似于MHC區(qū)域的Rfp-Y區(qū)域有與Blec基因類似的凝集素類似物[7-8]。BNK基因與哺乳動物NKC(natural killer gene complex，自然殺傷基因復(fù)合體)中的基因，特別是小鼠的Nkrp1和C1r以及人類的NKR-P1 和LLT1， 從序列的結(jié)構(gòu)、序列特征、基因起始、組織分布和對刺激的反應(yīng)等都非常相似[9]。研究表明，BNK基因在NK細(xì)胞中的發(fā)現(xiàn)揭示了其可能在疾病的遺傳抗性中扮演重要角色。但至今尚無關(guān)于雞BNK基因的研究報道。本研究以24個雞品種作為研究素材，利用目標(biāo)序列捕獲方法對BNK基因進(jìn)行SNPs、Indels分析，為探明不同雞品種的抗病性差異以及利用該基因進(jìn)行抗病育種提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

本研究采用24個雞品種，其中仙居雞(XJ)、大骨雞(DG)、茶花雞(CH)、鹿苑雞(LU)、藏雞(ZJ)、白耳雞(BE)、河南斗雞(DJ)、固始雞(GS)、狼山雞(LS)、泰和烏骨雞(WG)、蕭山雞(XS)、北京油雞(BY)這12個地方雞品種均來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院家禽科學(xué)研究所國家地方禽種資源基因庫。另外，羅斯雞(RS)、隱性白羽肉雞(YB)、安卡雞(AK)、來航雞(LH)、如皋黃雞(RG)、雪山雞(XC)、文昌雞(WC)、太湖雞(TH)、溧陽雞(LY)、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞(LD)、廣西黃雞(GXH)以及青腳麻雞(QM)這12個雞品種均來自揚(yáng)州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳資源實(shí)驗(yàn)室的禽種資源基因庫。

利用翅靜脈采血法采集2 mL血液，每個品種10個樣本，放入具有肝素鈉的采血管中，加入裂解液，4 ℃保存，用苯酚和氯仿法從血液中提取DNA。將每個品種的DNA混合樣品送深圳華大基因公司進(jìn)行目標(biāo)序列捕獲測序，然后利用MEGA6軟件與從GenBank中檢索參考基因的編碼cDNA進(jìn)行核苷酸序列比較，分析核苷酸突變位點(diǎn)和插入缺失位點(diǎn)以及氨基酸變化情況。各個雞品種的外顯子和內(nèi)含子的起始位點(diǎn)、終止位點(diǎn)和參考序列一致。

2 結(jié)果與分析

2.1不同雞品種BNK基因的SNPs位點(diǎn)和Indels位點(diǎn)分析

為了探究我國不同地方雞品種的BNK基因，查閱NCBI上Gallusgallus(Gene ID:693259)BNK基因的編碼cDNA序列，并以此為參考。通過對比可知，在24個雞品種中BNK基因外顯子上有18個SNPs和18個Indels位點(diǎn)，內(nèi)含子上有48個SNPs和41個Indels位點(diǎn)(表1)。

對24個雞品種外顯子進(jìn)行SNPs位點(diǎn)分析，BNK基因的SNPs位點(diǎn)主要位于Exon6上(表2)。河南斗雞、固始雞、泰和烏骨雞、蕭山雞、鹿苑雞、安卡雞、青腳麻雞和溧陽雞的突變位點(diǎn)一樣，均發(fā)生在Exon6上，且導(dǎo)致氨基酸錯義突變。太湖雞、廣西黃雞和來航雞的突變位點(diǎn)一致，位于Exon5上，為錯義突變。大骨雞和雪山雞的突變均在Exon3上。青腳麻雞有2個SNPs位點(diǎn)，固始雞有5個SNPs位點(diǎn)，其他的雞品種無SNPs位點(diǎn)。Exon2上的SNPs位點(diǎn)只在固始雞和青腳麻雞中發(fā)現(xiàn)，且氨基酸序列為同義突變。國外雞品種中羅斯和隱性白羽肉雞均沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)。

對不同雞品種BNK基因內(nèi)含子做SNPs位點(diǎn)分析(表3)。內(nèi)含子上的SNPs位點(diǎn)主要發(fā)生在Intron1、Intron2和Intron4上，其中包括河南斗雞、鹿苑雞、安卡雞、青腳麻雞、溧陽雞、來航雞等，而固始雞內(nèi)含子上有9個SNPs位點(diǎn)，在所有雞品種中最多，位于Intron1、Intron2、Intron3、Intron4和Intron5上。其他雞品種，包括羅斯雞和隱性白羽肉雞均沒有發(fā)現(xiàn)SNPs位點(diǎn)。

表1BNK基因外顯子和內(nèi)含子上SNPs分布情況

Table1Distribution of SNPs in exons and introns ofBNKgene

位置Sites范圍Range長度Size/bpSNPs個數(shù)NumbersofSNPs百分比Percentage/%外顯子1Exon1122774～1228467300外顯子2Exon2123605～123688842238外顯子3Exon3124069～1242031353222外顯子4Exon4124280～1244341532131外顯子5Exon5124964～1250671043288外顯子6Exon6125140～1252661278630內(nèi)含子1Intron1122846～12360576015197內(nèi)含子2Intron2123688～12406938213340內(nèi)含子3Intron3124203～124280781128內(nèi)含子4Intron4124434～12496453117320內(nèi)含子5Intron5125067～125140742270

百分比(%)為每個外顯子、內(nèi)含子上的SNPs個數(shù)占各自長度的比例。

Percentage (%) is the proportion of SNPs to the introns and exons， respectively.

表2不同雞品種BNK基因外顯子上SNPs位點(diǎn)分布

Table2Distribution of SNPs inBNKgene of different breeds

雞品種Chickenbreeds外顯子ExonSNPs氨基酸Aminoacid固始雞(GS)2123682A/G—固始雞(GS)3124149A/GQ/R固始雞(GS)4124340G/AG/S固始雞(GS)4124358A/GR/G固始雞(GS)6125231A/CK/Q雪山雞(XC)3124164T/CV/A大骨雞(DG)3124164T/CV/A安卡雞(AK)6125264T/CK/Q青腳麻雞(QM)2123682A/G—青腳麻雞(QM)6125231A/CK/Q太湖雞(TH)5125037T/GL/W廣西黃雞(GXH)5125037T/GL/W來航雞(LH)5125037T/GL/W河南斗雞(DJ)6125231A/CK/Q泰和烏骨雞(WG)6125231A/CK/Q蕭山雞(XS)6125231A/CK/Q鹿苑雞(LU)6125231A/CK/Q溧陽雞(LY)6125231A/CK/Q

“/”前的表示突變前的堿基或氨基酸，“/”后的表示突變后的堿基或氨基酸；—表示未發(fā)生變化，數(shù)字表示發(fā)生突變的位點(diǎn)。表3同。

The base or amino acid before mutation were before “/”， the base or amino acid after mutation were after “/”;-indicated no change， Numbers indicated the site of the mutation. The same as Table 3.

在不同雞品種BNK基因的Indels分布中，國內(nèi)外雞品種之間并無顯著差異。在Intron2上，與參考序列相比，除了鹿苑雞和安卡雞未發(fā)生變化，其他雞品種均在123 825～123 833位點(diǎn)上發(fā)生缺失，缺失序列為GCACTCAGT。同時在Intron4上，除了來航雞、文昌雞、安卡雞、泰和烏骨雞和蕭山雞未發(fā)生變化，其他雞品種均在124 440～124 442位點(diǎn)上發(fā)生CAT序列的缺失。對于Exon5，除了狼山雞、固始雞、東鄉(xiāng)綠殼蛋雞、廣西黃雞、來航雞和仙居雞未發(fā)生變化，其他雞品種均在124 992～124 998位點(diǎn)上發(fā)生AGATGCA序列的插入。

表3不同雞品種BNK基因內(nèi)含子上SNPs位點(diǎn)分布

Table3Distribution of SNPs in introns ofBNKgene in different breeds

雞品種Chickenbreeds內(nèi)含子IntronSNPs河南斗雞(DJ)1123585G/A河南斗雞(DJ)2123988A/G河南斗雞(DJ)4124505T/C河南斗雞(DJ)4124832A/G河南斗雞(DJ)4124883A/T如皋黃雞(RG)1123585G/A文昌雞(WC)1123585G/A白耳雞(BE)1123585G/A固始雞(GS)1123585G/A固始雞(GS)2123936A/G固始雞(GS)2123988A/G固始雞(GS)3124216T/C固始雞(GS)4124505T/C固始雞(GS)4124690G/A固始雞(GS)4124883A/T固始雞(GS)5125151A/G固始雞(GS)5125159C/T泰和烏骨雞(WG)1123585G/A泰和烏骨雞(WG)2123988A/G泰和烏骨雞(WG)4124832A/G泰和烏骨雞(WG)4124883A/T雪山雞(XC)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T蕭山雞(XS)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T鹿苑雞(LU)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T安卡雞(AK)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T青腳麻雞(QM)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T太湖雞(TH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T溧陽雞(LY)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T廣西黃雞(GXH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T來航雞(LH)1，2，4123585G/A，123988A/G，124883A/T

BNK基因的插入缺失發(fā)生在Intron2、Intron4和Exon5上。且大多數(shù)雞品種Indels序列基本一致，

表4不同雞品種BNK基因的Indels分布

Table4Indels distribution ofBNKgene in different breeds

雞品種Chickenbreeds內(nèi)含子2 Intron2起始位點(diǎn)Initiationsites插入缺失Indel內(nèi)含子4 Intron4起始位點(diǎn)Initiationsites插入缺失Indel外顯子5 Exon5起始位點(diǎn)Initiationsites插入缺失IndelRS123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALS123825D/GCACTCAGT124440D/CATDJ123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCARG123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAGS123825D/GCACTCAGT124440D/CATZJ123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAWG123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAXC123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAXS123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAYB123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCACH123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALU124440D/CAT124992I/AGATGCAAK124992I/AGATGCABY123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCADG123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCAWC123825D/GCACTCAGT124992I/AGATGCAQM123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCATH123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALY123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCALD123825D/GCACTCAGT124440D/CATGXH123825D/GCACTCAGT124440D/CATLH123825D/GCACTCAGTXJ123825D/GCACTCAGT124440D/CATBE123825D/GCACTCAGT124440D/CAT124992I/AGATGCA

D和I分別表示堿基缺失和插入，“/”后面表示缺失和插入的序列。

D and I are base deletions and insertions， “/” after that are the deletions and insertions sequence.

2.2 不同雞品種BNK基因系統(tǒng)聚類分析

將不同雞品種的BNK基因用MEGA6軟件構(gòu)建UPGMA進(jìn)化樹。從圖1中可以看出，24個雞品種大致分為3類，狼山雞、羅斯雞、隱性白羽肉雞等為一類；其次，雪山雞、安卡雞、斗雞等聚為一類；固始雞單獨(dú)為一類，表明固始雞BNK基因?yàn)閱为?dú)起源。我國地方雞品種中BNK基因具有豐富的遺傳多樣性，不同雞品種的先天免疫性能存在顯著差異。

圖1 不同雞品種UPGMA進(jìn)化樹分析Fig.1 UPGMA phylogenetic tree analysis of different breeds

3 討論

MHC長期以來被認(rèn)為是識別對疾病易感和耐受的免疫反應(yīng)系統(tǒng)，尤其與MD(Marek’s disease，馬立克氏病)密切相關(guān)。但是目前對BNK基因的功能尚不清楚。有假說認(rèn)為BNK受體以單倍型特異方式識別優(yōu)勢表達(dá)的MHC I類分子，進(jìn)而解釋不同MHC單倍型雞對MD的抗性[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，BNK基因在不同品種之間存在著多處SNPs位點(diǎn)和Indels位點(diǎn)，外顯子發(fā)生SNPs位點(diǎn)有18個，內(nèi)含子發(fā)生SNPs位點(diǎn)有48個，外顯子中除了Exon2上的為同義突變，其他均為錯義突變。國外雞品種的遺傳變異均可在我國地方雞品種中找到，例如安卡雞突變位點(diǎn)均發(fā)生在Exon6上，與此類似的品種有：河南斗雞、蕭山雞、鹿苑雞、溧陽雞等。并且從聚類分析中可以看出，蕭山雞、鹿苑雞和溧陽雞分為一類，且均分布在江浙地區(qū)，抗病性強(qiáng)。吳信生[13]利用微衛(wèi)星技術(shù)分析地方雞品種間親緣關(guān)系時得出，鹿苑雞和蕭山雞分為一類，白耳雞、大骨雞和狼山雞聚為一類，固始雞單獨(dú)為一類，這與本研究結(jié)果基本一致。對于蕭山雞和鹿苑雞聚為一類這一分析結(jié)果，張學(xué)余等[14]利用29個微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建的4類聚類圖中，蕭山雞和鹿苑雞聚為一類。總體來看，在外顯子上發(fā)生SNPs的13個雞品種中有8個發(fā)生在Exon6，并均為A/C的突變。所以Exon6在BNK基因上起重要作用，擁有豐富的多態(tài)性。羅斯雞、隱性白羽肉雞無論在外顯子還是內(nèi)含子均無SNPs位點(diǎn)，這可能是我國地方品種與外來品種抗病力存在差異的原因；羅斯雞與隱性白羽肉雞作為現(xiàn)代主要肉雞品種，具有生長速度快，飼料報酬高的特點(diǎn)，但同時也存在抗病力尤其是先天免疫性能相對較差的問題，BNK基因上SNPs位點(diǎn)的缺失可能是影響因素之一。相對國外雞品種，我國地方雞品種的BNK基因遺傳變異更加豐富，真實(shí)反映了我國地方雞品種先天免疫基因資源豐富、適應(yīng)性強(qiáng)、耐粗飼的特點(diǎn)。

研究表明，基因中內(nèi)含子雖然不參與編碼蛋白質(zhì)，但是內(nèi)含子對于編碼序列和蛋白質(zhì)的調(diào)控都有重要的作用[15]。在本研究中，24個雞品種中BNK基因的內(nèi)含子發(fā)生SNPs位點(diǎn)有48個，Indels位點(diǎn)41個。安卡雞、蕭山雞以及鹿苑雞在Intron1、Intron2、Intron4上均具有SNPs位點(diǎn)，并且抗病力強(qiáng)，這與王存波等[16]的研究一致。從研究結(jié)果可知，北京油雞和狼山雞均無SNPs位點(diǎn)，并且抗病性弱，這與張嬌等[17]的研究結(jié)果一致。在系統(tǒng)聚類中，24個雞品種分為3大類，但不同品種間置信度水平并不高，這是由于該基因變異度高導(dǎo)致不同雞品種之間的同源性低，究其原因可能與我國地方多種生態(tài)類型、種群演變歷史以及豐富的遺傳多樣性有關(guān)，例如觀賞性的河南斗雞、藥用的烏骨雞[18-19]。這也可能與地理位置和當(dāng)?shù)氐拈L期歷史文化有關(guān)，進(jìn)一步表明BNK基因能夠有效反映我國地方雞品種的多源性進(jìn)化及豐富的遺傳多樣性。從聚類分析結(jié)果可知，固始雞為單獨(dú)一類，并且與其他雞品種相比，固始雞的SNPs位點(diǎn)最多，表現(xiàn)出最為豐富的遺傳多樣性。特別是在Exon2和Intron3相關(guān)序列上，是其他雞品種缺少的變異，這可能與悠久的馴化歷史以及良好的資源保護(hù)有關(guān)。鄧雪娟等[20]的研究表明，通過微衛(wèi)星技術(shù)分析得知，固始雞具有較高的群體雜合度，遺傳多樣性較高。同時根據(jù)文鳳云等[21]報道，固始雞具有耐粗飼、先天免疫性能好、抗病力強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美等特點(diǎn)，是我國著名的肉蛋兼用型地方優(yōu)良雞品種，這可能與固始雞中BNK基因豐富的遺傳多樣性有關(guān)。但是這些位點(diǎn)是否與不同雞品種之間的先天免疫性能差異存在關(guān)聯(lián)還需要進(jìn)一步研究。

綜上，BNK基因在國內(nèi)外雞品種中存在多種遺傳變異，其中SNPs位點(diǎn)有66個，Indels位點(diǎn)59個，尤其在我國地方雞品種中表現(xiàn)出極其豐富的遺傳多樣性，這對研究我國地方雞品種優(yōu)良的先天免疫性能的遺傳機(jī)制以及開發(fā)、利用這些豐富的免疫基因資源，從而為提高雞的抗病性與實(shí)現(xiàn)無抗養(yǎng)殖提供了基礎(chǔ)資料。

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ComparativeanalysisofBNKgenesequencesindifferentchickenbreeds

CHEN Ying， ZHENG Shenghan， KONG Linglin， ZHU Pengfei， WU Yun， GUO Qixin， CHEN Guohong， CHANG Guobin*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，Yangzhou225009，China)

TheBNK(C-type lectin-like receptor 2) gene is an inhibitory receptor expressed on natural killer cells， which is closely related to the innate immune function of poultry. In this study， according to NCBI 5.0Gallusgallus， we used MEGA6 software to analyzeBNKgene in 24 types of chickens. We found several SNPs， Indels and amino acids on exons and introns. In addition， we performed the clustering in 24 chickens via MEGA6. The results showed that most of the SNPs sites occurred on Exon3， Exon5 and Exon6， and most of them were missense mutations. The SNPs sites mostly occurred on Intron1， Intron2 and Intron4. And then the Indels mostly occurred on Intron2， Intron4 and Exon5. There was no significant difference between domestic and foreign chicken breeds， and most of the Indels sequences were basically the same. By cluster analysis the chickens were divided into three groups， Langshan chicken， Ross chicken， Recessive white chicken， Chahua chicken and Rugao yellow chicken as a class; Xueshan chicken， Anka chicken， Dou chicken and Xiaoshan chicken as a class; Gushi chicken as a class. According to clustering analysis，BNKgene of Gushi chicken was a single origin. In conclusion，BNKgene has abundant genetic diversity in Chinese chicken breeds and there was close relation in innate immunity with different chicken breeds， which provide reference for immune genetics and disease resistance breeding of poultry.

chicken;BNKgene; disease resistance; SNPs; Indels

S831.2

A

1004-1524(2017)10-1648-06

（責(zé)任編輯張 韻)