安 杰，尤 章，曹玉曼，任鵬輝，劉金隆，楊培志

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的制備

安 杰，尤 章，曹玉曼，任鵬輝，劉金隆，楊培志

(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

為了獲得紫花苜蓿(Medicagosativa)保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，并為后續(xù)的紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)，本研究探索了適合紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞的提取方法。利用研磨和勻漿機(jī)處理的方式獲得表皮條，將獲得的表皮條再通過兩步酶解法去除殘留的葉肉細(xì)胞和細(xì)胞壁，并經(jīng)多次過濾和離心獲得保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體。最后統(tǒng)計(jì)原生質(zhì)體數(shù)目并用FDA染色檢測(cè)保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體活性。結(jié)果表明,本研究成功分離并獲得了高活性的紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體。每5片成熟葉獲得1 000個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，經(jīng)FDA染色后在熒光下顯示活性保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體占90%以上。

紫花苜蓿；保衛(wèi)細(xì)胞；原生質(zhì)體制備；兩步法酶解；研磨；FDA染色

紫花苜蓿(Medicagosativa)是具有高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的多年生優(yōu)質(zhì)豆科牧草[1-2]，在我國(guó)西北地區(qū)有大面積的種植，但是西北干旱少雨的氣候使其產(chǎn)量受到嚴(yán)重的影響[3-4]。氣孔是植物葉片控制水分蒸騰、CO2進(jìn)入以及抵抗不良環(huán)境的重要器官[5]。在雙子葉植物中氣孔的開閉由兩個(gè)腎型的保衛(wèi)細(xì)胞調(diào)控。獲得純凈、高活力的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，再利用膜片鉗[6]、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序[7]等方法研究保衛(wèi)細(xì)胞的干旱響應(yīng)信號(hào)通路，可為紫花苜蓿的抗旱遺傳改良提供重要理論依據(jù)。

保衛(wèi)細(xì)胞是研究氣孔運(yùn)動(dòng)過程中信號(hào)傳導(dǎo)、離子轉(zhuǎn)運(yùn)等的模式試驗(yàn)材料[7]，獲得高純度，高活性的保衛(wèi)細(xì)胞是后續(xù)研究的重中之重。提取保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的方法在蠶豆(Viciafaba)[8]、洋蔥(Alliumcepa)[8]、擬南芥(Arabidopsisthaliana)[9]、煙草(Nicotianaglauca)[10]、玉米(Zeamays)[11]等植物中已有相關(guān)報(bào)道，但在紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的提取上仍是空白。對(duì)于不同的植物材料獲得保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的方式不盡相同。獲得表皮的方式主要有勻漿機(jī)打碎[9]和撕取表皮[12-13]等。酶解的方式有一步酶解法[14]和兩步酶解法[15]。酶液的配制也多種多樣，第1步酶解多用Cellulysin、Cellulase R-10，第2步酶解多用Cellulase RS、Cellulase R-10，此外細(xì)胞壁中還含有果膠、半纖維素，所以常在酶液中加入果膠酶和離析酶[16-32]。在保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體純化上使用的尼龍網(wǎng)的孔徑也因保衛(wèi)細(xì)胞大小不同而不同，一般為5～30 μm不等[16-21]。

由于紫花苜蓿表皮不易撕取、成熟葉片的纖維素含量較高、保衛(wèi)細(xì)胞體積較小，因此獲取紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體較為困難。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體提取的方法鮮有報(bào)道，所以很有必要摸索適合紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞提取的適宜條件，為紫花苜蓿的氣孔運(yùn)動(dòng)調(diào)控機(jī)理研究奠定基礎(chǔ)。

本研究在借鑒擬南芥[11]、煙草[12]及蠶豆[17]保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的提取的基礎(chǔ)上，開展紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞提取的研究。旨在探索出適合紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的提取方法，獲得純度高、活性強(qiáng)的紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1供試材料 供試的紫花苜蓿品種為雷達(dá)克之星，購(gòu)于北京克勞沃種業(yè)科技有限公司。

1.1.2紫花苜蓿的培養(yǎng) 紫花苜蓿種子經(jīng)75%酒精消毒15 s，用蒸餾水沖洗5次后，5%次氯酸鈉消毒5 min并用蒸餾水沖洗干凈。將種子均勻擺放在鋪有濾紙的培養(yǎng)皿上，放在人工培養(yǎng)間培養(yǎng)。生長(zhǎng)條件：光/暗周期為16 h/8 h，光源為熒光燈，光強(qiáng)96 μmol·(m2·s)-1，溫度25 ℃，濕度50%。在人工培養(yǎng)間培養(yǎng)5 d后將萌發(fā)均勻健壯的幼苗移栽至裝有營(yíng)養(yǎng)土的花盆中，并將花盆擺放在溫室(光/暗周期為16 h/8 h，光強(qiáng)216 μmol·(m2·s)-1，晝/夜溫度30/25 ℃，濕度50%)中。在幼苗生長(zhǎng)期間定期澆水，待60 d后，選取紫花苜蓿成熟葉片做為試驗(yàn)材料。

1.2試劑

1.2.1基礎(chǔ)溶液 5 mmol·L-1MES，0.55 mol·L-1山梨醇，0.5 mmol·L-1CaCl2，0.5 mmol·L-1MgCl2，0.5 mmol·L-1抗壞血酸，10 μmol·L-1KH2PO4，并用Tris-HCl調(diào)至pH 5.8。配置好的基礎(chǔ)溶液置于4 ℃可保存30 d。

1.2.2酶液Ⅰ 在55 %基礎(chǔ)溶液(基礎(chǔ)溶液∶水55∶45) 加入0.1%PVP-40，0.25%BSA，0.1% Macerozyme- R-10，1.0% Cellulase R-10(Yakuh Honsha Co．，Tokyo，Japan)。酶液Ⅰ現(xiàn)用現(xiàn)配，配制好的酶液Ⅰ用濾膜(孔徑0.22 μm)除菌后置于4 ℃ 可保存3～7 d。

1.2.3酶液Ⅱ 在基礎(chǔ)溶液中加入0.25% BSA，1.1% Onozuka RS(Yakuh Honsha Co．，Tokyo，Japan)，0.03% Pectolyase Y-23 (Yakuh Honsha Co．，Tokyo，Japan)。將配制好的酶液Ⅱ用HCl將pH調(diào)至3.5保持5 min后用Tris-HCl將pH調(diào)回 5.8 以消除其中的蛋白酶。酶液Ⅱ現(xiàn)用現(xiàn)配，配制好的酶液Ⅱ用濾膜(孔徑0.22 μm)除菌后置于4 ℃保存3～7 d。

1.2.4熒光素雙醋酸酯(Fluorescein Diacetate，F(xiàn)DA)染液 用丙酮配制 10 mmol·L-1FDA母液，工作液濃度為2.5 μmol·L-1，-20 ℃避光保存。

1.3方法

1.3.1紫花苜蓿葉片表皮的獲得 因?yàn)檐俎１砥ず腿~肉細(xì)胞黏連緊密不易撕取，所以分別采取研磨和勻漿機(jī)處理法獲得表皮。

研磨法獲得表皮：摘取紫花苜蓿成熟的葉片3～5片用手術(shù)刀去除各個(gè)小葉的主葉脈。將去掉主脈的小葉放入研缽中加入蒸餾水研磨(不加石英砂)，待大部分葉肉細(xì)胞破碎用74 μm尼龍網(wǎng)過濾并用蒸餾水沖洗剩余碎表皮條。觀察剩余碎表皮條中是否還存在大塊葉肉，若有則用鑷子挑出并再次研磨過濾，直到最終獲得的碎表皮條中無明顯深綠色組織。

勻漿機(jī)處理獲得表皮：因勻漿機(jī)需要大量葉片才能達(dá)到勻漿效果，故操作時(shí)向勻漿機(jī)中加入去除主葉脈的50片紫花苜蓿小葉并加入500 mL蒸餾水，12 000 r·min-1研磨兩次，每次研磨30 s。將研磨后的碎表皮條用 74 μm尼龍網(wǎng)過濾并用蒸餾水反復(fù)沖洗剩余碎表皮條，若有大塊未打碎的表皮條用鑷子挑出并棄掉。

1.3.2第1步酶解 參照Zhu等[15]少量提取的方法并略有改動(dòng)。將碎表皮條放入10 mL燒杯中并加入2 mL的酶液Ⅰ。用錫箔紙將燒杯包裹并放入28 ℃搖床中，120 r·min-1搖床震蕩1 h。震蕩1 h后用注射器向燒杯中注入2 mL基礎(chǔ)溶液，再在同樣條件下震蕩5 min。震蕩結(jié)束后用74 μm尼龍網(wǎng)過濾收集表皮條，并用基礎(chǔ)溶液沖洗。

1.3.3第2步酶解 將上述表皮條轉(zhuǎn)移到新的10 mL燒杯中并加入2 mL酶液Ⅱ。用錫箔紙將燒杯包裹并放入20 ℃搖床中，50 r·min-1搖床震蕩2 h后，每30 min做一次鏡檢，直到大部分保衛(wèi)細(xì)胞細(xì)胞壁酶解原生質(zhì)體變?yōu)閳A形即可停止酶解。用膠頭滴管輕輕吹吸酶解液數(shù)次，以利于保衛(wèi)細(xì)胞的釋放。

1.3.4收集原生質(zhì)體 將上述酶解液用孔徑10 μm尼龍網(wǎng)過濾并用15 mL離心管收集濾液，接著用10 mL基礎(chǔ)溶液沖洗濾網(wǎng)上的碎表皮，使粘連的保衛(wèi)細(xì)胞進(jìn)一步釋放出來，用同一個(gè)離心管收集濾液。將離心管放入離心機(jī)在 200 r·min-1下離心5 min，快速倒去上清液，用300～500 μL基礎(chǔ)溶液重新懸浮沉淀，再重復(fù)3～4次上述步驟以去除雜質(zhì)。最終用200 μL基礎(chǔ)溶液懸浮原生質(zhì)體，并抽取20 μL鏡檢統(tǒng)計(jì)懸浮液中所有保衛(wèi)細(xì)胞數(shù)量，重復(fù)3次，最后計(jì)算其平均值并乘以10即為提取保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體數(shù)量的粗略估計(jì)值。

1.3.5保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體活性檢測(cè) 取原生質(zhì)體提取液滴于載玻片上，將配制好的FDA母液稀釋至終濃度2.5 μmol·L-1，在室溫下孵育5 min后在 488 nm熒光下檢測(cè)原生質(zhì)體活性。

2 結(jié)果與分析

2.1研磨與勻漿機(jī)獲得其皮及提取的原生質(zhì)體效果對(duì)比

研磨方法獲得的表皮(圖1A)比勻漿機(jī)獲得的表皮(圖1B)含更少的葉肉細(xì)胞。通過研磨方式最終獲得的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體中只有少量葉肉細(xì)胞的葉綠體殘?jiān)?圖2A)，而通過勻漿機(jī)處理最終獲得的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體中混有完整的葉肉細(xì)胞(如箭頭所示)以及葉綠體殘?jiān)?圖2B)。

圖1 研磨與勻漿機(jī)處理獲得的表皮對(duì)比Fig. 1 Comparison of epidermis obtained by grinding and blending

圖2 研磨與勻漿機(jī)處理獲得的原生質(zhì)體對(duì)比Fig. 2 Comparison of protoplasts obtained by grinding and blending

2.2保衛(wèi)細(xì)胞提取

在酶解開始前可以清晰地看到表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁，并且表皮連有少量殘余的葉肉細(xì)胞(圖3A)。在第1步酶解后，表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁開始降解并開始變得模糊，保衛(wèi)細(xì)胞的輪廓開始變得明顯，同時(shí)粘連的葉肉細(xì)胞變少(圖3B)。第2步酶解2 h后保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體開始膨脹，有的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體從氣孔位置脫離出來，表皮細(xì)胞細(xì)胞壁進(jìn)一步模糊(圖3C)。第2步酶解2 h后每半小時(shí)鏡檢一次直到50%保衛(wèi)細(xì)胞的細(xì)胞壁消失而變圓即可停止酶解進(jìn)行純化(圖3D)。純化后的基礎(chǔ)溶液中基本沒有表皮細(xì)胞和葉片上的絨毛，僅有少量附著在保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體上的葉肉細(xì)胞葉綠體，以及一些酶解后的殘?jiān)痛罅康谋Ｐl(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體(圖3E)。按1.3.4的方法將所得保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體進(jìn)行計(jì)數(shù)，每5片成熟葉片可獲得1 000個(gè)以上的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體(表1)。經(jīng)過FDA染色后，高活性的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體在488 nm的激發(fā)光下發(fā)出綠色熒光，同時(shí)保衛(wèi)細(xì)胞的葉綠體在此波長(zhǎng)下可發(fā)出紅色熒光，最終獲得的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體均發(fā)出綠色熒光，并可以看見保衛(wèi)細(xì)胞葉綠體所發(fā)出的紅光(圖3F)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)活性保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體在90 %以上(表1)。

3 討論與結(jié)論

要獲得盡可能只含保衛(wèi)細(xì)胞的葉片表皮是保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體制備的關(guān)鍵步驟，除了研磨法和勻漿法外，本研究在提取紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞初期時(shí)曾經(jīng)嘗試通過撕取紫花苜蓿表皮獲得表皮條，但效果不理想。經(jīng)對(duì)效比后發(fā)現(xiàn)，在獲得表皮的純凈度方面，研磨法較勻漿法果更佳。但在需要大量原生質(zhì)體時(shí)，研磨方式過于費(fèi)時(shí)費(fèi)力，所以可采用勻漿機(jī)操作獲得大量表皮，但最終純度會(huì)受到影響。

圖3 保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體提取Fig. 3 Isolation of the guard cell protoplasts

表1 每5片成熟葉可獲得原生質(zhì)體數(shù)和有活性保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體數(shù)Table 1 Number of guard cell protoplasts(GCP) and viable guard cell protoplasts for every 5 leaves

基礎(chǔ)溶液有采用山梨醇和甘露醇兩種調(diào)節(jié)滲透壓的配制方法。本研究推薦采用山梨醇，因?yàn)楦事洞紩?huì)在水分蒸發(fā)后結(jié)晶影響后續(xù)試驗(yàn)和鏡檢觀察。酶液的配制因植物材料不同也不盡相同[22-28]。本研究參考Zhu等[15]提取蠶豆保衛(wèi)細(xì)胞的方法獲得了較好的效果。此外在酶解過程中最好時(shí)常取少量酶解中的表皮進(jìn)行鏡檢，檢查保衛(wèi)細(xì)胞是否完整，若某一步鏡檢發(fā)現(xiàn)保衛(wèi)細(xì)胞大量破裂應(yīng)停止酶解，找出原因再重新進(jìn)行試驗(yàn)。

此外，在離心純化后的基礎(chǔ)溶液中會(huì)有少量葉肉細(xì)胞，這是由于一些葉肉細(xì)胞原生質(zhì)體稍大于保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，并且尼龍網(wǎng)規(guī)格并不標(biāo)準(zhǔn)導(dǎo)致過濾不夠充分造成的。同時(shí)，也會(huì)有少量葉綠體的污染，這是因?yàn)槿~肉細(xì)胞原生質(zhì)體破裂后葉綠體會(huì)進(jìn)入酶解液中[15]，并且葉綠體體積小于保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體體積，因此，并不會(huì)被尼龍網(wǎng)篩掉。但葉綠體RNA并沒有PolyA結(jié)構(gòu)，所以少量的葉綠體存在并不影響后續(xù)的RNA-seq、膜片鉗等試驗(yàn)。

FDA染色后，在488 nm下高活性的原生質(zhì)體會(huì)呈綠色，活性一般的會(huì)呈黃色，沒有活性的原生質(zhì)體因膜結(jié)構(gòu)不完整而會(huì)呈紅色。本研究所獲得的有活性的原生質(zhì)體占所有原生質(zhì)體90%以上，該結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[29-30]。此外，本研究中每5片成熟的紫花苜?？色@得保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體1 000個(gè)以上，Zhu等[15]在擬南芥的研究中每4～6片單葉可獲得200～300個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，而Kruse等[17]可以在每片蠶豆葉片中提取9 000個(gè)保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體。這可能是由于植物材料、氣孔的密度等不同和葉片大小不一樣導(dǎo)致獲得的原生質(zhì)體在數(shù)量上存在較大差異[31-32]。

同時(shí)，本研究仍存在一些不足，需進(jìn)一步改進(jìn)。比如獲得的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體中仍混有葉肉細(xì)胞、少量葉綠體、酶解后的碎渣等雜質(zhì)，這是因?yàn)槠潴w積比保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體要小。在今后的研究中還需探索出適合紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體純化的密度梯度離心條件以及采用孔徑精度更高的尼龍網(wǎng)。

本研究首次摸索出適合紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的提取方法，獲得的了高活性的保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體，可為后續(xù)的膜片鉗、保衛(wèi)細(xì)胞RNA測(cè)序等相關(guān)研究提供可靠的試驗(yàn)材料。

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PreparationofguardcellprotoplastsfromMedicagosativa

An Jie, You Zang, Cao Yu-Man, Ren Peng-hui, Liu Jin-long, Yang Pei-zhi

(College of Animal Science and Technology, Northwest A&F University, Yangling 712100, Shaanxi, China)

To obtain protoplasts of alfalfa (Medicagosativa) guard cells and lay the foundation for further research into guard cell protoplasts, the utility of a method for extracting guard cells from alfalfa leaves was explored. Epidermal peels were obtained by grinding and using a blender. Two-step enzyme digestion was used to remove mesophyll cells from the epidermal peels and guard cell walls; guard cell protoplasts were obtained through repeated filtration and centrifugation. Finally, the number of protoplasts was counted and their viability was assessed by fluorescein diacetate (FDA) staining. The results showed that this method yielded alfalfa guard cell protoplasts in an efficient manner, with 1 000 protoplasts isolated from samples of five leaves and a rate of viable guard cell protoplasts of more than 90%.

alfalfa； guard cell； protoplasts preparation； two-step enzyme digestion

Yang Pei-zhi E-mail：yangpeizhi@126.com

10.11829/j.issn.1001-0629.2016-0598

安杰，尤章，曹玉曼，任鵬輝，劉金隆，楊培志.紫花苜蓿保衛(wèi)細(xì)胞原生質(zhì)體的制備.草業(yè)科學(xué),2017,34(10)：2063-2069.

An J,You Z,Cao Y M,Ren P H,Liu J L,Yang P Z.Preparation of guard cell protoplasts fromMedicagosativa.Pratacultural Science，2017,34(10)：2063-2069.

S541+.1;Q944.4

A

1001-0629(2017)10-2063-07

2016-12-03

2017-01-25

國(guó)家自然科學(xué)基金(31572456);國(guó)家牧草產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(CARS-35-40)

安杰(1992-)，男，山西大同人，在讀碩士生，研究方向?yàn)樽匣ㄜ俎？鼓嫘匝芯俊-mail：18700943011@163.com

楊培志(1977-)，男，河北衡水人，副教授，博士，研究方向?yàn)槟敛萦N、逆境生理及分子生物學(xué)。E-mail：yangpeizhi@126.com

(責(zé)任編輯 張瑾)

2017年9月國(guó)際市場(chǎng)主要畜產(chǎn)品與飼料價(jià)格分析

9月國(guó)際飼料價(jià)格普遍出現(xiàn)上漲，而畜產(chǎn)品價(jià)格普遍持續(xù)下跌。

一、除玉米和菜籽價(jià)格持續(xù)下跌外，其他飼料價(jià)格普遍出現(xiàn)上漲

9月份美國(guó)玉米和菜籽市場(chǎng)價(jià)格分別為136.33和377.32 USD·t-1，環(huán)比分別下跌2.60%和2.25%。而大豆、高粱、豆粕、豆粉、棉籽餅和苜蓿粉市場(chǎng)平均價(jià)格分別為352.44、137.89、335.64、295.99、231.39和207.94 USD·t-1，環(huán)比分別上漲2.00%、6.89%、2.06%、2.92%、2.37%和0.94%，其中漲幅最大為高粱，上漲6.89%；苜蓿粉漲幅最小，為0.94%。

二、除育肥牛、羊肉和羊羔肉市場(chǎng)平均價(jià)格持續(xù)上漲外，其他畜產(chǎn)品價(jià)格持續(xù)下跌

9月份美國(guó)育肥牛和新西蘭羊肉、羊羔肉市場(chǎng)平均價(jià)格分別為3.28、3.58和6.05 UDD·kg-1，環(huán)比依次上漲3.47%、0.94%和1.20%。而瘦肉豬、牛奶、牛肉和歐盟雞肉、豬肉市場(chǎng)價(jià)格持續(xù)下跌，平均價(jià)格分別為1.30、0.31、4.57、2.40和1.30 USD·kg-1，其中瘦肉豬價(jià)格跌幅最大，環(huán)比下降20.00%，其他畜產(chǎn)品環(huán)比依次下跌4.53%、2.00%、0.35%和3.90%。

圖1 2017年9月國(guó)際市場(chǎng)主要飼料與畜產(chǎn)品價(jià)格

數(shù)據(jù)來源：國(guó)際市場(chǎng)商品價(jià)格網(wǎng)http://price.mofcom.gov.cn/；中國(guó)農(nóng)業(yè)信息http://www.agri.gov.cn/；雞肉http://www.indexmundi.com/；羊肉http://interest.co.nz/rural；牛肉http://www.thebeefsite.com/；豬肉http://www.thepigsite.com/；貨幣匯率 http://qq.ip138.com/hl.asp。

(蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院 楊春濤 整理)