古小莉，李永賢，李惠青，陳潔文,李劉冬

(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室， 廣東 廣州 510300)

創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的制備及其特性分析

古小莉，李永賢，李惠青，陳潔文,李劉冬*

(中國水產科學研究院南海水產研究所，農業(yè)部水產品加工重點實驗室，農業(yè)部水產品貯藏保鮮質量安全風險評估實驗室， 廣東 廣州510300)

[目的]制備創(chuàng)傷弧菌特異性抗體，為建立免疫學快速檢測創(chuàng)傷弧菌提供參考依據。[方法]以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原，將抗原分多次免疫新西蘭大白兔獲得特異性多克隆抗體，采用蛋白G親和層析法純化多克隆抗體，通過間接ELISA和WesternBlot測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的效價、敏感性和特異性。[結果]實驗獲得了純度較高的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體，效價為1∶64000；抗體對創(chuàng)傷弧菌具有高的特異性，它與多株致病菌均無明顯交叉反應，其對創(chuàng)傷弧菌檢測靈敏度為103CFU/mL；WesternBlot分析表明，制備的多克隆抗體能識別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具較強的抗原性。[結論]創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體具有較高特異性和靈敏性，可應用于創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學檢測。[中國漁業(yè)質量與標準，2017,7(5):45-50]

創(chuàng)傷弧菌；外膜蛋白；多克隆抗體；WesternBlot；ELISA

創(chuàng)傷弧菌(Vibriovulnificus)是一種革蘭氏陰性嗜鹽菌，其廣泛存在于河口、海洋環(huán)境和海產品中，是危害許多海水養(yǎng)殖動物的主要病原菌之一，同時也能夠使人類致病，引起胃腸炎、傷口感染和原發(fā)性敗血癥[1-2]。鑒于創(chuàng)傷弧菌致病的危害性，建立特異、靈敏的檢測方法尤為迫切。目前，創(chuàng)傷弧菌快速檢測方法主要有免疫學方法和分子生物學方法[3-4]，其中免疫學方法以具有特異性強、敏感性高、檢測時間短等優(yōu)點受到眾多研究者的青睞[5-6]。研制創(chuàng)傷弧菌高特異性的抗體，是建立免疫學快速檢測創(chuàng)傷弧菌的重要基礎。

革蘭氏陰性細菌表面的外膜蛋白(outer membrane protein，OMP)與細菌的致病性及免疫保護性密切相關，外膜蛋白在細菌表面存在裸露的抗原表位，具有較強免疫原性，能刺激機體產生抗體及某些細胞因子[7-9]。目前，國內外關于創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白的研究主要集中在抗原性和免疫刺激復合物分析[10-12]，但以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作抗原制備特異抗體的研究較少。李素一等[13]在創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU的免疫原性研究中，制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU多克隆抗體驗證可以識別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白OmpU，但未對抗體的特性作進一步的研究。為深入了解創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白抗體的特性，本研究以創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原制備多克隆抗體，探討抗創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體的特異性，以期為建立創(chuàng)傷弧菌的快速、靈敏的免疫學檢測方法提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株

實驗菌株均購自廣東省食品微生物安全工程技術研究開發(fā)中心，菌株列表見表1。

表1 菌株列表Tab.1 Strains list

1.1.2 實驗動物

純系新西蘭大白兔購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心。

1.1.3 主要試劑

弗氏(完全/不完全)佐劑、Tris-HCl、甘氨酸、HRP標記的羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司；SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自廣州杰偉特生物科技有限公司；堿性蛋白胨水購自廣州環(huán)凱生物科技有限公司；蛋白G親和層析柱(HiTrap Protein G HP)購自美國GE Healthcare公司；TBST及PMSF購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 多克隆抗體的制備

1.2.1.1 抗原(外膜蛋白)的制備

參照改進的PMSF法[11]，將創(chuàng)傷弧菌接種于3% NaCl堿性蛋白胨水，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)的創(chuàng)傷弧菌菌液于100 ℃水浴滅活5 min，取200 mL于離心管中，4 ℃ 7 043 g離心20 min，棄上清液，收集沉淀。將收集的菌體沉淀加PMSF反復凍融并進行超聲破碎6 min(功率200 W，工作30 s，間隔5 s)，將裂解后的菌液4 ℃ 13 805 g離心20 min，收集上清液，并將上清液進行SDS-PAGE電泳[14]，用Bio-Rad公司Quantity One 4.62軟件計算分子量。

1.2.1.2 多克隆抗體的制備

將制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白200 μL(蛋白濃度約2.5 mg/mL)與弗氏佐劑1∶1(V/V)混合，振蕩混勻，采用多點(頸部、腳掌和腹股溝)皮下注射免疫新西蘭大白兔，進行三次免疫，首次免疫20 d，二次免疫10 d，三次免疫10 d(首次免疫使用弗氏完全佐劑，加強免疫使用弗氏不完全佐劑)。免疫結束，取免疫新西蘭大白兔血清，將血清于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.3多克隆抗體的純化

參照《蛋白質技術手冊》親和層析法[15]，用蛋白G親和層析柱HiTrap Protein G HP純化抗血清，以pH 3.0的0.1 mol/L 甘氨酸-HCl緩沖液洗脫，收集的洗脫液為純化的多克隆抗體，將純化后的抗體進行SDS-PAGE電泳。

1.2.2 多克隆抗體特性分析

1.2.2.1 多克隆抗體的效價測定

采用間接ELISA法[16]測定創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體(免疫血清)效價，酶標儀設定波長為492 nm。

1.2.2.2 敏感性試驗

將108CFU/mL創(chuàng)傷弧菌菌懸液，進行10倍梯度遞減稀釋至102CFU/mL，將待測血清及陰性血清按1∶4 000稀釋，羊抗兔IgG以1∶1 000稀釋，通過間接ELISA法確定最小抗原檢測濃度。以所產生的P/N值大小作為判斷標準，當P/N值≥2.1判定為陽性[17]。P/N值=(陽性對照OD492值-空白對照OD492值)/(陰性對照OD492值-空白對照OD492值)。

1.2.2.3 交叉試驗

將濃度為107CFU/mL的創(chuàng)傷弧菌、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌于37 ℃水浴包被酶標板，陰性血清和陽性血清均采用1∶4 000的稀釋度進行間接ELISA檢測，確定交叉反應情況。

1.2.2.4 免疫印跡試驗(Western Blot)

參照文獻[18]，將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、副溶血性弧菌、溶藻弧菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌進行SDS-PAGE電泳后，取出凝膠，漂洗數秒，將PVDF膜和濾紙置于轉移緩沖液(0.025 mol/L Tris； 0.192 5 mol/L Gly； 20%甲醇)中濕潤5～ 10 min。按照陰極-海綿-濾紙-凝膠-PVDF膜-濾紙-海綿-陽極的順序安放好三明治的轉運槽。冰浴轉膜250 mA，1 h。轉移后的PVDF膜用5%脫脂牛奶37 °C封閉緩慢振蕩2 h；加入1∶1 500稀釋的純化后的多克隆抗體后在37 °C搖床上孵育1 h，TBST漂洗(4次，每次10 min)，以正常兔血清作為陰性對照；加入用HRP標記的羊抗兔IgG(1∶8 000倍稀釋)，37 °C緩慢振蕩1 h，室溫TBST漂洗(4次，每次10 min)，最后用HRP-ECL發(fā)光法觀察結果。

2 結果

2.1 多克隆抗體的制備及純化

創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE分析結果(圖1)可見，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要集中在15～130 kD分子量范圍內，共可發(fā)現大約有20條蛋白條帶，其中主要條帶有11條，分子量分別約為112、 84、 77、 72、 60、 56、 50、 46、 42、 36和20 kD，其中56、 36和20 kD條帶最清晰，蛋白濃度高。

經Protein G親和層析純化后的抗體SDS-PAGE顯示(圖2)，抗體經純化后得到兩個蛋白條帶，一條55 kD左右的重鏈，一條28 kD左右的輕鏈，無多余條帶，表明純化后的抗體純度較高。

圖1 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白SDS-PAGE圖譜Fig.1 SDS-PAGE of outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

圖2 純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體SDS-PAGE圖譜1：分子量標準蛋白；2：純化創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。Fig.2 SDS-PAGE image of purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus1：Marker; 2：Purified polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus.

2.2 多克隆抗體的效價

用間接ELISA法檢測創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價，結果顯示多克隆抗體效價為1∶64 000(圖3)，制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體獲得了較高的效價。

圖3 創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體效價曲線Fig.3 Titer curve of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus

2.3 敏感性

用不同濃度的創(chuàng)傷弧菌液(108、 107、 106、 105、 104、 103和102CFU/mL)為抗原，進行間接ELISA測定，結果見表2。由表2可知，當菌液濃度為103CFU/mL時，P/N值為2.15，即為陽性反應，該抗體可檢測最低菌液濃度為103CFU/mL。

2.4 交叉反應

通過間接ELISA測定，抗體與創(chuàng)傷弧菌反應呈強陽性，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌有微弱的交叉反應，與鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細胞增生李斯特氏菌、金黃色葡萄球菌等水產動物中常見的病原菌均無交叉反應(表3)。

2.5 免疫印跡

用制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白及幾種試驗菌株的Western Blot見圖4。Western Blot結果可見，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌出現了不同程度的免疫反應帶；創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白共有7條明顯的免疫反應帶，分子量分別約為72、 60、 50、 36、 35、 34和20 kD；溶藻弧菌和副溶血性弧菌的免疫反應帶均較弱，溶藻弧菌有2條反應帶，副溶血性弧菌有1條反應帶；在分子量約為36 kD處，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌均有一條免疫反應帶；鼠傷寒沙門氏菌、大腸埃希氏菌O157、單核細胞增生李斯特氏菌和金黃色葡萄球菌均無反應帶出現。

表2 多克隆抗體敏感性實驗結果Tab.2 The result of sensitivity assay of polyclonal antibody

注：“-”為陰性(P/N<2.1)，“+”為陽性(P/N≥2.1)。

表3 多克隆抗體交叉實驗結果Tab.3 The result of cross reaction assay of polyclonal antibody

注：“-”～“++++”表示反應強度依次增加的5種程度，其中P/N<2.1為“-”，2.1≤P/N<6.1為“+”，6.1≤P/N<10.1為“++”，10.1≤P/N<14.1為 “+++”，P/N>14.1為“++++”。

圖4 Western Blot分析創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體特性1：分子量標準蛋白；2：創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白；3：溶藻弧菌；4：副溶血性弧菌；5:鼠傷寒沙門氏菌；6：大腸埃希氏菌O157； 7：單核細胞增生李斯特氏菌；8：金黃色葡萄球菌；9：陰性對照。Fig.4 Western Blot analysis on the character of polyclonal antibody against outer membrane proteins of Vibrio vulnificus 1：Marker；2：Outer membrane proteins of Vibrio vulnificus；3：Vibrio alginolyticus；4：Vibrio parahaemolyticus；5：Salmonella typhimurium；6：E.coli O157；7：Listeria monocytogenes；8：Staphylococcus aureus；9：Negative serum.

3 討論

創(chuàng)傷弧菌的外膜蛋白與細菌致病性及免疫保護性密切相關，在決定宿主免疫反應的特異上起著重要作用[11，19-21]。有研究報道創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白有較強的抗原性[11，20]，本研究將創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，制備了創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體。

SDS-PAGE分析發(fā)現創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白條帶比較密集，其主要蛋白條帶清晰，分布在15～130 kD之間，與田丁等[11]報道的創(chuàng)傷弧菌主要外膜蛋白帶在14～92 kD之間的結果不完全一致，只有84、 60和36 kD的蛋白為共同條帶。有研究[22-24]認為同種細菌外膜蛋白的差別可能與細菌的培養(yǎng)條件、外膜蛋白的制備方法、菌株的致病性和血清型不同有關。值得注意的是，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白主要條帶中的36 kD蛋白，已有許多研究證實其為弧菌外膜蛋白先共有成分[23-26]。

抗體交叉反應發(fā)現，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌呈現強的陽性反應，與溶藻弧菌和副溶血性弧菌存在較弱的交叉反應，與其他試驗菌株無交叉反應，可見試驗制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌具有較高的特異性。使用該多抗檢測創(chuàng)傷弧菌時，為避免出現假陽性，可對樣品進行增菌(增加樣品外膜蛋白豐度)再進行檢測。

Western Blot分析顯示，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白中的7條蛋白發(fā)生不等程度的反應，可見制備的多克隆抗體不僅能夠識別創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白與其發(fā)生免疫反應，同時說明創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白具有較強的抗原性。Western Blot結果中36 kD位置處創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白、溶藻弧菌和副溶血性弧菌都出現了較弱的反應帶，交叉試驗中同樣具有36 kD外膜蛋白的溶藻弧菌和副溶血性弧菌[23，26]亦與多克隆抗體發(fā)生較弱的交叉反應，由此可推測出，雖然創(chuàng)傷弧菌36 kD外膜蛋白發(fā)生免疫反應，但反應較弱，不具有強抗原性。其他試驗菌株均無免疫反應帶，同時結合交叉反應結果，表明了研究制備的多克隆抗體具有較高的特異性。此外，創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體與溶藻弧菌、副溶血性弧菌發(fā)生的弱交叉反應，說明創(chuàng)傷弧菌與溶藻弧菌、副溶血性弧菌之間可能存在相同的抗原決定簇。如何將產生相同的抗原的外膜蛋白分離出以提高抗體特異性，有待進一步的研究。

本研究制備的創(chuàng)傷弧菌外膜蛋白多克隆抗體，抗體純度較高，效價達1∶64 000，其與水產品中常見的致病菌無明顯的交叉反應，具有較高的特異性和靈敏性，制備相對容易，可為創(chuàng)傷弧菌快速檢測等應用提供參考依據。

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PreparationandcharacterizationofpolyclonalantibodyagainstoutermembraneproteinsofVibriovulnificus

GU Xiaoli， LI Yongxian， LI Huiqing， CHEN Jiewen， LI Liudong*

(South China Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Guangzhou 510300, China；Key Laboratory of Aquatic Product Processing, Ministry of Agriculture; Laboratory of Quality and Safety Risk Assessment forAquatic Product on Storage and Preservation, Ministry of Agriculture)

[Objective] This study aimed to prepare high specific antibody againstVibriovulnificus, and provide references for rapidly screeningVibriovulnificusby immunological method. [Methods] The polyclonal antibody was obtained by injecting the antigen, which was the outer membrane proteins ofVibriovulnificus, to New Zealand rabbits in several times with increasing dose, and purified by protein G affinity chromatography. Indirect ELISA and Western Blot assay were conducted to characterize the titer, sensitivity and specificity of polyclonal antibody. [Results]The polyclonal antibody prepared had high purity, which titer was 1∶64 000. Moreover, the antibody had high specificity forVibriovulnificus. It was no obvious cross reaction with other multiple pathogenic bacteria. The minimum threshold detection limit was 103CFU/mL in pure culture ofVibriovulnificus. Western Blot result showed that the polyclonal antibody could specially identify the outer membrane proteins ofVibriovulnificusand the outer membrane proteins should have good antigenicity. [Conclusion]The polyclonal antibody against outer membrane proteins ofVibriovulnificuswas high specificity and sensitivity, which could be used to rapidly screenVibriovulnificus.[Chinese Fishery Quality and Standards, 2017, 7(5):45-50]

Vibriovulnificus; outer membrane protein; polyclonal antibody; Western Blot; ELISA

LI Liudong，168lld@163.com

10.3969/j.issn.2095-1833.2017.05.007

S91

A

2095-1833(2017)05-0045-06

2017-04-14;接收日期2017-07-10

中國水產科學研究院南海水產研究所中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務費專項資金資助(2015TS18，2009TS02，2015TS15);廣東省水產品質量安全專項項目(GDSCZA2015009);國家農產品質量安全風險評估重大專項(GJFP201501003)

古小莉(1982-)，女，碩士，助理研究員，研究方向為水產品質量安全，lilet_ku@163.com

李劉冬，研究員，研究方向為水產品質量安全，168lld@163.com