魏林+梁志懷+成燕清

摘 要：應(yīng)用蓮籽萌發(fā)的實生苗浸根接種鐮刀菌腐敗病病原，根據(jù)接種實生苗葉片表現(xiàn)出的腐敗病癥狀分級標準，對病害等級進行鑒定，進而確定子蓮品種對腐敗病菌的抗病能力。該方法實現(xiàn)了室內(nèi)快速、準確鑒定不同子蓮品種對鐮刀菌腐敗病的抗性。

關(guān)鍵詞：蓮籽；鐮刀菌腐敗??；快速鑒定；抗性

中圖分類號： S645.1；S436.45 文獻標識碼：A 文章編號：1001-3547（2017）18-0154-03

子蓮屬睡蓮科植物，是中國蓮三大品系（藕蓮、子蓮、花蓮）栽培品種之一，因其具有觀賞價值高的蓮花、味美可口的鮮食嫩籽、可加工成各種營養(yǎng)豐富食品的老熟蓮籽，在我國具有十分悠久的種植歷史。近年來，隨著種植業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，我國的子蓮種植面積有了較大幅度增加，已成為蓮農(nóng)創(chuàng)收的重要

途徑。

子蓮從浮葉生出到蓮蓬采收的整個生育期，都會受到腐敗病的為害，該病可使子蓮地下莖腐爛壞死，地上部枯萎，一般造成子蓮減產(chǎn)20%～45%，嚴重時達60%以上，甚至絕收，嚴重影響了蓮籽的品質(zhì)和產(chǎn)量。蓮腐敗病主要是由鐮刀菌屬真菌侵染引起的一種土傳病害，該病首先為害子蓮的地下莖（藕節(jié)），地下部受到病原菌的侵染出現(xiàn)病變后，病莖生出的地上部葉片和葉柄才逐漸顯癥。由于蓮鐮刀菌腐敗病發(fā)生時種植環(huán)境的特殊性、地上部顯癥明顯的滯后性以及荷葉特殊的納米結(jié)構(gòu)使得藥液難附著性，都增加了該病的防治難度，使得常規(guī)的防治措施很難取得較好的防控效果。因此，選育和種植抗病品種是防治該病經(jīng)濟有效的方法之一，其中建立便利高效的子蓮抗腐敗病的鑒定評價體系和方法，是開展該項工作的基礎(chǔ)。本研究應(yīng)用蓮籽實生苗，通過人工接種腐敗病菌，并根據(jù)實生苗葉片發(fā)病特點制定了相應(yīng)的發(fā)病程度分級標準及品種抗性等級，獲得了一套子蓮抗腐敗病室內(nèi)鑒定技術(shù)，實現(xiàn)了不同子蓮品種對鐮刀菌腐敗病抗性的室內(nèi)快速、準確鑒定。現(xiàn)將該方法介紹如下。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

①供試病原菌 從腐敗病病組織分離經(jīng)過單胞分離純化后，再通過形態(tài)學(xué)、柯赫氏法則驗證、分子鑒定確定的蓮真菌性腐敗病病原菌——尖孢鐮刀菌蓮?；汀?/p>

②供試子蓮 選擇顆粒飽滿、充分成熟的當年蓮籽作為供試材料。

③感病對照和抗病對照的選擇 選擇當?shù)刂髟缘?、歷年腐敗病發(fā)生較為嚴重的品種，作為感病對照；選擇當?shù)刂髟缘?、歷年腐敗病發(fā)生較輕的品種，作為抗病對照。

1.2 試驗方法

①子蓮腐敗病病原菌強致病性菌株的篩選 供試腐敗病鐮刀菌病原菌用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，用無菌打孔器自菌落邊緣取7 mm的菌餅，縱剖切取大小一致的新鮮藕塊，將菌餅置于藕塊的中央位置，菌絲體面朝下，每個藕塊等距離接種2個鐮刀菌菌餅，然后將裝有已接種藕塊的發(fā)芽盒置于26℃恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)5～7 d。按下述分級標準調(diào)查藕塊發(fā)病情況：0 級，藕塊生長正常、完好；

1 級，藕塊表面有輕微病變，病變尚未侵及藕塊體內(nèi)組織；2 級，藕塊組織有明顯病變，維管束呈褐色；3 級，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的 10%以下；4 級，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的 10%～30%；5 級，藕塊維管束呈深褐色，病變部分占藕塊總面積的 30%以上。每個藕塊為一計量單位，每種病原菌接種20個藕塊。病情指數(shù)=∑（各級藕塊數(shù)×相對級數(shù)值）/（調(diào)查總藕塊數(shù)×5）×100；其致病力強弱的劃分標準：病情指數(shù)>70，表示強致病力；30<病情指數(shù)≤70，表示中致病力；病情指數(shù)≤30，表示弱致病力；病情指數(shù)為0，表示無致病力。選取強致病性菌株作為子蓮品種抗病鑒定的接種菌株。

②接種體的繁育 將保存于PDA斜面培養(yǎng)基中的腐敗病菌株移植于PDA平板培養(yǎng)基上，在25℃條件下培養(yǎng)，待菌株菌絲長滿培養(yǎng)皿后，在無菌條件下，接種于盛有PD培養(yǎng)液的三角瓶中（液體培養(yǎng)基的量以占三角瓶容量的30%～35%為宜），25℃下120 r/min振蕩培養(yǎng)7 d，培養(yǎng)液經(jīng)2層滅菌紗布過濾，再經(jīng)4 000 r/min 離心10 min，倒掉上清液后，加入滅菌蒸餾水調(diào)制成分生孢子濃度為

1×105個/mL的接種體懸浮液。

③鑒定材料的培育 將當年生的蓮籽，用尖嘴鋼鉗把含蓮籽種臍一端破一小口后，完全浸沒于無菌水中。待種子發(fā)芽后，將發(fā)芽蓮籽移植適宜水培的容器，倒入剛好浸沒蓮籽的適量滅菌水，于25℃條件下培育。

④鑒定材料的接種及接種后的管理 當發(fā)芽的蓮籽長至具3～5條根的實生苗（此時一般有3～5片葉）時，用滅菌的剪刀將每條根在距根尖0.5 cm處剪斷，以造成根系的微傷口，然后將整個根系浸入由無菌水調(diào)節(jié)的含1×105個孢子/mL接種體懸浮液中30 min，以浸泡等體積無菌水的實生苗為對照。將接種后的實生苗移栽至盆缽中栽培，栽培土為滅菌的砂壤土。每個材料重復(fù)3次，每重復(fù)20株苗。接種室的溫度保持在24～26℃，栽種缽內(nèi)始終保持有1～2 cm的水層。

1.3 鑒定材料病情調(diào)查

①病情級別的劃分 幼苗葉片病情級別劃分見表1。

②調(diào)查時間 接種后15～20 d調(diào)查，并根據(jù)此期間感病的對照品種病級擴展到感病病級的時間作適當?shù)恼{(diào)整。

③調(diào)查方法和病情指數(shù)的計算 調(diào)查每一株苗所有展開的葉片，根據(jù)表1中癥狀描述調(diào)查、記載每份材料葉片的病情級別，并按式①計算病情指數(shù)DI。

DI=[∑（di×li）]/（L×6）×100 式①

式①中，di表示各病情級別的代表數(shù)值；li表示各病情級別對應(yīng)的葉片數(shù)；L表示調(diào)查總?cè)~片數(shù)。

1.4 鑒定材料抗病性評價

①抗病性評價標準 依據(jù)被鑒定材料3次重復(fù)的病情指數(shù)（DI）平均值，按表2劃分標準確定其抗性水平。

②鑒定有效性判別 當感病對照材料達到相應(yīng)感病程度（DI>60），抗病對照材料與實際抗性程度相符時，該批次鑒定視為有效。endprint

2 實施實例

在湖南省湘潭地區(qū)白石鎮(zhèn)、石鼓鎮(zhèn)、烏石鎮(zhèn)子蓮主種植區(qū)，選取對蓮腐敗病表現(xiàn)不同抗性的本地子蓮品種，無具體名稱，本研究將其分別命名為湘蓮1，2，3，4號。其中湘蓮1號在主栽地表現(xiàn)為感病品種，田間最高發(fā)病率可達75%以上；湘蓮2號和3號在主栽地表現(xiàn)為中抗品種，田間發(fā)病率一般為25%～40%；湘蓮4號在主栽地表現(xiàn)為高抗品種，田間最高發(fā)病率一般為5%～8%。按本文所述方法對上述4個品種進行了腐敗病抗性的室內(nèi)鑒定，鑒定結(jié)果見表3。

3 小結(jié)

應(yīng)用本方法多次試驗結(jié)果表明，接種10 d，田間抗性表現(xiàn)不同的品種，在盆栽試驗發(fā)病率上已顯示出抗性的區(qū)別，但病情指數(shù)尚未有顯著的差異；隨著病情發(fā)展，接種20 d時，不同抗性品種間的發(fā)病率和病情指數(shù)呈現(xiàn)顯著差異，但接種20～25 d時，不同抗性品種間的發(fā)病率差異又逐漸趨于不顯著，而通過病情指數(shù)所確定的各品種的抗性能力已很穩(wěn)定，20 d、25 d與30 d抗性評價結(jié)果均完全一致，說明應(yīng)用病情指數(shù)鑒定品種對腐敗病的抗病性較應(yīng)用發(fā)病率鑒定更為準確和科學(xué)，在接種后20～25 d通過比較病情指數(shù)，能完全區(qū)分出子蓮不同品種間對腐敗病抗性的差異。多次不同品種鑒定試驗結(jié)果顯示，對腐敗病室內(nèi)抗性鑒定結(jié)果與田間抗病表現(xiàn)完全吻合，證明應(yīng)用該鑒定方法能夠快速、準確地鑒定出不同子蓮品種對鐮刀菌腐敗病的抗性能力，可為大量篩選子蓮腐敗病抗病品種提供一個可靠依據(jù)。

Laboratory Method on Identifying Resistance to Fusarium Rot for

Seed Lotus Cultivars

WEI Lin1， LIANG Zhihuai2， CHENG Yanqing1

（ 1.Institute of Plant Protection， Hunan Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410125；

2.Hunan Agricultural Biotechnology Research Center ）

Abstract： The roots of germination seedlings from lotus seeds were dipped to inoculate pathogens of Fusarium rot. According to the classification standard of rot symptoms to the seedling blade， the levels of disease were identified. And then， the resistance of seed lotus cultivars to Fusarium rot was determined. The method realizes the resistance evaluation of seed lotus root cultivars to Fusarium rot rapidly and exactly in laboratory.

Key words： Lotus seed； Fusarium rot； Rapid identification； Resistanceendprint