吉津 郭琴 章若畫 李明

210000南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院皮膚科（吉津、郭琴、章若畫）；上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院皮膚科（李明）

1型神經(jīng)纖維瘤病NF1基因突變檢測(cè)

吉津 郭琴 章若畫 李明

210000南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中醫(yī)院皮膚科（吉津、郭琴、章若畫）；上海交通大學(xué)附屬新華醫(yī)院皮膚科（李明）

目的檢測(cè)1例1型神經(jīng)纖維瘤病（NF1）患者NF1基因的突變。方法采用PCR和DNA測(cè)序法檢測(cè)1例NF1患者、2例直系親屬及100例無親緣關(guān)系的正常人NF1基因突變。結(jié)果在NF1患兒中檢測(cè)到1個(gè)移碼突變c.3822delC，患者直系親屬及100例無親緣關(guān)系的正常對(duì)照均未檢測(cè)到上述突變。結(jié)論在該例NF1患兒中新發(fā)現(xiàn)1個(gè)NF1基因移碼突變c.3822delC不是罕見的單核苷酸多態(tài)性，可能是致病突變，通過影響NF1基因的功能致病。

神經(jīng)纖維瘤病1型；基因，神經(jīng)纖維瘤病1型；突變

目前認(rèn)為1型神經(jīng)纖維瘤?。╪eurofibromatosis type 1，NF1，OMIM：162200）主要是由NF1基因突變所致［1］。本研究通過PCR及DNA測(cè)序法檢測(cè)1例NF1患兒的NF1基因突變情況。

一、病例與方法

1.臨床資料：患兒男，2歲；1月齡時(shí)軀干部出現(xiàn)咖啡斑，逐漸增大增多。發(fā)育欠佳，語言能力較差。皮膚科檢查：軀干、四肢未捫及皮下結(jié)節(jié)，全身遍布咖啡色斑，腋下散在雀斑樣痣皮損。診斷：NF1?；純簽樯l(fā)病例，家族中只有1例患病，患兒父母正常，非近親婚配，無相同疾病家族史。本研究經(jīng)過江蘇省中醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患兒監(jiān)護(hù)人及正常對(duì)照者均簽署知情同意書。

2.DNA提取：抽取患兒及患兒父母的靜脈血3 ml，放置于5 ml EDTA抗凝管中，-80℃儲(chǔ)存。采用鹽析法提取基因組DNA，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)：DNA濃度 ＞ 100 ng/μl，總量 ＞ 5 μg，A260/A280比值范圍在1.8～2.0之間。同時(shí)提取100例無親緣關(guān)系、門診確診無NF1病史的正常人基因組DNA作為對(duì)照，以排除基因的多態(tài)性。

3.引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增：利用（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）數(shù)據(jù)庫獲得NF1基因組序列，應(yīng)用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)NFI基因外顯子引物：擴(kuò)增第28號(hào)外顯子正向引物5′?ATTCAGTATTCGCTGAGTTCC?3′；反向引物5′?TACCTATTAG CCTCTTTCCCT?3′，PCR反應(yīng)體系為30 μl：ddH2O 16 μl，10 × 緩沖液 3 μl，dNTP 混合物（10 μmol/L）3 μl，MgCl22 μl，引物 F（10 μmol/L）1.5 μl，引物R（10 μmol/L）1.5 μl，Ex Taq 1 μl，模板DNA 2 μl。PCR反應(yīng)在Biomometra PCR儀（德國Biometra公司）上進(jìn)行，采用Touchdown反應(yīng)程序。預(yù)變性94℃5 min，變性94℃30 s，退火64℃30 s、延伸72℃60 s，前14個(gè)循環(huán)每循環(huán)退火溫度下降0.5℃，14個(gè)循環(huán)后降至57℃，再以57℃為退火溫度進(jìn)行31個(gè)循環(huán)，延伸72℃5 min。

4.DNA測(cè)序：PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證、純化后測(cè)序，用ABI 3130遺傳分析儀進(jìn)行序列分析，通過Chromas V2.23軟件比對(duì)分析測(cè)序數(shù)據(jù)。用chromas軟件（版本2.0）分析基因序列，確定突變位點(diǎn)。

圖1 1型神經(jīng)纖維瘤?。∟F1）基因突變 患者NF1基因存在移碼突變，即c.3822delC（p.F1275SX10）。對(duì)照為患者父親NF1基因序列。圖中箭頭所示為突變位點(diǎn)

二、結(jié)果

發(fā)現(xiàn)1個(gè)移碼突變，c.3822delC（圖1）。擴(kuò)增cDNA進(jìn)一步檢測(cè)，確實(shí)發(fā)生單堿基缺失導(dǎo)致移碼突變。在患兒6例正常的直系家屬及100例無血緣關(guān)系的正常對(duì)照中均未檢測(cè)到上述突變，證明其不是罕見的單核苷酸多態(tài)性（SNP）。

三、討論

NF1基因的外顯率為100%，意味著所有攜帶NF1突變的患者均會(huì)發(fā)生NF1。超過92%符合NIH診斷標(biāo)準(zhǔn)的NF1患兒通過廣泛的基因測(cè)序均能檢測(cè)到NF1突變［2?3］。當(dāng)成年患者在臨床上僅表現(xiàn)為牛奶咖啡斑及腋窩散在雀斑而不伴有神經(jīng)纖維瘤時(shí)，分子檢測(cè)對(duì)于NF1的確診有幫助。此種符合NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)具有輕微的顯型患者可能是Legius綜合征，其突變基因?yàn)镾PRED1［4］。Leguis綜合征不會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)纖維瘤及眼部Lisch結(jié)節(jié)。相似的癥狀源于兩者不同的受累基因編碼同一反應(yīng)通路的蛋白，缺乏腫瘤生長是二者很重要的不同點(diǎn)。約2%臨床符合NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)的患者實(shí)際上包含SPRED1突變［5］，意味著有必要對(duì)臨床高度懷疑或者確診為NF1的患者進(jìn)行NF1及SPRED1基因篩查，作為確診NF1的必要條件。因?yàn)槎叩念A(yù)后不同，臨床的隨訪程度會(huì)有相應(yīng)的差別。

目前NF1基因已報(bào)道1 382個(gè)突變，包括錯(cuò)義突變、無義突變、剪切突變、插入突變、缺失突變及重復(fù)片段等多種類型。其中插入、缺失導(dǎo)致的移碼突變占所有突變類型的54%，剪切突變占21%。說明本病主要是由于NF1基因突變后單倍體效應(yīng)不足所致［6］。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)1個(gè)移碼突變，第28號(hào)外顯子c.3822delC，第1275位氨基酸之后10位提前形成終止密碼子，很可能對(duì)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生較大影響。該突變位點(diǎn)既往未見報(bào)道，為NF1新的突變位點(diǎn)。NF1基因具有較高的突變頻率。據(jù)統(tǒng)計(jì)，接近一半的患者發(fā)生的突變?yōu)樽陨硇掳l(fā)突變，無家族遺傳史［7］。散發(fā)的種系NF1基因突變表現(xiàn)出性別偏倚，大多數(shù)（＞80%）的新突變是父系來源的，而大多數(shù)所謂的染色體微缺失似乎是母系來源的［8］。染色體微缺失包括整個(gè)NF1基因及其翼區(qū)。目前僅有2種NF1基因關(guān)于基因型和表現(xiàn)型的關(guān)系是已知的：1種是NF1基因染色體微缺失，可導(dǎo)致嚴(yán)重的1型神經(jīng)纖維瘤病，表現(xiàn)為更高的神經(jīng)纖維瘤風(fēng)險(xiǎn)，軀體形態(tài)異常及學(xué)習(xí)障礙；第2種為17外顯子3?bp的框內(nèi)缺失，多數(shù)患者表現(xiàn)為較輕的臨床癥狀，伴有NF1典型的色素沉著特征（牛奶咖啡斑、腋窩及腹股溝雀斑）和Lisch結(jié)節(jié)，但并不會(huì)進(jìn)展出皮膚或臨床可檢測(cè)出的從狀神經(jīng)纖維瘤［8］。除了生殖細(xì)胞發(fā)生的種系突變外，NF1還存在體細(xì)胞的突變，導(dǎo)致患者出現(xiàn)“鑲嵌現(xiàn)象”（節(jié)段型1型神經(jīng)纖維瘤?。┗蚓窒抻谏眢w某一部位的1型神經(jīng)纖維瘤病。

本研究發(fā)現(xiàn)的突變豐富了NF1突變譜，為疾病的機(jī)制研究和基因型與表現(xiàn)型關(guān)系的研究提供了一定的依據(jù)，并為進(jìn)行遺傳咨詢及產(chǎn)前診斷提供了一定的幫助。

［1］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole?body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno?matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ?39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［2］Ahlawat S,Fayad LM,Khan MS,et al.Current whole?body MRI applications in the neurofibromatoses:NF1,NF2,and schwanno?matosis［J］.Neurology,2016,87（7 Suppl 1）:S31 ?39.DOI:10.1212/WNL.0000000000002929.

［3］Messiaen L,Callens T,Mortier G,et al.Exhaustive mutation analysis of the NF1gene allows identification of 95%of mutations and reveals a highfrequency of unusual splicing defects.Hum Mutat 2000,15（6）:541?555.DOI:10.1002/1098?1004（200006）15:6＜541::AID?HUMU6＞3.0.CO;2?N.

［4］Brems H,Chmara M,Sahbatou M,et al.Germline loss?of?function mutations in SPRED1 cause a neurofibromatosis 1?like phenotype［J］.NatGenet,2007,39（9）:1120?1126.DOI:10.1038/ng2113.

［5］Messiaen L,Yao S,Brems H,et al.Clinical and mutational spectrum of neurofibromatosis type 1?like syndrome［J］.JAMA,2009,302（19）:2111?2118.DOI:10.1001/jama.2009.1663.

［6］Brems H,Beert E,de Ravel T,et al.Mechanisms in the pathogenesis of malignant tumours in neurofibromatosis type 1［J］.Lancet Oncol,2009,10（5）:508?515.DOI:http://dx.doi.org/10.1016/S1470?2045（09）70033?6.

［7］Beert E,Brems H,Renard M,et al.Biallelic inactivation of NF1 in a sporadic plexiformneurofibroma［J］.Genes Chromosomes Cancer,2012,51（9）:852?857.DOI:10.1002/gcc.21969.

［8］Jouhilahti EM,Peltonen S,Heape AM,et al.The pathoetiology of neurofibromatosis 1［J］.Am J Pathol,2011,178（5）:1932?1939.DOI:10.1016/j.ajpath.2010.12.056.

Mutation detection of NF1 gene in a patient with neurofibromatosis type 1

Ji Jin,Guo Qin,Zhang Ruohua,Li Ming

Department of Dermatology,Jiangsu Province Hospital of TCM,Affiliated Hospital of Nanjing University of TCM,Nanjing 210023,China（Ji J,Guo Q,Zhang RH）;Department of Dermatology,Xin Hua Hospital Affiliated to Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Nanjing 200092,China（Li M）

Li Ming,Email:aypyslm@163.com

ObjectiveTo detect NF1 gene mutations in a patient with neurofibromatosis type 1（NF1）.MethodsPolymerase chain reaction（PCR）and DNA sequencing were performed to detect mutations of the NF1 gene in a patient with NF1,his parents and 100 unrelated healthy controls.ResultsA novel frameshift mutation（c.3822delC）was identified in the patient,but not found in his parents or the unrelated healthy controls.ConclusionThe novel frameshift mutation（c.3822delC）found in the patient is not a rare single nucleotide polymorphism（SNP）,and may be a causative mutation for NF1 by affecting the function of the NF1 gene.

Neurofibromatosis 1;Genes,neurofibromatosis 1;Mutation

李明，Email：aypyslm@163.com

10.3760/cma.j.issn.0412?4030.2017.06.013

2016?06?22）

（本文編輯：顏艷）