傅 蕾，李 霞，高 璐，蔣建雄，孫建中

(江蘇大學生物質(zhì)能源研究所，江蘇大學環(huán)境與安全工程學院， 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心華東分中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

鹽脅迫下泛菌屬內(nèi)生細菌對雜交狼尾草發(fā)芽及生理的影響

傅 蕾，李 霞，高 璐，蔣建雄，孫建中

(江蘇大學生物質(zhì)能源研究所，江蘇大學環(huán)境與安全工程學院， 國家能源非糧生物質(zhì)原料研發(fā)中心華東分中心，江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

內(nèi)生細菌作為一種寶貴的天然微生物資源，在植物防病、殺蟲、促生、耐鹽及耐干旱能力等方面具有廣闊的應用前景。本研究分析了泛菌屬內(nèi)生細菌(Pantoeasp.)PP04對不同鹽濃度脅迫下雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)種子萌發(fā)及幼苗生長的影響。結(jié)果表明，該內(nèi)生細菌在低(100 mmol·L-1)、中(200 mmol·L-1)度鹽濃度下，對雜交狼尾草種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)及胚芽長度都有明顯增益作用，增幅分別達10.75%、28.57%和300%。進一步研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度的鹽脅迫下，內(nèi)生細菌PP04通過誘導雜交狼尾草不同的抗氧化保護酶活性，從而減少膜脂過氧化作用，降低丙二醛(MDA)的含量。在低、中濃度鹽脅迫下，PP04能顯著提高雜交狼尾草超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸酶(APX)的活性。其中SOD和POD活性在低鹽脅迫下增幅最高，可達64.17%和73.14%；而CAT和APX酶活性在高鹽(300 mmol·L-1)脅迫下增幅最大，可達160.57%和73.38%。說明該內(nèi)生細菌菌株可通過緩解氧化脅迫對植物造成的損傷，顯著提高植物對鹽脅迫的耐受性，具有良好的開發(fā)應用前景。

內(nèi)生細菌；雜交狼尾草；鹽脅迫；種子萌發(fā)；幼苗生長；氧化脅迫

雜交狼尾草(Pennisetumamericanum×P.purpureum)屬多年生草本C4植物，它是以象草(Pennisetumpurpureum)為父本，美洲狼尾草(Pennisetumamericanum)為母本育成的雜交種。雜交狼尾草雜交優(yōu)勢明顯，具有高效的光合作用，較高的纖維素、半纖維素含量和生物量，較強的抗逆性等優(yōu)良性狀。作為新型能源作物，雜交狼尾草具有良好的開發(fā)和應用潛力。同時，雜交狼尾草也作為一種優(yōu)質(zhì)的動物飼料而被廣泛種植[1-3]。隨著我國經(jīng)濟的快速發(fā)展，土地資源缺失的矛盾不斷加劇，鹽堿地、荒地、貧瘠地等邊際性土地利用價值受到人們越來越多的重視，并逐漸被開發(fā)成為一些耐鹽性植物的栽培用地，以期實現(xiàn)沿海灘涂鹽堿地改造和多元化利用[4]。目前，雖有研究表明，雜交狼尾草具有一定的耐鹽能力，其耐鹽閾值可達到100 mmol·L-1，但若繼續(xù)升高鹽濃度，極易發(fā)生嚴重的毒害作用，甚至無法繼續(xù)生長[5]。因此，如何增強雜交狼尾草在鹽堿地土壤環(huán)境下的生存能力，提高其耐鹽性，增加其生物產(chǎn)量，對雜交狼尾草作為能源植物和動物飼料的產(chǎn)業(yè)化種植具有十分重要的現(xiàn)實意義，已逐漸成為雜交狼尾草研究的熱點之一。

植物內(nèi)生細菌廣泛存在于植物的組織或器官中，與植物在長期共同進化過程中形成了密切的互惠共生關(guān)系。內(nèi)生細菌作為一種寶貴的天然微生物資源，在宿主防病、殺蟲、促生、耐鹽及耐干旱等能力提升方面也得了到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注[6-7]。目前，國內(nèi)外的科研工作者已經(jīng)篩選出促進水稻(Oryzasativa)、玉米(Zeamays)、小麥(Triticumaestivum)、甘蔗(Saccharumofficinarum)、蘋果(Maluspumila)、柑橘(Citrusreticulata)、高叢藍莓(Vacciniumcorymbosum)、桑葚(Morusalba)和杏(Armeniacavulgaris)生長,并提高其產(chǎn)量的根際內(nèi)生菌，它們在正?；蛎{迫條件下均能顯著促進植物的健康生長，提高其產(chǎn)量和耐鹽能力[8-10]。因此，利用植物內(nèi)生菌的獨特功能及與植物的相互作用，有可能提高雜交狼尾草植物對鹽脅迫的耐受能力及生物產(chǎn)量。同時，在鹽堿土改良與植物生態(tài)修復方面，內(nèi)生菌也可能具有一定的應用潛力。大量研究還表明，植物內(nèi)生細菌可以顯著提高植物在逆境條件下的適應能力，包括抗病蟲害、抗干旱以及抗鹽脅迫的多種優(yōu)良特性[11-14]，這些內(nèi)生菌的研究結(jié)果與優(yōu)良特性正受到越來越多科學家的密切關(guān)注，成為近年來的研究熱點方向之一。

已有研究從象草根部成功篩選到了大量內(nèi)生細菌菌株，完成了初步鑒定并研究了其中4種優(yōu)良菌株對雜交狼尾草的促生機制[15]。其中，泛菌屬內(nèi)生細菌(Pantoeasp.)PP04在100 mmol·L-1鹽脅迫下對雜交狼尾草具有明顯的促生作用與效果，但是，內(nèi)生菌增強耐鹽性的機制仍未有明確的結(jié)論。研究PP04對植物體內(nèi)抗氧化酶活性的影響和作用機制，是解析內(nèi)生菌提高植物耐鹽能力的一項重要基礎研究。因此，本研究試圖明確該內(nèi)生細菌在鹽脅迫條件下對雜交狼尾草種子萌發(fā)、幼苗的生長和抗氧化酶活性的影響機制，闡明內(nèi)生菌是如何幫助雜交狼尾草緩解逆境下的氧化脅迫，以期為有益內(nèi)生細菌和雜交狼尾草在鹽堿地產(chǎn)業(yè)化開發(fā)和推廣中的應用提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1試驗材料

雜交狼尾草種子由江蘇省農(nóng)科院畜牧研究所提供，內(nèi)生菌為泛菌屬細菌Pantoeasp.，菌株編號PP04，分離自象草根部，保存于江蘇大學生物質(zhì)能源研究所-70 ℃冰箱[15]。

1.2試驗方法

1.2.1菌液制備 取出保存在-70 ℃冰箱中的PP04菌株，在LB平板上劃線，放置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，挑取單菌落于裝有1 mL 液體LB培養(yǎng)基的EP管中，30 ℃下200 r·min-1震蕩培養(yǎng)10 h，將活化的菌液按照1∶100的比例倒入100 mL的液體培養(yǎng)基中，30 ℃下200 r·min-1培養(yǎng)至對數(shù)期(OD600=1.0，106cfu·mL-1)，將菌懸液倒入滅菌的離心管中，4 ℃下4 500 r·min-1離心10 min，用吸水紙吸干殘余的培養(yǎng)基，并用無菌水及NaCl溶液重懸，配制成菌體重懸液(OD600=1.0)待用。

1.2.2種子萌發(fā)及生長 種子的萌發(fā)及生長試驗，挑選無破損、大小一致的雜交狼尾草種子，用0.5%的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3～5次，用濾紙吸干附著水。設置對照組(E-，未添加內(nèi)生細菌)和試驗組(E+，添加內(nèi)生細菌)，并分別設置0(無鹽)、100 mmol·L-1(低鹽)、200 mmol·L-1(中鹽)、300 mmol·L-1(高鹽)共4個NaCl濃度梯度，將3層濾紙作為發(fā)芽床置于直徑為12 cm的培養(yǎng)皿中，E-組每皿用5 mL 4種濃度的鹽溶液潤濕濾紙，E+處理組每皿用5 mL相應濃度的鹽溶液配制的菌體重懸液潤濕濾紙。將大小基本一致的種子均勻放置在濕潤的濾紙上，每皿20粒。每個處理設置4個重復。每天加入適量蒸餾水和鹽水以保持濾紙的濕度。從種子置床之后的第2天開始觀察，以胚根長0.2 cm作為發(fā)芽標準，每日統(tǒng)計萌發(fā)種子數(shù)，至第6天，每個處理隨機選5株測其胚芽長度。

侵染3 d后，每個處理隨機取萌發(fā)的種子3粒，進行內(nèi)生菌菌株的回收及分子鑒定，以確定內(nèi)生菌侵染到種子內(nèi)部。取出侵染后種子，用0.5%的次氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3～5次，置于無菌吸水紙上，吸干殘留的水分；將種子置于無菌的研缽中，加入適量的石英砂研磨，轉(zhuǎn)移至適量的PBS緩沖液中；取100 μL研磨液涂布于LB固體培養(yǎng)基上；30 ℃下培養(yǎng)48 h。根據(jù)每個培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)，計算每克鮮重組織中的細菌數(shù)(cfu·g-1)。隨機挑取單菌落進行16S rDNA分子鑒定[16]。

1.2.3內(nèi)生細菌侵染及鹽脅迫處理 首先挑選飽滿的雜交狼尾草種子浸泡在蒸餾水中24 h，然后將種子單層、分散地鋪在濃度為1.5%的瓊脂培養(yǎng)基上，于28 ℃黑暗條件下催芽24 h。待種子開始露白后，再將其種植在放有浮板的一次性紙杯內(nèi)，用Hoagland營養(yǎng)液于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(白天26 ℃，晚上22 ℃，光照時間為16 h，光照強度為4 000 lx)10 d。待植物幼苗長至二葉一心期時進行內(nèi)生菌和鹽脅迫處理，選取長勢一致的雜交狼尾草幼苗分為兩組：實驗組(E+)將內(nèi)生菌液加入雜交狼尾草Hoagland營養(yǎng)液中，對照組(E-)則不加菌液。侵染3 d后，每個處理隨機取幼苗3株，進行內(nèi)生菌菌株的回收及分子鑒定，以確定內(nèi)生菌成功侵染到幼苗內(nèi)(方法同1.2.2)。兩組同時用0、100、200、300 mmol·L-14個NaCl濃度處理，每個處理設6個重復。接下來每隔4 d添加一次50 mL對應鹽溶液，保持持續(xù)的鹽脅迫。培養(yǎng)21 d后，對雜交狼尾草幼苗的丙二醛含量和抗氧化酶活性進行測定。

1.3測定項目與方法

1.3.1種子發(fā)芽指標的測定 從種子置床之后的第2天開始觀察，每日記錄發(fā)芽種子數(shù)直至發(fā)芽試驗結(jié)束，觀察種子的發(fā)芽形態(tài)，及測量其胚芽長度。

1.3.2丙二醛(MDA)含量及抗氧化酶活性測定 準確稱取0.5 g雜交狼尾草葉片于預冷的組織粉碎機中，加一定量的緩沖溶液研磨成勻漿，冷凍離心，上清即為酶提取液。超氧化物岐化酶(SOD)活性測定采用NBT氧化還原法[17]；過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)活性測定參照李高杰等[18]的方法；抗壞血酸酶(APX)活性的測定參照孫云[19]的方法；丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法[20]。

1.4分析方法及數(shù)據(jù)處理

記錄和統(tǒng)計種子的發(fā)芽形態(tài)，發(fā)芽率、胚芽長度、發(fā)芽指數(shù)。

種子發(fā)芽率=發(fā)芽的種子粒數(shù)/供試種子粒數(shù)×100%；

胚芽長度直接用尺子測量胚芽基部到胚芽頂部的距離；

發(fā)芽指數(shù)(GI)=∑(Dg/Dt)；

其中：Dt為相應的發(fā)芽日數(shù)，Dg為逐日發(fā)芽數(shù)。

采用Excel 2003進行數(shù)據(jù)的收集，統(tǒng)計數(shù)據(jù)利用Origin軟件進行作圖，運用SPSS 24.0軟件對各處理組的數(shù)據(jù)進行單因素ANOVA檢驗，選擇S-N-Ka均數(shù)比較法在P=0.05水平上進行比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1泛菌屬PP04在植物體內(nèi)的侵染率

在侵染3 d后的雜交狼尾草種子和幼苗內(nèi)，均驗證并檢測到了內(nèi)生菌，經(jīng)16S rDNA分子鑒定，證實這些細菌就是侵染所用的泛菌屬內(nèi)生細菌PP04。該菌株對種子的侵染效率較高，在0、100、200、300 mmol·L-1NaCl濃度下，分別達442 107.99、459 974.47、282 451.92、1 526.47 cfu·g-1,以100 mmol·L-1NaCl濃度處理最高。

2.2泛菌屬PP04對不同鹽濃度下雜交狼尾草種子萌發(fā)的影響

2.2.1種子萌發(fā)的形態(tài)特征 不同的鹽濃度條件下，胚芽和胚根生長的表現(xiàn)形態(tài)也不盡相同(圖1)。隨著鹽濃度的升高，植物的胚芽和胚根長度越來越短。在0和200 mmol·L-1鹽濃度下，E-組的胚芽高度和胚根長度都相對降低，植株相對矮小瘦弱，葉片狹窄。但在300 mmol·L-1的高鹽濃度下，E+組與E-組植物的胚芽和胚根的生長情況基本無差異，胚芽長度小于胚根，胚芽短小甚至無胚芽長出。說明在高鹽濃度(300 mmol·L-1)條件下，PP04內(nèi)生細菌對雜交狼尾草種子的萌發(fā)無明顯緩解鹽脅迫的作用。

圖1 泛菌屬PP04侵染7 d后對鹽脅迫條件下雜交狼尾草幼苗形態(tài)特征的影響Fig. 1 Effect of Pantoea sp. PP04 on the morphological characteristics of seedlings Pennisetum americanum×P. purpureum after 7 days under salinity stress

注：E-，未添加內(nèi)生菌對照組，E+，添加內(nèi)生菌處理組。下同。

Note: E-， Endophyte-free plant group； E+， Endophyte-inoculated plant group; similarly for the following figures.

2.2.2種子萌發(fā)率 隨著鹽濃度的升高，E-組雜交狼尾草的種子萌發(fā)率均呈下降趨勢(圖2)，可見鹽脅迫會抑制雜交狼尾草種子的發(fā)芽率。無鹽脅迫時，種子萌發(fā)率為90.00%，100 mmol·L-1的鹽濃度使發(fā)芽率降低了16.67百分點，200 mmol·L-1降低了34.72百分點，300 mmol·L-1降低了59.72百分點；E+組植物的發(fā)芽率也隨鹽濃度的增加而降低，無鹽脅迫時，種子萌發(fā)率為97.5%，100 mmol·L-1的鹽脅迫使其降低了6.41百分點，200、300 mmol·L-1分別使其減少了26.92百分點和64.10百分點。在100和200 mmol·L-1鹽處理下，E+組較E-組的增幅分別為21.28百分點和21.67百分點，兩組之間具有顯著性差異(P<0.05)。

2.2.3發(fā)芽指數(shù) E-組植物發(fā)芽指數(shù)在無鹽脅迫的情況下，達到38.82，在100、200、300 mmol·L-1鹽濃度條件下，種子的發(fā)芽指數(shù)分別降為27.47、15.94和9.70(圖3)。E+組種子的發(fā)芽指數(shù)隨鹽濃度的升高迅速降低，且各鹽濃度之間，發(fā)芽指數(shù)均有顯著差異(P<0.05)。在0、100和200 mmol·L-1時，E+處理的植物種子發(fā)芽指數(shù)都顯著高于E-組(P<0.05)。但在300 mmol·L-1的高濃度的鹽處理條件下，E+與E-組無顯著差異(P>0.05)。在中、低的鹽濃度脅迫下，內(nèi)生菌PP04能夠有效提高雜交狼尾草種子的發(fā)芽指數(shù)，但在高鹽濃度脅迫下，內(nèi)生菌對雜交狼尾草種子的發(fā)芽指數(shù)的提升作用不明顯。

2.2.4胚芽生長 E+組和E-組植物的胚芽長度均隨鹽濃度的升高而逐漸降低，且在200 mmol·L-1鹽濃度條件下，降低效果更明顯(圖4)。E-組植物在無鹽脅迫的條件下，胚芽長度可達5.44 cm，而當鹽濃度升高到100mmol·L-1時，胚芽長度僅下降為5.39cm，與無鹽脅迫相比，差異并不顯著(P>0.05)；因此，較低的鹽脅迫對雜交狼尾草種子的胚芽生長影響較小。但在200 mmol·L-1鹽濃度條件下，胚芽長度僅為0.58 cm，比無鹽處理下降了89.33%，兩者間差異顯著(P<0.05)；在300 mmol·L-1鹽濃度時，胚芽長度極短，約為0.20 cm。通過內(nèi)生菌的處理后，對于0、100和200 mmol·L-1處理組，E+組的植物胚芽長度都要明顯大于E-組，差異顯著(P<0.05)，增加幅度分別為23.83%、20.98%和241.38%。但在最高鹽濃度300 mmol·L-1條件下，內(nèi)生菌處理的種子胚芽長度與E-組無明顯差異。

圖2 泛菌屬PP04侵染對鹽脅迫下雜交狼尾草種子發(fā)芽率的影響Fig. 2 Effect of Pantoea sp. PP04 on the germination rate of Pennisetum americanum×P. purpureum seeds under salinity stress

注：不同字母表示不同處理間差異顯著(P>0.05)，下同。

Note: Different lowercase letters within the same cultivar and same salinity level indicate significant difference at the 0.05 level. similarly for the following figures.

圖3 泛菌屬PP04侵染對鹽脅迫下雜交狼尾草種子發(fā)芽指數(shù)的影響Fig. 3 Effect of Pantoea sp. PP04 on the germination index of Pennisetum americanum×P. purpureum under salinity stress

2.3泛菌屬PP04對鹽脅迫條件下雜交狼尾草丙二醛含量的影響

在無鹽及各鹽濃度脅迫下，接種內(nèi)生細菌PP04都能夠有效降低丙二醛的含量(圖5)。隨著鹽濃度的升高，E-植物體內(nèi)丙二醛的含量呈顯著升高趨勢，在鹽濃度為100、200及300 mmol·L-1時，與無鹽脅迫相比，其相對增幅分別為88.86%、149.20%和307.14%；E+組的植物體內(nèi)丙二醛含量雖然也隨著鹽濃度升高而逐漸升高，但顯著低于E-組(P<0.05)，3種鹽濃度下，降低幅度分別為49.47%、27.32%和17.36%。

圖4 泛菌屬PP04侵染對鹽脅迫下雜交狼尾草種子胚芽生長長度的影響Fig. 4 Effect of Pantoea sp. PP04 on the length of Pennisetum americanum×P. purpureum embryo under salinity stress

圖5 泛菌屬PP04侵染對鹽脅迫下雜交狼尾草幼苗葉片中丙二醛含量的影響Fig. 5 Effect of Pantoea sp. PP04 on the MDA content of Pennisetum americanum×P. purpureum leaves under salinity stress

2.4泛菌屬PP04對鹽脅迫條件下雜交狼尾草抗氧化酶活性的影響

在鹽脅迫條件下，施加內(nèi)生菌能明顯提高雜交狼尾草體內(nèi)SOD、POD、CAT、APX 4種保護酶的活性(圖6)。E-組SOD酶的活性均隨鹽濃度的升高先升高，在100 mmol·L-1時達到最大，然后在200和300 mmol·L-1鹽濃度下，SOD酶的活性保持不變。E+組SOD酶的活性隨鹽濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，也在100 mmol·L-1時達到最大，然后在200 mmol·L-1和300 mmol·L-1鹽濃度下，SOD酶的活性顯著降低。在100和200 mmol·L-1鹽濃度條件下， E+組SOD酶的活性均顯著高于E-組，增高幅度分別可達64.17%和28.04%。

E-組POD的活性隨鹽濃度的升高先顯著升高，在200 mmol·L-1時達到最大，到300 mmol·L-1時POD酶的活性略有降低(P>0.05)。E+組POD酶的活性隨鹽濃度的升高呈先顯著升高后顯著下降的趨勢，也在200 mmol·L-1時達到最大，在300 mmol·L-1鹽濃度下，POD酶的活性顯著降低。E+組POD酶活性在100、200 mmol·L-1都顯著高于E-組，增幅分別為73.14%、63.48%。

在不同鹽濃度脅迫下，E-組和E+組CAT的活性都隨鹽濃度的升高呈先升高后下降的趨勢，也在100和200 mmol·L-1時達到最大，在300 mmol·L-1鹽濃度下，CAT酶的活性顯著降低。E+組的雜交狼尾草CAT的活性都顯著高于E-組，在高鹽濃度(300 mmol·L-1)時，對比差異更顯著，增長幅度可達160.57%。

APX的活性變化趨勢與CAT相似，隨鹽濃度的升高呈先升高后下降，在200 mmol·L-1時達到最大。且E+組APX的活性較E-組均有顯著差異，增加幅度分別為83.86%(0 mmol·L-1)、65.41%(100 mmol·L-1)、47.14%(200 mmol·L-1)和73.38%(300 mmol·L-1)。

圖6 泛菌屬PP04侵染對鹽脅迫下雜交狼尾草葉片內(nèi)抗氧化酶活性的影響Fig. 6 Effect of Pantoea sp. PP04 on the antioxidase activities of Pennisetum americanum×P. purpureum leaves under salinity stress

3 討論

鹽脅迫對于種子萌發(fā)影響的研究已經(jīng)有不少報道，但不管對于鹽生植物和非鹽生植物，都會造成種子發(fā)芽率下降，種子初始萌發(fā)的時間推遲或延長[21]。劉玉艷等[22]發(fā)現(xiàn)鹽脅迫對二色補血草(Limoniumbicolor)種子的萌發(fā)具有明顯的抑制作用，種子萌發(fā)率與鹽濃度之間呈顯著的負相關(guān)關(guān)系。本研究也發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫對雜交狼尾草種子萌發(fā)具有明顯抑制作用，隨著鹽濃度的升高，種子萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)顯著下降，胚芽和胚根長度越來越短。說明雖然雜交狼尾草具有一定的耐鹽能力(耐鹽閾值達100 mmol·L-1)，但其種子對NaCl鹽脅迫反應敏感。因為對于很多物種來說，種子萌發(fā)和早期幼苗生長期是對鹽脅迫最敏感的階段[23]。甚至大部分鹽生植物，在無NaCl時種子萌發(fā)率達到最大，而種子萌發(fā)和早期發(fā)育階段對鹽濃度的升高非常敏感[24]。這可能是由于鹽脅迫下的滲透效應，抑制了種子萌發(fā)過程的水分正常吸入，也可能是由于NaCl的離子積累導致的營養(yǎng)吸收不平衡和毒害作用[25-26]。所以，在實際的雜交狼尾草育苗生產(chǎn)中，要盡量避免鹽脅迫對種子萌發(fā)的影響。但是，也有研究表明，低濃度的鹽脅迫反而能促進種子的萌發(fā)。如，低濃度(0.4%，68.4 mmol·L-1NaCl)鹽脅迫能促進荊條(Viternegundo)種子和白蠟(Fraxinusvelutina)種子的萌發(fā)[27]。小于50 mmol·L-1濃度NaCl能促進羅布麻(Apocynumvenetum)種子的萌發(fā)[28]。低濃度鹽(25.6 mmol·L-1NaCl)對雜交狼尾草發(fā)芽率無明顯影響，但對發(fā)芽指數(shù)有顯著提高[29]?？赡芤驗楸狙芯吭O定的鹽濃度較高(大于100 mmol·L-1NaCl)，所以并未觀察到鹽脅迫對種子萌發(fā)的增益作用。要了解低濃度鹽對種子的影響，需要設置更低濃度的鹽脅迫試驗進行進一步研究。

內(nèi)生菌作為一種促進植物生長發(fā)育、增強宿主抗逆性的天然資源，對鹽脅迫下植物種子的萌發(fā)具有顯著促進作用。如，鈕旭光等[30]發(fā)現(xiàn)內(nèi)生芽孢桿菌SE48和SE4能顯著提高小麥在鹽脅迫下種子的萌發(fā)率。王楠等[31]用氫氧化細菌WMQ7菌懸液浸種小麥，其發(fā)芽粒數(shù)、發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、胚芽、胚根長均有明顯的改善和提高，而且在低鹽脅迫下的效果比高鹽脅迫下的效果好。在本研究中，象草PP04內(nèi)生菌能夠有效緩解中(200 mmol·L-1)、低(100 mmol·L-1)鹽濃度脅迫對雜交狼尾草種子萌發(fā)的毒害作用，對種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、胚芽長度都有顯著的增益和改善作用。然而，在高鹽(300 mmol·L-1)脅迫條件下，內(nèi)生菌緩解鹽脅迫的毒害能力作用下降或不明顯，這與前人的研究結(jié)果基本一致。有研究推測其機制是，在一定的鹽脅迫下，施加內(nèi)生細菌可以促進植物對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收；改變植物體內(nèi)離子平衡；增加植物對水分的吸收和利用能力，從而增強種子萌發(fā)各指標，但過高的鹽脅迫容易引發(fā)種子胚細胞膜破裂，植物體內(nèi)的代謝失調(diào)，造成蛋白合成受阻及毒素積累等，從而導致內(nèi)生菌緩解鹽脅迫的能力受限[32-33]。但本研究中象草PP04內(nèi)生細菌促進中、低鹽濃度脅迫下雜交狼尾草種子的萌發(fā)機制，還需進一步深入研究。

植物在非生物脅迫條件下會形成過量的活性氧自由基(ROS)，對細胞膜系統(tǒng)具有破壞作用[34]。通常植物體內(nèi)的SOD、POD、CAT和APX等保護酶能夠清除多余的自由基，保護細胞膜結(jié)構(gòu)，從而減少逆境脅迫帶來的傷害[35-36]。所以，保護酶的活性大小可以間接反映植物的抗逆能力[37-38]。而丙二醛(Malondialdehyde，MDA)作為脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量的多少可代表細胞膜的受損程度[39]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨鹽濃度升高，雜交狼尾草體內(nèi)的MDA含量顯著升高，細胞膜受損；保護酶SOD、POD活性升高，然后保持較高的活性；CAT 和APX活性先增加后降低。這說明雜交狼尾草在低、中度鹽脅迫下，脂質(zhì)發(fā)生過氧化作用，細胞膜系統(tǒng)受到損傷，而體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)活性升高將體內(nèi)過多的自由基清除，降低鹽脅迫對膜系統(tǒng)的損傷。但是當NaCl濃度高于200 mmol·L-1時，脂質(zhì)發(fā)生更加嚴重的過氧化反應，此時SOD、POD活性保持不變，而CAT 和APX活性下降。高濃度鹽脅迫下，體內(nèi)的保護酶系統(tǒng)組成比例發(fā)生變化，雜交狼尾草主要通過SOD和POD保護酶來清除體內(nèi)的自由基。

有研究表明，內(nèi)生菌能通過誘導抗氧化保護酶活性，從而清除活性氧，增加植物抗逆性[40]。叢枝菌根真菌(Glomusmosseae)通過誘導保護酶系統(tǒng)，減少鹽對柑橘幼苗的脅迫作用[41]。 GM-1菌株(F.verticillioidesRK01)通過提高CAT、POD和SOD的活性，減少細胞膜氧化，促進大豆種子萌發(fā)率和植株的生長發(fā)育[42]。Ghorbanli等[43]也發(fā)現(xiàn)，在鹽脅迫下，菌根植物體內(nèi)SOD和POD酶活性較非菌根植物有顯著提高。本研究也表明，在不同濃度鹽脅迫下，PP04內(nèi)生菌能夠有效增加雜交狼尾草體內(nèi)SOD、POD、CAT和APX活性，減少膜脂過氧化產(chǎn)物MDA的積累，從而緩解鹽環(huán)境對雜交狼尾草造成的氧化脅迫，增強其耐鹽能力。但是，在不同鹽濃度下，各種酶活力水平不同。在無鹽脅迫時，PP04內(nèi)生細菌能夠增加雜交狼尾草體內(nèi)CAT和APX的活性，從而保護細胞膜，降低MDA積累。在100 mmol·L-1鹽脅迫下，PP04能夠顯著提高各保護酶的活性，但是SOD活性最高；當鹽濃度升高到200 mmol·L-1，SOD活性降低，而POD活性升高；當鹽濃度到300 mmol·L-1時，SOD和POD活性繼續(xù)降低，與E-差別不大；而CAT 和APX在低、中、高濃度鹽脅迫下一直保持較高的活性。這可能說明在不同濃度的鹽脅迫下，內(nèi)生菌PP04誘導不同的保護酶活性。但是關(guān)于內(nèi)生細菌PP04如何在不同鹽脅迫水平下，誘導不同的保護酶活性的調(diào)節(jié)機制需要進一步研究。

4 結(jié)論

本研究中，象草內(nèi)生細菌PP04能促進低、中度鹽脅迫下狼尾草種子的萌發(fā)；并通過誘導雜交狼尾草抗氧化保護酶活性，降低細胞膜損傷，增強其耐鹽能力，是開發(fā)生物肥料的優(yōu)良目標菌株，顯示出良好的應用前景。但是關(guān)于該內(nèi)生菌如何促進狼尾草種子的萌發(fā)，誘導保護酶活性，增強其耐鹽能力的機制需要進一步深入研究。另外，由于本研究是在實驗室條件下開展的，但實際上鹽土常含多種鹽分，不同無機離子之間存在著相互作用，且在逆境中還存在各種其他環(huán)境脅迫(干旱、病蟲害、金屬離子脅迫等)，都會影響雜交狼尾草的生長乃至生存。因此，關(guān)于象草內(nèi)生細菌對雜交狼尾草在實際鹽堿土壤條件乃至其他多逆境條件下的促生作用尚需做進一步的田間驗證。

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EndophyticbacteriacanmitigatesalinitystressonseedgerminationandphysiologyinhybridPennisetum

Fu Lei, Li Xia, Gao Lu, Jiang Jian-xiong, Sun Jian-zhong

(Biofuels Institute, School of Environmental and Safety Engineering, Jiangsu University, East China Branch, National Energy R & D Center for Non-food Biomass, Zhenjiang 212013, Jiangsu, China)

Endophytic bacteria have a broad spectrum of applications such as in plant disease prevention, pest insect suppression, plant growth promotion, and plant salt and drought tolerance; they, therefore, provide a valuable natural resource. This investigation was conducted to determine the influence of the endophytic bacteriumPantoeasp. PP04 on seed germination and seedling growth of hybridPennisetumunder low (100 mmol·L-1), medium (200 mmol·L-1), and high (300 mmol·L-1) salinity stress. The analysis showed that the endophyte PP04 had a significant positive impact on seed germination rate, germination index, and lengths of embryos under low and medium salinity stress, which would enhance their germination rate at 10.75%, 28.57%, and 300%, respectively. We also found that under different levels of salinity stress, this endophytic bacterium reduced lipid peroxidation of cell membranes in hybridPennisetumby inducing different antioxidant protective enzyme activities. As a consequence, the content of malondialdehyde (MDA) decreased. Under low and medium salinity stress, the endophytic bacterium significantly increased activity of superoxide dismutase (SOD), peroxidase (POD), catalase (CAT), and ascorbate peroxidase (APX) in hybridPennisetum. The greatest increases in SOD (64.17%) and POD (73.14%) activities occurred under low salinity stress. The largest increases in CAT (160.57%) and APX (73.38%) occurred under high salinity stress. Our results indicated that the endophyte PP04 significantly mitigated the damage caused by oxidative stress from salinity and improved the tolerance of plants to a salt stress environment. These results suggest that the endophyte PP04 has promising characteristics for future applications.

endophyte; hybridPennisetum; salinity stress; seed germination; seedling growth; oxidative stress

Sun Jian-zhong E-mail:jzsun1002@ujs.edu.cn

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江蘇省農(nóng)業(yè)自主創(chuàng)新資金(CX(15)-1005)；江蘇省自然科學基金青年基金項目(BK20160508)；江蘇大學高級人才啟動基金項目(11JBG076)；江蘇省自然科學基金青年基金項目(BK20130499)；國家自然科學基金青年項目(31601380)；國家自然科學基金面上項目(31671754)

傅蕾(1991-)，女，江蘇鎮(zhèn)江人，在讀碩士生，主要從事植物內(nèi)生菌研究。E-mail:18252585831@163.com

共同第一作者：李霞(1981-)，女，山東濟寧人，助理研究員，博士，主要從事能源植物遺傳改良及微生物肥料的開發(fā)。

E-mail：lixia1069@ujs.edu.cn

孫建中(1958-)，男，江蘇南通人，教授，博導，博士，主要從事消化木質(zhì)纖維素類自然生物系統(tǒng)的生物過程仿生、新型生物基材料以及草本能源植物研究。E-mail:jzsun1002@ujs.edu.cn

(責任編輯 王芳)