李潔，申詠紅，閆福棟，陳杰，蔣莉

（中牧股份成都藥械廠，四川 成都 610100）

副豬嗜血桿菌兩個(gè)血清型菌株最適培養(yǎng)條件的篩選

李潔，申詠紅，閆福棟，陳杰，蔣莉

（中牧股份成都藥械廠，四川 成都 610100）

本試驗(yàn)對(duì)副豬嗜血桿菌兩個(gè)血清型（MD0322及SH0165）菌株的體外最適培養(yǎng)條件進(jìn)行了篩選，在添加一定量血清和輔酶的情況下，兩株細(xì)菌生長(zhǎng)良好，通過(guò)跟蹤生長(zhǎng)曲線在最適時(shí)間內(nèi)收獲大量菌體，為后續(xù)疫苗生產(chǎn)工藝提供支持。

副豬嗜血桿菌；培養(yǎng)基；通氣量

副豬嗜血桿菌的血清型復(fù)雜多樣，分15個(gè)血清型。我國(guó)分離株主要是4、5、12、13型血清[1]。本試驗(yàn)以毒力較強(qiáng)的血清4型 MD0322株和血清5型SH0165株作為研究對(duì)象，對(duì)其體外最適培養(yǎng)條件進(jìn)行篩選，為后續(xù)相應(yīng)血清型疫苗的生產(chǎn)提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及培養(yǎng)基 TSB干粉培養(yǎng)基購(gòu)自BD公司，普通干粉培養(yǎng)基購(gòu)自榮城雨林公司，輔酶購(gòu)自SIGMA公司，新生牛血清購(gòu)自內(nèi)蒙古金源康公司。

1.2 菌株 副豬嗜血桿菌MD0322株為血清4型，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，本單位對(duì)菌株復(fù)壯后備用。副豬嗜血桿菌SH0165株為血清5型，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，本單位對(duì)菌株復(fù)壯后備用。

1.3 主要儀器設(shè)備 PHS-3C酸度儀，移液器，HZSHA水浴恒溫振蕩器，自動(dòng)培養(yǎng)罐系統(tǒng)，DNP-9272電熱恒溫培養(yǎng)箱。

1.4 最適培養(yǎng)基篩選 按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明配制TSB培養(yǎng)基和普通干粉培養(yǎng)基，分別將MD0322和SH0165兩個(gè)菌株接種到兩種培養(yǎng)基中，在不同培養(yǎng)條件下對(duì)不同培養(yǎng)時(shí)間段內(nèi)的培養(yǎng)物分別抽樣，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，確定最佳培養(yǎng)基。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 輔料添加比較試驗(yàn) （輔酶與血清） 在已確定的TSB培養(yǎng)基中，分別添加0.5%、1%、1.5%的輔酶，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)觀察兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)情況；在血清添加試驗(yàn)中，分別添加2%、5%的血清進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)，通過(guò)活菌計(jì)數(shù)確定血清最佳添加量。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 培養(yǎng)罐培養(yǎng)細(xì)菌通氣量試驗(yàn) 在培養(yǎng)基固定和輔料添加的情況下，于培養(yǎng)罐培養(yǎng)細(xì)菌的過(guò)程中選擇不同的通氣量，記錄兩株菌株生長(zhǎng)對(duì)氧氣的需要情況，摸索確定最佳培養(yǎng)工藝。試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果

2.1 最適培養(yǎng)基篩選情況 按照培養(yǎng)基配制說(shuō)明分別配制TSB培養(yǎng)基和普通干粉培養(yǎng)基，分別接種MD0322和SH0165兩種不同血清型的副豬嗜血桿菌，進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。

從表1、圖1可以看出，MD0322和SH0165兩種細(xì)菌的生長(zhǎng)特性不同。從整體上看，MD0322在培養(yǎng)基中增殖迅速，對(duì)培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)要求小于SH0165，而SH0165在培養(yǎng)基中增殖較慢，數(shù)量明顯偏低。接種后12～14h是兩種細(xì)菌增殖活躍期?？偟膩?lái)說(shuō)，用TSB培養(yǎng)基培養(yǎng)MD0322和SH0165所產(chǎn)生的細(xì)菌數(shù)優(yōu)于普通干粉培養(yǎng)基。

2.2 輔料添加比較試驗(yàn)

2.2.1 輔酶作為副豬嗜血桿菌培養(yǎng)過(guò)程的生長(zhǎng)刺激因子，能很好地促進(jìn)細(xì)菌增殖，從成本和菌數(shù)兩方面考慮，我們?cè)O(shè)置3個(gè)梯度進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)，通過(guò)細(xì)菌增殖過(guò)程中的活菌計(jì)數(shù)尋找最佳添加量（結(jié)果如表2、表3所示）。

表1 不同培養(yǎng)基兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)活菌數(shù)（3次重復(fù)平均值） 億CFU/mL

圖1 不同培養(yǎng)基中不同時(shí)間點(diǎn)兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)情況

表2 2%血清添加濃度和不同輔酶濃度下兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)活菌數(shù)（3次重復(fù)平均值） 億CFU/mL

表3 5%血清添加濃度和不同輔酶濃度下兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)活菌數(shù)（3次重復(fù)平均值）億CFU/mL

2.2.2 血清能為細(xì)菌生長(zhǎng)提供大量生物活性物質(zhì)，適量添加血清可以促進(jìn)對(duì)營(yíng)養(yǎng)需求較高、培養(yǎng)條件嚴(yán)苛的細(xì)菌的增殖。通過(guò)細(xì)菌增殖過(guò)程中活菌計(jì)數(shù)結(jié)果，確定最佳血清添加量（輔酶添加量確定為1%），結(jié)果如4所示。

表4 不同血清濃度下兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)活菌數(shù)（3次重復(fù)平均值） 億CFU/mL

從表2、表3可以看出，添加1.5%輔酶的菌數(shù)略高于1%輔酶，從成本方面考慮，選擇1%的輔酶添加量；從表4可以看出，添加1%輔酶和5%血清的生長(zhǎng)活菌數(shù)明顯高于2%血清。綜合考慮生產(chǎn)成本與產(chǎn)品質(zhì)量，建議在培養(yǎng)過(guò)程中選用5%濃度的血清及1%濃度的輔酶來(lái)培養(yǎng)副豬嗜血桿菌血清4型、5型菌液。

2.3 培養(yǎng)罐培養(yǎng)細(xì)菌通氣量試驗(yàn) 在確立了小規(guī)模培養(yǎng)副豬嗜血桿菌的生產(chǎn)工藝參數(shù)后，為實(shí)現(xiàn)規(guī)模化培養(yǎng)，通過(guò)改變通氣量的大?。ㄒ粤髁坑?jì)控制），獲得通氣量與菌數(shù)之間的關(guān)系，確定培養(yǎng)過(guò)程中的最佳通氣量，結(jié)果如表5所示。

從表5可以看出，副豬嗜血桿菌血清4型、5型菌株在通中大量氣的條件下所培養(yǎng)出的活菌數(shù)明顯高于通中量氣的細(xì)菌數(shù)。

表5 不同通氣量下兩株細(xì)菌的生長(zhǎng)活菌數(shù)億CFU/mL

3 討論

副豬嗜血桿菌是一種酶系統(tǒng)不夠完整，需在血液生長(zhǎng)因子協(xié)助下才能生長(zhǎng)的革蘭氏陰性桿菌。因此，副豬嗜血桿菌的體外培養(yǎng)對(duì)培養(yǎng)基及培養(yǎng)基添加物的要求較高[1-2]。從試驗(yàn)中可以看到，MD0322和SH0165兩株細(xì)菌在添加了血清和輔酶的培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況明顯優(yōu)于未添加組。該細(xì)菌在普通培養(yǎng)基上不易生長(zhǎng)，在添加了血液生長(zhǎng)因子（即X因子和V因子）后可形成明顯菌落。研究認(rèn)為，血清中的X因子是一大類具有促生長(zhǎng)作用的血紅蛋白衍生物，可供細(xì)菌合成細(xì)胞色素、細(xì)胞色素氧化酶、接觸酶及過(guò)氧化物酶等呼吸酶類，而V因子即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，輔酶I）或煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP，輔酶II），這兩種脫氫輔酶與生長(zhǎng)細(xì)胞的氧化還原過(guò)程有密切關(guān)系[1-2]。因此在添加了血清和輔酶的培養(yǎng)基中適當(dāng)加入氧氣不僅有利于pH值平衡，還有利于細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生氧化還原反應(yīng)。

[1]趙德明，張仲秋，沈建忠.豬病學(xué)[M].9版.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2008：769-782.

[2]郭萬(wàn)柱，吳彤，陳瑤先.動(dòng)物微生物學(xué)[M].成都：四川科學(xué)技術(shù)出版社，2001：241-244.

Selecting of the Best Culture Condition on the Two Strains of Haemophilus Parasuis

Li Jie，Shen Yonghong，Yan Fudong，et al.
（CAHIC Chengdu Machinery Factory，Sichuan Chengdu 610100，China）

Through selecting the best culture conditions on the two serotypes of Haemophilus parasuis（MD0322 and SH0165 strains）in vitro，we found that under the conditions of adding a certain amount of serum and coenzyme，the two strains grew well，and a large number of bacteria were harvested in the optimum time by tracking the growth curve，which provided the support for the follow-up production of the vaccine.

Haemophilus parasuis；Culture medium；Aeration rate

S852.612

B

1001-8964（2017）10-0000-00

2017-08-07

李潔（1971-），女，四川巴中人，在職碩士，工程師，主要從事疫苗的研究與生產(chǎn)。