單長(zhǎng)林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316021）

RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的比較與應(yīng)用

單長(zhǎng)林，周 圓，李孝軍，楊賽軍，邵煒冬

（舟山出入境檢驗(yàn)檢疫局，浙江 舟山 316021）

利用玉米褪綠斑駁病毒外殼蛋白基因?yàn)榘袠?biāo)序列設(shè)計(jì)引物，通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)溫度、引物濃度、反應(yīng)時(shí)間以及評(píng)價(jià)環(huán)引物效果，建立了檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 （RT-LAMP） 方法，并與RT-PCR方法比較。結(jié)果表明，RT-LAMP在64℃等溫條件下反應(yīng)45 min，最低可檢測(cè)到280 fg的目的片段，靈敏度是RT-PCR的100倍。以甘蔗花葉病毒、玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒、玉米白線花葉病毒及玉米褪綠斑駁病毒等5種病毒為檢測(cè)對(duì)象，證明該方法針對(duì)玉米褪綠斑駁病毒具有很強(qiáng)的特異性。利用RT-LAMP方法對(duì)100份模擬病毒感染的玉米種子進(jìn)行檢測(cè)，病毒檢出率為100%。

玉米褪綠斑駁病毒；反轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增方法；RT-PCR；檢測(cè)

玉米褪綠斑駁病毒（MCMV）是侵染玉米的重要病毒，主要通過(guò)種子遠(yuǎn)距離傳送等方式傳播［1-3］，可侵染玉米、高粱等多達(dá)15～19種植物［4］，目前主要分布在墨西哥、美國(guó)部分地區(qū)、秘魯、阿根廷、法國(guó)、希臘、意大利、羅馬尼亞、西班牙、瑞士、澳大利亞、厄瓜多爾、南非、尼日利亞、肯尼亞、埃塞俄比亞、剛果、盧旺達(dá)及泰國(guó)等地［5-12］。有研究表明，該病毒既可以單獨(dú)侵染玉米，也可與小麥線條花葉病毒（WSMV）［13］、甘蔗花葉病毒（SCMV）［14-15］、玉米矮花葉病毒（MDMV）［15］復(fù)合侵染，導(dǎo)致玉米致死性壞死病。

2007年我國(guó)將MCMV列為進(jìn)境檢疫性有害生物。2010年我國(guó)首次從進(jìn)口玉米種子中檢出MCMV［16］，1年之后，Xie L等在我國(guó)云南的玉米植株上發(fā)現(xiàn)了MCMV［17］，到2015年，Deng等又在臺(tái)灣省甜玉米上檢測(cè)出MCMV［18］。饒玉燕等通過(guò)構(gòu)建MCMV損失評(píng)判指標(biāo)體系，對(duì)其在我國(guó)潛在經(jīng)濟(jì)損失作出評(píng)估，高達(dá)140.95億元［19］。加強(qiáng)進(jìn)境糧食檢驗(yàn)檢疫監(jiān)管，防范玉米褪綠斑駁病毒的入侵與擴(kuò)散迫在眉睫。

目前針對(duì)MCMV的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法（ELISA）、RT-PCR、實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法、表面等離子生物傳感器法等［20-22］。酶聯(lián)免疫法對(duì)快速檢測(cè)意義重大，但由于包被抗體特異性不強(qiáng)及保存不當(dāng)?shù)仍颍壮霈F(xiàn)假陽(yáng)性等問(wèn)題；實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)，存在需大型儀器設(shè)備支持且運(yùn)行成本高等問(wèn)題，不利于基層檢測(cè)現(xiàn)場(chǎng)推廣。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是由日本學(xué)者Notomi研發(fā)的一種恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，可在恒溫條件下1 h內(nèi)完成反應(yīng)，結(jié)果清晰肉眼可辨，反應(yīng)靈敏度高，準(zhǔn)確性和特異性好且不需要大型儀器支持［23］。RT-LAMP 是在 LAMP 基礎(chǔ)上，加入反轉(zhuǎn)錄酶，使反轉(zhuǎn)率和核酸擴(kuò)增同時(shí)進(jìn)行，其獨(dú)有的檢測(cè)優(yōu)勢(shì)迅速得到廣大科研工作者的偏愛(ài)，廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物病原微生物檢測(cè)［24-26］。

本研究主要利用RT-LAMP技術(shù)，并與RTPCR比較，分析其特異性和靈敏性，建立一種簡(jiǎn)便易操作、特異性強(qiáng)、靈敏度高的方法快速檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒，為該病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場(chǎng)檢疫等提供更好的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

玉米褪綠斑駁病毒、甘蔗花葉病毒由浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)研究所吳建祥教授提供，玉米矮花葉病毒、小麥線條花葉病毒及玉米白線花葉病毒（MWLMV）陽(yáng)性質(zhì)控物購(gòu)自美國(guó)Agdia公司。

試劑、儀器：RNAprep Pure Plant Kit（天根生化科技有限公司），PrimeScriptTM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit（大連寶生物公司），F(xiàn)luorescent Detection Reagent、RNA Amplification Kit （日本榮研公司）；

LA-320C實(shí)時(shí)濁度儀（日本榮研公司），PCR儀（ABI），NANODROP2000分光光度計(jì)（Thermo），凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)合成 根據(jù)GenBank 發(fā)布的MCMV 外殼蛋白cDNA序列（登錄號(hào)分別為 AM490793.1，JQ943666.1，GU594293.1，JF422772.1，AY587605.1），通過(guò) MEGA 6 軟件進(jìn)行比對(duì)分析，找出外殼蛋白基因3′端保守序列，以此為模板，使用在線軟件Primer3 Input（http：//bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/），設(shè)計(jì)5條引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。序列比對(duì)結(jié)果及靶序列結(jié)合區(qū)域見(jiàn)圖1。

表1 玉米褪綠斑駁病毒RT-LAMP 檢測(cè)引物

圖 1 序列比對(duì)分析結(jié)果及各引物在基因組中對(duì)應(yīng)的位置

1.2.2 總RNA 提取 取病毒樣品和健康玉米葉片，利用植物總RNA提取試劑盒分別提取RNA，用NANODROP 2000分光光度計(jì)測(cè)定核酸濃度（表2）與純度，-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

表 2 測(cè)定的幾種病毒的 RNA 濃度

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè) 利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM II 1stStrand cDNA Synthesis Kit將提取的RNA反轉(zhuǎn)錄成 cDNA ，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

采用 Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì) RTPCR 引物：F-MCMV：TTATGCCACAAAA CCGCACTGT；R-MCMV：TAGGATTGCTGCT CCACGGT。擴(kuò)增片段大小為190 bp。反應(yīng)體系為 10μL 2×Taq PCR StarMix，1μL 引物F-MCMV / R-MCMV（10 umol/L），1μL模板cDNA，加水至20μL。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性 3 min；94℃變性 30 s，53℃退火 40 s，72℃延長(zhǎng)1 min，進(jìn)行35次循環(huán)；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，取5μL反應(yīng)產(chǎn)物，1.6 %瓊脂糖凝膠電泳 30 min（100 V），紫外成像檢測(cè)。

1.2.4 RT-LAMP 檢測(cè)體系的優(yōu)化 基本檢測(cè)體系為：12.5μL 反應(yīng)緩沖液 RM，1.0μL 酶溶液EM，1.0μL 熒光目視檢測(cè)試劑鈣黃素，1.0μL 模板 RNA，終濃度為 1.6μmol/L的MCMV-FIP/MCMV-BIP和終濃度為0.2μmol/L的MCMV-F3/MCMV-B3，最后加水至25μL。RT-LAMP反應(yīng)條件為 63℃ 1 h，80℃ 5 min。LA-32℃實(shí)時(shí)濁度儀檢測(cè)濁度變化，并在反應(yīng)結(jié)束后觀察熒光目視染料是否由橙色變?yōu)榫G色。

分別對(duì)反應(yīng)溫度、引物濃度設(shè)置不同梯度進(jìn)行優(yōu)化。將反應(yīng)溫度設(shè)置為62、63、64、65℃，保持其他因素不變以篩選出最佳反應(yīng)溫度；再將MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）引物終濃度設(shè)置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225） μmol/L，保持其他因素不變以篩選出最佳引物濃度；最后以（FIP/BIP）∶（LB）∶（F3/B3）=8∶4∶1加入環(huán)引物MCMV-LB以驗(yàn)證環(huán)引物效果。試驗(yàn)中用滅菌水為模板，以基本檢測(cè)體系進(jìn)行陰性對(duì)照。

1.2.5 RT-LAMP 與 RT-PCR特異性比較 以MCMV、SCMV、MDMV、WSMV和MWLMV的RNA為模板，進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時(shí)進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，凝膠電泳驗(yàn)證。比較分析兩種方法的特異性。

1.2.6 RT-LAMP 與 RT-PCR靈敏度測(cè)定 以提取的MCMV RNA為原液，用RNase Free dH2O將RNA進(jìn)行10倍梯度稀釋，分別獲得原液（280 ng/μL）、10倍稀釋液（28 ng/μL）、102倍稀釋液（2.8 ng/μL）、103倍稀釋液（280 pg/μL）、104倍稀釋液（28 pg/μL）、105倍稀釋液（2.8 pg/μL）、106倍稀釋液（280 fg/μL）、107倍稀釋液（28 fg/μL）、108倍稀釋液（2.8 fg/μL）。根據(jù)建立的RT-LAMP 反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，觀察濁度及目視試劑顏色變化；同時(shí)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，凝膠電泳驗(yàn)證。比較分析兩種方法的靈敏性。

1.2.7 RT-LAMP檢測(cè)玉米種子樣本的應(yīng)用 選取三葉期玉米幼苗（品種為農(nóng)大108），摩擦接種，15 d后表現(xiàn)典型癥狀，采集新鮮葉片，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

將收集到的葉片與PBS緩沖液按照質(zhì)量比1∶1等比例研磨，紗布過(guò)濾獲取病毒液，備用。選取健康玉米種子研磨成粉末，與10倍梯度稀釋病毒液混勻，模擬種子帶毒，作為待測(cè)樣本（100個(gè)）。利用植物總RNA 提取試劑盒提取模擬待測(cè)樣本RNA，同時(shí)進(jìn)行RT-LAMP和RT-PCR檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-LAMP 檢測(cè)體系優(yōu)化

2.1.1 最適反應(yīng)溫度的選擇 試驗(yàn)設(shè)62、63、64、65℃4個(gè)反應(yīng)溫度梯度，結(jié)果（圖2）顯示，在64℃條件下，反應(yīng)濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 24 min，到達(dá)平臺(tái)期（濁度AABs=0.8）僅需要37 min；而65℃則分別需要 26、39 min，62℃需要 33、47 min ，63℃需要35、54 min。因比當(dāng)反應(yīng)溫度為64℃時(shí)，反應(yīng)進(jìn)行最為迅速。

圖2 RT-LAMP 不同反應(yīng)溫度試驗(yàn)

2.1.2 引物濃度優(yōu)化 將引物MCMV-FIP/MCMV-BIP（MCMV-F3/MCMV-B3）反應(yīng)濃度設(shè)置為1.0（0.125）、1.2（0.15）、1.4（0.175）、1.6（0.2）、1.8（0.225）μmol/L等5個(gè)濃度梯度，結(jié)果（圖 3）顯示，在引物濃度為1.8（0.225）μmol/L條件下，反應(yīng)濁度超出檢出限（濁度AABs=0.2）僅需要 27 min，到達(dá)平臺(tái)期（濁度AABs=0.8）只需要39 min，其他濃度條件下到達(dá)檢測(cè)限和反應(yīng)平臺(tái)期的時(shí)間（分別為54、＞60 min，45、57 min，43、53 min，35、54 min）均有所延遲。因此最佳引物濃度為1.8（0.225）μmol/L。

圖3 RT-LAMP 反應(yīng)不同引物濃度試驗(yàn)

圖4 RT-LAMP中環(huán)引物效果試驗(yàn)

2.1.3 環(huán)引物效果 由圖 4可知，未加入環(huán)引物反應(yīng)在27 min 時(shí)濁度達(dá)到檢測(cè)線（AABs=0.2），且達(dá)到平臺(tái)期（AABs=0.8）需要長(zhǎng)達(dá)39 min；加入環(huán)引物后，濁度達(dá)到檢測(cè)線時(shí)間提前到21 min，反應(yīng)進(jìn)行到平臺(tái)期所用時(shí)間減少6 min。由此可見(jiàn)，環(huán)引物可加速反應(yīng)，效果明顯。

2.1.4 RT-LAMP 檢測(cè)體系的確定 經(jīng)過(guò)以上對(duì)RT-LAMP反應(yīng)溫度、引物濃度及環(huán)引物加入與否等條件的優(yōu)化，確定RT-LAMP檢測(cè)體系為：12.5 μL 反應(yīng)緩沖液 RM，1.0 μL 酶溶液EM，1.0 μL 熒光目視檢測(cè)試劑鈣黃素，1.0 μL 模板RNA，終濃度為1.8μmol/L的MCMVFIP/MCMV-BIP，終濃度為 0.225μmol/L 的MCMV-F3/MCMV-B3和終濃度為0.45μmol/L的MCMV-LB，最后加水至25 μL。由圖5可知，整個(gè)反應(yīng)在45 min內(nèi)可以完成，故RT-LAMP反應(yīng)條件為64℃ 45 min。

2.2 特異性檢測(cè)

以 SCMV、WSMV、MDMV、MWLMV及MCMV的RNA為模板進(jìn)行RT-LAMP檢測(cè)，結(jié)果（圖5）顯示僅有MCMV進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)在45 min內(nèi)完成且目視試劑顏色由橙黃色變?yōu)榫G色；RT-PCR反應(yīng)結(jié)果（圖6）顯示僅有以MCMV為模板的反應(yīng)擴(kuò)增出190 bp大小的條帶。由此可知，RT-LAMP與RT-PCR均能特異性檢測(cè)MCMV。

圖5 RT-LAMP 特異性驗(yàn)證

圖6 RT-PCR特異性驗(yàn)證

2.3 靈敏度檢測(cè)

將 RNA 原液、101、102、103、104、105、106、107、108倍稀釋液分別作為模板，利用所建立的RT-LAMP 反應(yīng)體系和RT-PCR檢測(cè)方法進(jìn)行靈敏度比對(duì)。從圖7可以看出，RT-PCR 以103倍稀釋液為模板可以檢測(cè)到顯著的條帶；以104倍稀釋液為模板，電泳檢測(cè)的條帶模糊不清；以105倍稀釋液為模板，電泳沒(méi)有檢測(cè)到任何條帶。而RT-LAMP 檢測(cè)時(shí)，如圖8所示，以106稀釋液為模板，濁度仍可以在45 min內(nèi)達(dá)到檢測(cè)線（AABs=0.2）。因此，RT-LAMP檢測(cè)MCMV的靈敏性比普通RT-PCR至少高100倍，并且RT-LAMP比RT-PCR節(jié)省時(shí)間，非常有利于MCMV的檢測(cè)應(yīng)用。

圖7 RT-PCR靈敏度試驗(yàn)電泳結(jié)果

2.4 RT-LAMP檢測(cè)玉米評(píng)價(jià)

利用植物總RNA提取試劑盒，提取100個(gè)模擬帶毒玉米種子樣本RNA，分別進(jìn)行RTLAMP和RT-PCR 檢測(cè)。結(jié)果表明，RT-LAMP方法對(duì)100個(gè)待測(cè)樣本的病毒檢出率為100%（100/100）；RT-PCR方法對(duì)100個(gè)待測(cè)樣本的病毒檢出率為78%（78/100），針對(duì)部分低病毒濃度模擬樣本，由于靈敏度限制無(wú)法檢出。

圖8 RT-LAMP 靈敏度試驗(yàn)

3 結(jié)論與討論

玉米在我國(guó)糧食生產(chǎn)中占據(jù)重要的地位，2012—2014年間，我國(guó)玉米進(jìn)口總量超過(guò)1 000萬(wàn)t。玉米褪綠斑駁病毒隨進(jìn)口玉米傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)很高。為更好地服務(wù)口岸檢疫部門，本研究利用RT-LAMP技術(shù)，建立針對(duì)MCMV的RTLAMP檢測(cè)方法，并與普通RT-PCR方法進(jìn)行比較，證實(shí)RT-LAMP檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

實(shí)驗(yàn)中RT-LAMP反應(yīng)中環(huán)引物的加入使反應(yīng)達(dá)到檢測(cè)線（AABs=0.2）及進(jìn)入平臺(tái)期（AABs=0.8）時(shí)間提前6 min，整個(gè)反應(yīng)效率大大提高，確保RT-LAMP 檢測(cè)在64℃等溫條件下反應(yīng)進(jìn)行45 min即可完成，比RT-PCR反應(yīng)過(guò)程節(jié)省約1 h 。在RT-LAMP反應(yīng)中，利用濁度儀實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程中濁度變化，將反應(yīng)結(jié)果數(shù)據(jù)化，更加理性、客觀。通過(guò)加入可視試劑鈣黃素，使反應(yīng)結(jié)果一目了然，避免傳統(tǒng)凝膠電泳等過(guò)程，簡(jiǎn)化整個(gè)檢測(cè)流程，節(jié)約時(shí)間且有效避免反應(yīng)產(chǎn)物交叉污染等問(wèn)題，且整個(gè)反應(yīng)過(guò)程不需要大型儀器設(shè)備的支持，方便口岸現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)室檢疫。

本實(shí)驗(yàn)建立的RT-LAMP檢測(cè)方法，快速、靈敏且特異性強(qiáng)，能滿足針對(duì)玉米褪綠斑駁病毒的田間診斷、口岸現(xiàn)場(chǎng)檢疫的要求。

［1］Jensen S G，Wysong D S，Ball E M，et al. Seed transmission of maize chlorotic mottle virus［J］.Plant disease，1991，75（5）：497-498.

［2］Delgadillo Sánchez F，Pons Hernández J L，Torreón Ibarra A D. Seed transmission of maize chlorotic mottle virus［J］. Revista Mexicana de Fitopatolog í a，1994，12（1）：7-10.

［3］Jiang X Q，Meinke L J，Wright R J，et al. Maize chlorotic mottle virus in Hawaiian-grown maize：vector relations，host range and associated viruses［J］. Crop Protection，1992，11（3）：248-254.

［4］Nault L R，Styer W P，Coffey M E，et al.Transmission of maize chlorotic mottle virus by chrysomelid beetles［J］. Phytopathology，1978，68（7）：1071-1074.

［5］Goldberg K B，Brakke M K. Concentration of maize chlorotic mottle virus increased in mixed infections with maize dwarf mosaic virus，strain B［J］. Papers in Plant Pathology，1987，72（2）：162-167.

［6］Nault L R，Styer W P，Coffey M E，et al.Transmission of maize chlorotic mottle virus by chrysomelid beetles［J］. Phytopathology，1978，68（7）：1071-1074.

［7］Scheets K. Maize chlorotic mottle machlomovirus and wheat streak mosaic rymovirus concentrations increase in the synergistic disease corn lethal necrosis［J］. Virology，1998，242（1）：28-38.

［8］Quito-Avila D F，Alvarez R A，Mendoza A A.Occurrence of maize lethal necrosis in Ecuador：a disease without boundaries［J］. European Journal of Plant Pathology，2016，146（3）：705-710.

［9］Thottappilly G，Qiu W P，Batten J S，et al. A new virus on maize in Nigeria：maize mild mottle virus［J］. Plant Disease，1999，83（3）：302.

［10］Kusia E S，Subramanian S，Nyasani J O，et al.First report of lethal necrosis disease associated with co-infection of finger millet with Maize chlorotic mottle virus and Sugarcane mosaic virus in Kenya［J］. Plant Disease，2015，99（6）：899-900.

［11］Lukanda M，Owati A，Ogunsanya P，et al. First report of Maize chlorotic mottle virus infecting maize in the Democratic Republic of the Congo［J］. Plant Disease，2014，98（10）：1448.

［12］Adams I P，Harju V A，Hodges T，et al. First report of maize lethal necrosis disease in Rwanda［J］. New Disease Reports，2014，29：22.

［13］Scheets K. Maize chlorotic mottle machlomovirus and wheat streak mosaic rymovirus concentrations increase in the synergistic disease corn lethal necrosis［J］. Virology，1998，242（1）：28-38.

［14］Adams I P，Miano D W，Kinyua Z M，et al. Use of next‐generation sequencing for the identification and characterization of Maize chlorotic mottle virus and Sugarcane mosaic virus causing maize lethal necrosis in Kenya［J］. Plant Pathology，2013，62（4）：741-749.

［15］Wangai A W，Redinbaugh M G，Kinyua Z M，et al. First report of maize chlorotic mottle virus and maize lethal necrosis in Kenya［J］. Journal of Virological Methods，2017，240：49-53.

［16］趙明富，黃菁，吳毅歆，等. 玉米褪綠斑駁病毒及傳播介體研究進(jìn)展［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報(bào)，2014，16（5）：78-82.

［17］Xie L，Zhang J，Wang Q，et al. Characterization of maize chlorotic mottle virus associated with maize lethal necrosis disease in China［J］. Journal of Phytopathology，2011，159（3）：191-193.

［18］Deng T C，Chou C M，Chen C T，et al. First report of Maize chlorotic mottle virus on sweet corn in Taiwan［J］. Phytopathology，2015，105（7）：956-965.

［19］饒玉燕，尤揚(yáng)，朱水芳，等. 玉米褪綠斑駁病毒入侵損失指標(biāo)體系及直接經(jīng)濟(jì)損失評(píng)估［J］.植物檢疫，2010，24（2）：5-8.

［20］桂芬，馬潔，張永江，等. 玉米褪綠斑駁病毒抗體及 TAS-ELISA 試劑盒的研制［J］. 檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2014 （6）：42-45.

［21］聞偉剛，張建成，崔俊霞，等. 玉米褪綠斑駁病毒實(shí)時(shí)熒光 RT—PCR 檢測(cè)方法研究［J］. 植物檢疫，2011，25（1）：39-42

［22］曾倡. 利用表面等離子共振生物傳感器檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒和 Cry1F 蛋白的研究［D］. 北京：北京化工大學(xué)，2012.

［23］Notomi T，Okayama H，Masubuchi H，et al.Loop-mediated isothermal amplification of DNA［J］. Nucleic acids research，2000，28（12）：63-63.

［24］王永江，周彥，李中安，等. 柑橘衰退病毒 RTLAMP 快速檢測(cè)方法的建立［J］. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，46（3）：517-524.

［25］湯亞飛，何自福，佘小漫，等. 辣椒黃脈病毒RT-LAMP 快速檢測(cè)方法的建立［J］. 植物保護(hù)，2016，42（6）：100-104.

［26］Keizerweerd A T，Chandra A，Grisham M P.Development of a reverse transcription loopmediated isothermal amplification （RT-LAMP）assay for the detection of Sugarcane mosaic virus and Sorghum mosaic virus in sugarcane［J］.Journal of virological methods，2015，212：23-29.

Comparison and application of RT-LAMP and RT-PCR methods for MCMV detection

SHAN Chang-lin，ZHOU Yuan，LI Xiao-jun，YANG Sai-jun，SHAO Wei-dong
（Zhoushan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Zhoushan 316021，China）

For the detection of Maize chlorotic mottle virus（MCMV），a reverse-transcription，loop mediated isothermal amplification（ RT-LAMP） assay with high sensitivity and specificity was established. A set of five primers were designed，based on the coat-protein sequence of MCMV. By optimizing the concentration of primers，the best temperature，the suitable reaction time，and loop primer，the RT-LAMP was built by incubation at 64℃ for only 45 min with loop primer. The detection limit of RT-LAMP assay was 280 fg of MCMV RNA，which was 100 times more sensitive than that of RT- PCR assay. High species-specificity of RT- LAMP method was confirmed by the assay of 5 pathogens such as MCMV，SCMV，MDMV， WSMV and MWLMV. In addition，all the simulated samples were detected by LAMP assay，detection rate was 100%.

MCMV；RT-LAMP；RT-PCR；detection

S435.131.4

A

1004-874X（2017）07-0083-08

單長(zhǎng)林，周圓，李孝軍，等. RT-LAMP及RT-PCR方法快速檢測(cè)玉米褪綠斑駁病毒的比較與應(yīng)用［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，44（7）：83-90.

2017-04-26

舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2015C31051）

單長(zhǎng)林（1987-），男，碩士，助理農(nóng)藝師，E-mail：changlin_shan@163.com

（責(zé)任編輯 楊賢智）