袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，楊萍萍

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安271018)

浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(10): 1642-1647

袁朋，朱瑞良，崔晨晨，等. 禽波氏桿菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位預(yù)測(cè)[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，29(10)： 1642-1647.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.10.07

2017-03-23

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31602067，31272595)；山東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(ZR2014CM044)；山東省“雙一流”獎(jiǎng)補(bǔ)資金

袁朋 (1985—)，男，山東德州人，碩士研究生，實(shí)驗(yàn)師，研究方向?yàn)轭A(yù)防獸醫(yī)學(xué)。E-mail: yp8511@163.com

*通信作者，楊萍萍，E-mail: ppyang@sdau.edu.cn

禽波氏桿菌HagA蛋白基因的序列分析及抗原表位預(yù)測(cè)

袁 朋，朱瑞良，崔晨晨，楊萍萍*

(山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，山東 泰安271018)

試驗(yàn)旨在對(duì)禽波氏桿菌的血凝素HagA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行預(yù)測(cè)，探討以血凝素HagA蛋白制作單克隆抗體的可能性。首先對(duì)禽波氏桿菌的血凝素hagA基因進(jìn)行了PCR擴(kuò)增以及序列測(cè)定，利用生物信息學(xué)的相關(guān)軟件與分析方法，對(duì)血凝素HagA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以及B細(xì)胞抗原表位進(jìn)行分析預(yù)測(cè)。經(jīng)綜合分析表明，禽波氏桿菌的HagA蛋白氨基酸序列中存在7個(gè)B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)抗原表位區(qū)域，6個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。研究結(jié)果為進(jìn)一步分析禽波氏桿菌HagA蛋白的生物學(xué)功能、制備單抗和研制疫苗等奠定了基礎(chǔ)。

禽波氏桿菌；HagA蛋白；二級(jí)結(jié)構(gòu)；B細(xì)胞抗原表位預(yù)測(cè)

在生物信息學(xué)與計(jì)算機(jī)技術(shù)日益發(fā)展的今天，越來越多的人利用生物信息學(xué)相關(guān)軟件和網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器來預(yù)測(cè)功能蛋白的結(jié)構(gòu)與抗原表位信息，既節(jié)約實(shí)驗(yàn)室工作量，又可避免在傳統(tǒng)表位研究中的盲目性[5-7]。本研究對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的禽波氏桿菌菌株的hagA基因擴(kuò)增測(cè)序，運(yùn)用計(jì)算機(jī)軟件與生物信息學(xué)方法來分析HagA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性，從而對(duì)血凝素HagA蛋白進(jìn)行初步的探索，皆在為進(jìn)一步研究HagA蛋白的功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

禽波氏桿菌(LL、XT)株，由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.2 載體與試劑

PMD18-TVector、細(xì)菌DNA提取試劑盒、PCR反應(yīng)試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程公司。膠回收試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司。

1.3 引物

根據(jù)GenBank已發(fā)表的禽波氏桿菌197N菌株的序列，BA3062538-BA3064682之間的序列為hagA基因序列，通過DNAstar軟件找到hagA基因序列的開放閱讀框，確定BA3062685至BA3064364之間序列為HagA蛋白的基因序列。利用Premier5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)1對(duì)引物對(duì)hagA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增。引物序列如下：

干部教育培訓(xùn)是干部隊(duì)伍建設(shè)的先導(dǎo)性、基礎(chǔ)性和戰(zhàn)略性工程，互聯(lián)網(wǎng)的廣泛應(yīng)用為干部教育提供了新的平臺(tái)?！?018－2022 年全國(guó)干部教育培訓(xùn)規(guī)劃》指出要統(tǒng)籌整合網(wǎng)絡(luò)培訓(xùn)資源，建設(shè)兼容、開放、共享、規(guī)范的全國(guó)干部網(wǎng)絡(luò)培訓(xùn)體系。自2012 年中國(guó)干部網(wǎng)絡(luò)學(xué)院開通，到十九大以來干部網(wǎng)絡(luò)教育步入新時(shí)代，干部網(wǎng)絡(luò)教育以其能夠跨越時(shí)空局限的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)成為干部教育領(lǐng)域不可或缺的一部分。

HagA-F: 5′-ATGGGGCTTTTGATGTGTTATTCG-3′

HagA-R: 5′-TTAGAACTGAGCTTGCAGCGTCA-3′

引物序列由華大基因有限公司合成，擴(kuò)增基因產(chǎn)物片段大小約為1 680 bp。

1.4 禽波氏桿菌hagA基因克隆與測(cè)序

利用細(xì)菌DNA提取試劑盒進(jìn)行禽波氏桿菌基因組DNA提取，以提取DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)條件如下：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。電泳鑒定并回收目的DNA，連接pMD18-T載體，并轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，接種到含有氨芐青霉素(100 mg·L-1)的LB平板上進(jìn)行培養(yǎng)，12 h后挑取陽(yáng)性克隆菌落至LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)12 h后提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR鑒定陽(yáng)性后送華大基因有限公司測(cè)序。

1.5 禽波氏桿菌HagA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將完成測(cè)序DNA序列利用DNAStar軟件翻譯為氨基酸序列，利用EXPASY網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上的SOPMA與GOR方法分析預(yù)測(cè)禽波氏桿菌HagA蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)[8-9]。

1.6 禽波氏桿菌HagA蛋白B細(xì)胞表位預(yù)測(cè)

選取3種主要參數(shù)進(jìn)行分別預(yù)測(cè)，包括采用Kyle Doolittle的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)預(yù)測(cè)親水性參數(shù)(Hydrophilicity)[10]、用Jameson-Wolf方法預(yù)測(cè)抗原指數(shù)(Antigenicity index)[11]、以及用Emini方法預(yù)測(cè)可及性參數(shù)(Accessibility)[12]，比較各個(gè)參數(shù)的預(yù)測(cè)結(jié)果，進(jìn)行綜合分析，然后確定HagA蛋白的B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 禽波氏桿菌hagA基因的PCR擴(kuò)增

禽波氏桿菌hagA基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠電泳中顯示約為1 680 bp，片段大小與預(yù)期相符，電泳結(jié)果見圖1。

2.2禽波氏桿菌HagA蛋白理化性質(zhì)及特定位點(diǎn)分析

M， DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 1， 陰性對(duì)照； 2， 禽波氏桿菌(LL株)HagA； 3， 禽波氏桿菌(XT株)M， DL2000 DNA marker; 1， Negative control; 2， Bordetella avium HagA(LL strain); 3， Bordetella avium HagA(XT strain)圖1 hagA基因PCR的擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis analysis of PCR products for hagA gene

禽波氏桿菌hagA基因測(cè)序結(jié)果經(jīng)DNAstar軟件翻譯為蛋白質(zhì)序列表明LL與XT分離株的氨基酸同源性為100%，由559個(gè)氨基酸序列組成。與197N菌株hagA基因序列核苷酸同源性為89.2%。利用ProtParam分析軟件對(duì)HagA蛋白的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)分析，分析結(jié)果顯示HagA蛋白的原子總數(shù)為8 652，分子式為C2754H4307N751O831S9。理論pI值為9.30，相對(duì)分子質(zhì)量為61 522.56 u。N末端序列為Met(蛋氨酸)，酸性氨基酸總數(shù)(Asp+Glu)為43，堿性氨基酸總數(shù)(Arg+Lys)為53，不穩(wěn)定系數(shù)為35.24，屬于穩(wěn)定性蛋白。特定位點(diǎn)分析結(jié)果見表1。

2.3 禽波氏桿菌HagA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)

利用EXPASY網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器上的SOPMA與GOR方法進(jìn)行HagA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，預(yù)測(cè)結(jié)果見圖2所示。兩種方法對(duì)HagA蛋白的預(yù)測(cè)結(jié)果基本相同，均表明HagA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中柔性區(qū)域主要為無規(guī)轉(zhuǎn)曲，且無規(guī)轉(zhuǎn)曲有13個(gè)肽段位置，詳見表2。

2.4禽波氏桿菌HagA蛋白B淋巴細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)

首先應(yīng)用KyleDoolittle的方法對(duì)HagA蛋白進(jìn)行親水性預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，HagA蛋白的親水性較大的區(qū)域有15個(gè)區(qū)段，再應(yīng)用Jameson wolf方案預(yù)測(cè)HagA蛋白的抗原指數(shù)較高的區(qū)段，結(jié)果顯示有17個(gè)區(qū)段的抗原指數(shù)較高，最后應(yīng)用Eminni方案預(yù)測(cè)HagA蛋白表面的可及性參數(shù)，結(jié)果顯示有11個(gè)區(qū)段出現(xiàn)在蛋白表面的可能性較大，而且表面可及性區(qū)段都位于HagA蛋白的親水性較高的區(qū)域。結(jié)果見圖3和表2所示。

不同方法預(yù)測(cè)的抗原表位的個(gè)數(shù)和出現(xiàn)的位置略有不同，但不同的預(yù)測(cè)方法一致表明在第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位這7個(gè)區(qū)域B淋巴細(xì)胞抗原表位的存在性較高。

表1禽波氏桿菌HagA蛋白功能區(qū)及作用位點(diǎn)

Table1The functional domains and activity sites of HagA protein

名稱Name氨基酸序列及結(jié)合位點(diǎn)Aminoacidsequenceandbindingsites糖基化位點(diǎn)N?glycosylationsiteNRTQ(67) NLSR(130) NESL(267) NNSR(357) NVSY(383) NVSS(475)酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(diǎn)CaseinkinaseⅡphosphorylationsiteSSID(89) SRDD(132) SVVD(155) SFTE(226) SNGD(406) THAE(416)蛋白激酶C磷酸化位點(diǎn)ProteinkinaseCphosphorylationsiteSPR(10) TER(73) TYK(102) TPK(109) SYK(211) TLK(321) TRK(325)SYR(374) SYR(385) SGR(544)N?肉豆蔻酰化位點(diǎn)N?myristoylationsiteGLLMCY(2) GIGLAK(17) GQTQSI(45) GNEINR(51) GVVNTV(98) GLSYTG(271) GNMATV(276) GVKSNF(334) GNTLGS(344) GSVGAL(348) GI?HRGW(488) GLDYGR(504) GLNIAM(521) GVFLTL(550)依賴于cAMP和cGMP的蛋白磷酸化激酶位點(diǎn)cAMP?andcGMP?dependentproteinkinasephosphorylationsiteRRSS(387)

表2多種預(yù)測(cè)方法對(duì)禽波氏桿菌HagA蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測(cè)結(jié)果

Table2Epitopes predicted by various methods inB.aviumHagA protein

預(yù)測(cè)方法Methods肽段位置Results(Peptidesequence)二級(jí)結(jié)構(gòu)Secondarystructure42?48、84?114、127?133、147?163、176?188、204?212、242?255、271?310、327?349、356?368、381?389、418?427、434?491、497?517、514?550親水性Hydrophilicity43?84、101?115、122?141、155?166、205?218、228?234、243?254、278?288、307?318、322?334、355?408、417?442表面可及性Surfaceprobability6?9、59?82、103?112、124?136、158?163、204?215、229?233、243?251、307?316、322?331、355?392抗原性Antigenicity6?12、44?86、102?115、122?140、155?164、203?222、228?236、241?251、278?293、308?316、321?333、342?352、356?370、375?392、415?477、504?512、542?552

SOPMA與GOR4為兩種不同的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法。h， α-螺旋；e， β-片層；c， 無規(guī)卷曲；t， β-轉(zhuǎn)角SOPMA and GOR4 indicated different prediction methods. h， α-helix; e， β-sheet; c， Random coils; t， β-turn圖2 B. avium HagA 二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.2 Secondary structure prediction of B. avium HagA

圖3 B. avium HagA蛋白親水性、抗原指數(shù)及其表面可能性分析Fig.3 Analysis of hydrophilicity plot， antigenic index and surface probability of B. avium HagA protein

3 討論

禽波氏桿菌已經(jīng)成為威脅養(yǎng)禽業(yè)的一種廣泛存在的細(xì)菌，由于其基因組比較大，編碼的蛋白也較為復(fù)雜[13-15]。目前針對(duì)其外膜蛋白OmpA蛋白研究比較多，而對(duì)HagA蛋白國(guó)內(nèi)鮮有報(bào)道，有關(guān)文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道作為一種重要的毒力因子，HagA血凝素蛋白定位于菌膜表面是波氏桿菌特有表面結(jié)構(gòu)蛋白，其是否具有良好的抗原性需進(jìn)一步探索。本試驗(yàn)對(duì)本實(shí)驗(yàn)室分離保存的禽波氏桿菌(LL、XT)菌株進(jìn)行HagA基因克隆測(cè)序，結(jié)果表明LL與XT分離株的氨基酸同源性為100%。以此為基礎(chǔ)，針對(duì)HagA蛋白的氨基酸序列利用生物學(xué)相關(guān)軟件預(yù)測(cè)其B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位，為研究HagA蛋白的抗原性以及功能提供理論基礎(chǔ)。

本研究首先運(yùn)用ProtParam分析軟件對(duì)禽波氏桿菌HagA蛋白的氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)及特定位點(diǎn)進(jìn)行分析，對(duì)HagA蛋白有了基本了解。然后針對(duì)蛋白質(zhì)抗原決定簇的預(yù)測(cè)，采用多種單參數(shù)預(yù)測(cè)模型和相關(guān)分析軟件結(jié)合的方法進(jìn)行，多種參數(shù)的綜合考慮避免了單參數(shù)預(yù)測(cè)的局限性，提高了準(zhǔn)確性[16]。應(yīng)用生物學(xué)相關(guān)軟件對(duì)HagA蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性三種尤為重要的參數(shù)進(jìn)行預(yù)測(cè)。其中對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)采用SOPMA、GOR4兩種方法結(jié)合的方式進(jìn)行，兩種方法預(yù)測(cè)的結(jié)果相差不多，二級(jí)結(jié)構(gòu)主要以無規(guī)轉(zhuǎn)曲和α-螺旋為主，有少量的β-片層，SOPMA預(yù)測(cè)的結(jié)果中有少量的β-轉(zhuǎn)角。親水性、表面可及性以及抗原性參數(shù)分別按照KyleDoolittle、Eminni、Jameson wolf的方法進(jìn)行預(yù)測(cè)，多種預(yù)測(cè)方法進(jìn)行綜合分析，結(jié)果顯示位于氨基酸序列中第103～112位、第127～133位、第158～163位、第205～212位、第243～251位、第327～331位、第356～368位，這7個(gè)區(qū)段為B細(xì)胞抗原表位優(yōu)勢(shì)區(qū)域。

本研究首次針對(duì)禽波氏桿菌HagA蛋白利用生物學(xué)分析軟件進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)與B細(xì)胞抗原優(yōu)勢(shì)表位的預(yù)測(cè)，為進(jìn)一步探索HagA蛋白的抗原性以及其他生物學(xué)特性提供了理論依據(jù)，同時(shí)也為用HagA蛋白研制單抗以及對(duì)其免疫機(jī)理的研究提供了參考。

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SequencingandB-cellepitopespredictionofBordetellaaviumHagAprotein

YUAN Peng， ZHU Ruiliang， CUI Chenchen, YANG Pingping*

(CollegeofAnimalScienceandVeterinaryMedicine，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，China)

This article is carried out to predict the secondary structure ofBordetellaaviumHagA and the dominant epitope of B cell antigen， in order to discuss the possibility of HagA protein in the production of monoclonal antibodies. In this study，hagAgene ofB.aviumwas amplified， cloned and sequenced. The secondary structure and B cell epitopes of the HagA protein ofB.aviumwere analyzed and predicted subsequently by using bioinformatics software. The results showed that theB.aviumHagA protein was supposed to include 7 potential antigen epitopes and 6 potential glycosylated sites. The results provide a theoretical basis for the further study of immune mechanisms， monoclonal antibodies preparation and epitope vaccine design.

Bordetellaavium; HagA; secondary structure; B-cell epitope prediction

S858.3

A

1004-1524(2017)10-1642-06

（責(zé)任編輯張 韻)