單長林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316021）

RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應(yīng)用

單長林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316021）

利用玉米褪綠斑駁病毒外殼蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)序列設(shè)計引物，通過優(yōu)化反應(yīng)溫度、引物濃度、反應(yīng)時間以及評價環(huán)引物效果，建立了檢測玉米褪綠斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增 （RT-LAMP） 方法，并與RT-PCR方法比較。結(jié)果表明，RT-LAMP在64℃等溫條件下反應(yīng)45 min，最低可檢測到280 fg的目的片段，靈敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花葉病毒、玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒、玉米白線花葉病毒及玉米褪綠斑駁病毒等5種病毒為檢測對象，證明該方法針對玉米褪綠斑駁病毒具有很強(qiáng)的特異性。利用RT-LAMP方法對100份模擬病毒感染的玉米種子進(jìn)行檢測，病毒檢出率為100%。

玉米褪綠斑駁病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增方法；RT-PCR；檢測

玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）是侵染玉米的重要病毒，主要通過種子遠(yuǎn)距離傳送等方式傳播［1-3］，可侵染玉米、高粱等多達(dá)15～19種植物［4］，目前主要分布在墨西哥、美國部分地區(qū)、秘魯、阿根廷、法國、希臘、意大利、羅馬尼亞、西班牙、瑞士、澳大利亞、厄瓜多爾、南非、尼日利亞、肯尼亞、埃塞俄比亞、剛果、盧旺達(dá)及泰國等地［5-12］。有研究表明，該病毒既可以單獨(dú)侵染玉米，也可與小麥線條花葉病毒（WSMV）［13］、甘蔗花葉病毒（SCMV）［14-15］、玉米矮花葉病毒（MDMV）［15］復(fù)合侵染，導(dǎo)致玉米致死性壞死病。

2007年我國將MCMV列為進(jìn)境檢疫性有害生物。2010年我國首次從進(jìn)口玉米種子中檢出MCMV［16］，1年之后，Xie L等在我國云南的玉米植株上發(fā)現(xiàn)了MCMV［17］，到2015年，Deng等又在臺灣省甜玉米上檢測出MCMV［18］。饒玉燕等通過構(gòu)建MCMV損失評判指標(biāo)體系，對其在我國潛在經(jīng)濟(jì)損失作出評估，高達(dá)140.95億元［19］。加強(qiáng)進(jìn)境糧食檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管，防范玉米褪綠斑駁病毒的入侵與擴(kuò)散迫在眉睫。

目前針對MCMV的檢測方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、RT-PCR、實(shí)時熒光RT-PCR方法、表面等離子生物傳感器法等［20-22］。酶聯(lián)免疫法對快速檢測意義重大，但由于包被抗體特異性不強(qiáng)及保存不當(dāng)?shù)仍?，易出現(xiàn)假陽性等問題；實(shí)時熒光RT-PCR技術(shù)，存在需大型儀器設(shè)備支持且運(yùn)行成本高等問題，不利于基層檢測現(xiàn)場推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是由日本學(xué)者Notomi研發(fā)的一種恒溫擴(kuò)增反應(yīng)，可在恒溫條件下1 h內(nèi)完成反應(yīng)，結(jié)果清晰肉眼可辨，反應(yīng)靈敏度高，準(zhǔn)確性和特異性好且不需要大型儀器支持［23］。RT-LAMP 是在 LAMP 基礎(chǔ)上，加入反轉(zhuǎn)錄酶，使反轉(zhuǎn)率和核酸擴(kuò)增同時進(jìn)行，其獨(dú)有的檢測優(yōu)勢迅速得到廣大科研工作者的偏愛，廣泛應(yīng)用于動植物病原微生物檢測［24-26］。

本研究主要利用RT-LAMP技術(shù)，并與RTPCR比較，分析其特異性和靈敏性，建立一種簡便易操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒，為該病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場檢疫等提供更好的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米褪綠斑駁病毒、甘蔗花葉病毒由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)研究所吳建祥教授提供，玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒及玉米白線花葉病毒（MWLMV）陽性質(zhì)控物購自美國Agdia公司。

試劑、儀器：RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技有限公司），PrimeScriptTM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（大連寶生物公司），F(xiàn)luorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit （日本榮研公司）；

LA-320C實(shí)時濁度儀（日本榮研公司），PCR儀（ABI），NANODROP2000分光光度計（Thermo），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計合成 根據(jù)GenBank 發(fā)布的MCMV 外殼蛋白cDNA序列（登錄號分別為 AM490793.1，JQ943666.1，GU594293.1，JF422772.1，AY587605.1），通過 MEGA 6 軟件進(jìn)行比對分析，找出外殼蛋白基因3′端保守序列，以此為模板，使用在線軟件Primer3 Input（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），設(shè)計5條引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列比對結(jié)果及靶序列結(jié)合區(qū)域見圖1。

表1 玉米褪綠斑駁病毒RT-LAMP 檢測引物

圖 1 序列比對分析結(jié)果及各引物在基因組中對應(yīng)的位置

1.2.2 總RNA 提取 取病毒樣品和健康玉米葉片，利用植物總RNA提取試劑盒分別提取RNA，用NANODROP 2000分光光度計測定核酸濃度（表2）與純度，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表 2 測定的幾種病毒的 RNA 濃度

1.2.3 RT-PCR 檢測 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用 Primer Premier 5.0 設(shè)計 RTPCR 引物：F-MCMV：TTATGCCACAAAA CCGCACTGT；R-MCMV：TAGGATTGCTGCT CCACGGT。擴(kuò)增片段大小為190 bp。反應(yīng)體系為 10μL 2×Taq PCR StarMix，1μL 引物F-MCMV / R-MCMV（10 umol/L），1μL模板cDNA，加水至20μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，53℃退火 40 s，72℃延長1 min，進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，1.6 %瓊脂糖凝膠電泳 30 min（100 V），紫外成像檢測。

1.2.4 RT-LAMP 檢測體系的優(yōu)化 基本檢測體系為：12.5μL 反應(yīng)緩沖液 RM，1.0μL 酶溶液EM，1.0μL 熒光目視檢測試劑鈣黃素，1.0μL 模板 RNA，終濃度為 1.6μmol/L的MCMV-FIP/MCMV-BIP和終濃度為0.2μmol/L的MCMV-F3/MCMV-B3，最后加水至25μL。RT-LAMP反應(yīng)條件為 63℃ 1 h，80℃ 5 min。LA-32℃實(shí)時濁度儀檢測濁度變化，并在反應(yīng)結(jié)束后觀察熒光目視染料是否由橙色變?yōu)榫G色。

分別對反應(yīng)溫度、引物濃度設(shè)置不同梯度進(jìn)行優(yōu)化。將反應(yīng)溫度設(shè)置為62、63、64、65℃，保持其他因素不變以篩選出最佳反應(yīng)溫度；再將MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）引物終濃度設(shè)置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225） μmol/L，保持其他因素不變以篩選出最佳引物濃度；最后以（FIP/BIP）∶（LB）∶（F3/B3）=8∶4∶1加入環(huán)引物MCMV-LB以驗(yàn)證環(huán)引物效果。試驗(yàn)中用滅菌水為模板，以基本檢測體系進(jìn)行陰性對照。

1.2.5 RT-LAMP 與 RT-PCR特異性比較 以MCMV、SCMV、MDMV、WSMV和MWLMV的RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP檢測，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時進(jìn)行RT-PCR檢測，凝膠電泳驗(yàn)證。比較分析兩種方法的特異性。

1.2.6 RT-LAMP 與 RT-PCR靈敏度測定 以提取的MCMV RNA為原液，用RNase Free dH2O將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別獲得原液（280 ng/μL）、10倍稀釋液（28 ng/μL）、102倍稀釋液（2.8 ng/μL）、103倍稀釋液（280 pg/μL）、104倍稀釋液（28 pg/μL）、105倍稀釋液（2.8 pg/μL）、106倍稀釋液（280 fg/μL）、107倍稀釋液（28 fg/μL）、108倍稀釋液（2.8 fg/μL）。根據(jù)建立的RT-LAMP 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，凝膠電泳驗(yàn)證。比較分析兩種方法的靈敏性。

1.2.7 RT-LAMP檢測玉米種子樣本的應(yīng)用 選取三葉期玉米幼苗（品種為農(nóng)大108），摩擦接種，15 d后表現(xiàn)典型癥狀，采集新鮮葉片，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集到的葉片與PBS緩沖液按照質(zhì)量比1∶1等比例研磨，紗布過濾獲取病毒液，備用。選取健康玉米種子研磨成粉末，與10倍梯度稀釋病毒液混勻，模擬種子帶毒，作為待測樣本（100個）。利用植物總RNA 提取試劑盒提取模擬待測樣本RNA，同時進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 檢測體系優(yōu)化

2.1.1 最適反應(yīng)溫度的選擇 試驗(yàn)設(shè)62、63、64、65℃4個反應(yīng)溫度梯度，結(jié)果（圖2）顯示，在64℃條件下，反應(yīng)濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 24 min，到達(dá)平臺期（濁度AABs=0.8）僅需要37 min；而65℃則分別需要 26、39 min，62℃需要 33、47 min ，63℃需要35、54 min。因比當(dāng)反應(yīng)溫度為64℃時，反應(yīng)進(jìn)行最為迅速。

圖2 RT-LAMP 不同反應(yīng)溫度試驗(yàn)

2.1.2 引物濃度優(yōu)化 將引物MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）反應(yīng)濃度設(shè)置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225）μmol/L等5個濃度梯度，結(jié)果（圖 3）顯示，在引物濃度為1.8（0.225）μmol/L條件下，反應(yīng)濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 27 min，到達(dá)平臺期（濁度AABs=0.8）只需要39 min，其他濃度條件下到達(dá)檢測限和反應(yīng)平臺期的時間（分別為54、＞60 min，45、57 min，43、53 min，35、54 min）均有所延遲。因此最佳引物濃度為1.8（0.225）μmol/L。

圖3 RT-LAMP 反應(yīng)不同引物濃度試驗(yàn)

圖4 RT-LAMP中環(huán)引物效果試驗(yàn)

2.1.3 環(huán)引物效果 由圖 4可知，未加入環(huán)引物反應(yīng)在27 min 時濁度達(dá)到檢測線（AABs=0.2），且達(dá)到平臺期（AABs=0.8）需要長達(dá)39 min；加入環(huán)引物后，濁度達(dá)到檢測線時間提前到21 min，反應(yīng)進(jìn)行到平臺期所用時間減少6 min。由此可見，環(huán)引物可加速反應(yīng)，效果明顯。

2.1.4 RT-LAMP 檢測體系的確定 經(jīng)過以上對RT-LAMP反應(yīng)溫度、引物濃度及環(huán)引物加入與否等條件的優(yōu)化，確定RT-LAMP檢測體系為：12.5 μL 反應(yīng)緩沖液 RM，1.0 μL 酶溶液EM，1.0 μL 熒光目視檢測試劑鈣黃素，1.0 μL 模板RNA，終濃度為1.8μmol/L的MCMVFIP/MCMV-BIP，終濃度為 0.225μmol/L 的MCMV-F3/MCMV-B3和終濃度為0.45μmol/L的MCMV-LB，最后加水至25 μL。由圖5可知，整個反應(yīng)在45 min內(nèi)可以完成，故RT-LAMP反應(yīng)條件為64℃ 45 min。

2.2 特異性檢測

以 SCMV、WSMV、MDMV、MWLMV及MCMV的RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP檢測，結(jié)果（圖5）顯示僅有MCMV進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)在45 min內(nèi)完成且目視試劑顏色由橙黃色變?yōu)榫G色；RT-PCR反應(yīng)結(jié)果（圖6）顯示僅有以MCMV為模板的反應(yīng)擴(kuò)增出190 bp大小的條帶。由此可知，RT-LAMP與RT-PCR均能特異性檢測MCMV。

圖5 RT-LAMP 特異性驗(yàn)證

圖6 RT-PCR特異性驗(yàn)證

2.3 靈敏度檢測

將 RNA 原液、101、102、103、104、105、106、107、108倍稀釋液分別作為模板，利用所建立的RT-LAMP 反應(yīng)體系和RT-PCR檢測方法進(jìn)行靈敏度比對。從圖7可以看出，RT-PCR 以103倍稀釋液為模板可以檢測到顯著的條帶；以104倍稀釋液為模板，電泳檢測的條帶模糊不清；以105倍稀釋液為模板，電泳沒有檢測到任何條帶。而RT-LAMP 檢測時，如圖8所示，以106稀釋液為模板，濁度仍可以在45 min內(nèi)達(dá)到檢測線（AABs=0.2）。因此，RT-LAMP檢測MCMV的靈敏性比普通RT-PCR至少高100倍，并且RT-LAMP比RT-PCR節(jié)省時間，非常有利于MCMV的檢測應(yīng)用。

圖7 RT-PCR靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果

2.4 RT-LAMP檢測玉米評價

利用植物總RNA提取試劑盒，提取100個模擬帶毒玉米種子樣本RNA，分別進(jìn)行RTLAMP和RT-PCR 檢測。結(jié)果表明，RT-LAMP方法對100個待測樣本的病毒檢出率為100%（100/100）；RT-PCR方法對100個待測樣本的病毒檢出率為78%（78/100），針對部分低病毒濃度模擬樣本，由于靈敏度限制無法檢出。

圖8 RT-LAMP 靈敏度試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

玉米在我國糧食生產(chǎn)中占據(jù)重要的地位，2012—2014年間，我國玉米進(jìn)口總量超過1 000萬t。玉米褪綠斑駁病毒隨進(jìn)口玉米傳入我國的風(fēng)險很高。為更好地服務(wù)口岸檢疫部門，本研究利用RT-LAMP技術(shù)，建立針對MCMV的RTLAMP檢測方法，并與普通RT-PCR方法進(jìn)行比較，證實(shí)RT-LAMP檢測方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)中RT-LAMP反應(yīng)中環(huán)引物的加入使反應(yīng)達(dá)到檢測線（AABs=0.2）及進(jìn)入平臺期（AABs=0.8）時間提前6 min，整個反應(yīng)效率大大提高，確保RT-LAMP 檢測在64℃等溫條件下反應(yīng)進(jìn)行45 min即可完成，比RT-PCR反應(yīng)過程節(jié)省約1 h 。在RT-LAMP反應(yīng)中，利用濁度儀實(shí)時監(jiān)測反應(yīng)過程中濁度變化，將反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)化，更加理性、客觀。通過加入可視試劑鈣黃素，使反應(yīng)結(jié)果一目了然，避免傳統(tǒng)凝膠電泳等過程，簡化整個檢測流程，節(jié)約時間且有效避免反應(yīng)產(chǎn)物交叉污染等問題，且整個反應(yīng)過程不需要大型儀器設(shè)備的支持，方便口岸現(xiàn)場實(shí)驗(yàn)室檢疫。

本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP檢測方法，快速、靈敏且特異性強(qiáng)，能滿足針對玉米褪綠斑駁病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場檢疫的要求。

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Comparison and application of RT-LAMP and RT-PCR methods for MCMV detection

SHAN Chang-lin，ZHOU Yuan，LI Xiao-jun，YANG Sai-jun，SHAO Wei-dong
（Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316021，China）

For the detection of Maize chlorotic mottle virus（MCMV），a reverse-transcription，loop mediated isothermal amplification（ RT-LAMP） assay with high sensitivity and specificity was established. A set of five primers were designed，based on the coat-protein sequence of MCMV. By optimizing the concentration of primers，the best temperature，the suitable reaction time，and loop primer，the RT-LAMP was built by incubation at 64℃ for only 45 min with loop primer. The detection limit of RT-LAMP assay was 280 fg of MCMV RNA，which was 100 times more sensitive than that of RT- PCR assay. High species-specificity of RT- LAMP method was confirmed by the assay of 5 pathogens such as MCMV，SCMV，MDMV， WSMV and MWLMV. In addition，all the simulated samples were detected by LAMP assay，detection rate was 100%.

MCMV；RT-LAMP；RT-PCR；detection

S435.131.4

A

1004-874X（2017）07-0083-08

單長林，周圓，李孝軍，等. RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測玉米褪綠斑駁病毒的比較與應(yīng)用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：83-90.

2017-04-26

舟山市科技計劃項(xiàng)目（2015C31051）

單長林（1987-），男，碩士，助理農(nóng)藝師，E-mail：changlin_shan@163.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）