張多多，宗 晨，王淑美，李 萍*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 南京 210009)

基于銀納米粒子催化魯米諾-過氧化氫化學(xué)發(fā)光體系測定丹參酮ⅡA磺酸鈉

張多多1,2，宗 晨2，王淑美1，李 萍1,2*

(1.廣東藥科大學(xué) 中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.中國藥科大學(xué) 天然藥物活性組分與藥效國家重點(diǎn)實(shí)驗室，江蘇 南京 210009)

堿性條件下，丹參酮ⅡA磺酸鈉能夠抑制魯米諾-過氧化氫-銀納米粒子的化學(xué)發(fā)光，據(jù)此建立了測定丹參酮ⅡA磺酸鈉的化學(xué)發(fā)光分析方法。通過優(yōu)化發(fā)光底物濃度、反應(yīng)介質(zhì)及其濃度和銀納米粒子濃度等因素，確立了最佳實(shí)驗條件，并探討了體系的可能機(jī)理。在5.0×10-6～0.08 mol/L濃度范圍內(nèi)，體系的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度與丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的對數(shù)值呈線性關(guān)系，檢出限為9.38×10-7mol/L，檢測時間為20 s。該方法靈敏度好，檢測范圍寬，可簡單快速地測定注射液中丹參酮ⅡA磺酸鈉的含量，檢測結(jié)果與高效液相色譜法的測定結(jié)果較為一致。

化學(xué)發(fā)光；銀納米粒子；魯米諾；丹參酮ⅡA磺酸鈉

丹參酮ⅡA磺酸鈉(結(jié)構(gòu)式見圖1)具有抗心肌缺血再灌注損傷、抗動脈粥樣硬化、縮小心肌梗死面積、降低心肌耗氧量等作用，臨床上廣泛用于心絞痛、心肌梗死、冠心病及室性早搏等心血管疾病的治療[1-2]。因此，建立簡單、準(zhǔn)確、靈敏的丹參酮ⅡA磺酸鈉檢測新方法，對于其相關(guān)產(chǎn)品(如注射液)的生產(chǎn)及質(zhì)量控制十分重要。目前，丹參酮ⅡA磺酸鈉含量的測定方法主要有高效液相色譜法(HPLC)[3-6]、核磁共振法[7]等，但這些方法存在成本高、操作繁瑣、檢測試劑量大等不足。

圖1 化學(xué)發(fā)光法測定丹參酮ⅡA磺酸鈉的示意圖Fig.1 Schematic diagram of chemiluminescence assay of sodium tanshinon ⅡA sulfonate

化學(xué)發(fā)光(CL)是物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)過程中伴隨的一種光輻射現(xiàn)象。CL分析法根據(jù)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度檢測待測物質(zhì)含量，具有儀器操作簡單、線性范圍寬、分析快速等優(yōu)點(diǎn)[8-9]。近年來，納米材料的出現(xiàn)促進(jìn)了化學(xué)發(fā)光分析法的迅速發(fā)展[10-19]，由于納米粒子尺寸小、比表面積大，具有異于常規(guī)粒子的表面活性、光催化性等物理化學(xué)特性[13]，可將之作為化學(xué)發(fā)光的催化劑引入體系，從而顯著提高化學(xué)發(fā)光分析法的靈敏度。目前研究較多的是金納米粒子[10-16]，而銀納米粒子具有更低的氧化還原電勢，催化能力更強(qiáng)[8]，近年來基于銀納米粒子催化的化學(xué)發(fā)光體系也得到了應(yīng)用[17-19]。

本實(shí)驗發(fā)現(xiàn)，堿性條件下丹參酮ⅡA磺酸鈉對魯米諾-過氧化氫-銀納米粒子化學(xué)發(fā)光體系具有較強(qiáng)的抑制作用(如圖1所示)，而采用化學(xué)發(fā)光法測定丹參酮ⅡA磺酸鈉的文獻(xiàn)尚未見報道。據(jù)此，本文建立了測定丹參酮ⅡA磺酸鈉的化學(xué)發(fā)光分析法，并將其應(yīng)用于丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液中丹參酮ⅡA磺酸鈉含量的測定。

1 實(shí)驗部分

1.1 儀器與試劑

BPCL微弱化學(xué)發(fā)光分析儀(北京亞泊斯科技有限公司)，G-560E渦旋混合器/旋渦振蕩器(美國Scientific Industries公司)，5427 R高速低溫離心機(jī)(Eppendorf公司)，85-1磁力攪拌器(上海司樂儀器有限公司)，BT 25S和BT 224S分析天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)，LC-20A(PDA)型分析液相色譜-DAD(日本島津公司)，JEM-200CX型透射電子顯微鏡(日本JEOL公司)，Nano-100微量紫外分光光度計(杭州奧盛儀器有限公司)，Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

魯米諾(Luminol)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，配成0.01 mol/L luminol標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取17.71 mg luminol，用1 mL 1.0 mol/L NaOH溶解，并加水定容至10 mL，室溫下避光保存。30%過氧化氫(H2O2)溶液、AgNO3、NaOH、Na2CO3、NaBH4購自南京化學(xué)試劑有限公司，NaHCO3購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，檸檬酸三鈉購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。丹參酮ⅡA磺酸鈉對照品(批號：MUST-17022603)由成都曼思特生物科技有限公司和中國科學(xué)院成都生物研究所研制，丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(諾新康，批號：1603112)購自上海上藥第一生化藥業(yè)有限公司。實(shí)驗所用試劑均為分析純，實(shí)驗用水為Milli-Q超純水。

1.2 實(shí)驗方法

首先，依據(jù)常規(guī)方法合成銀納米粒子(AgNPs)[20]：先配制0.25 mmol/L AgNO3和0.25 mmol/L 檸檬酸三鈉的混合溶液200 mL，再在冰浴中配制10 mmol/L NaBH4，取6 mL逐滴加入AgNO3-檸檬酸三鈉混合溶液中，攪拌反應(yīng)30 min至溶液呈黃色膠體狀，說明AgNPs已制備成功，放入4 ℃冰箱避光冷藏待用。

為得到丹參酮ⅡA磺酸鈉的標(biāo)準(zhǔn)曲線，將對照品用超純水稀釋至不同濃度，分別取4 μL，與同體積NaOH、AgNPs、luminol和H2O2在200 μL EP管中混合，置于BPCL微弱化學(xué)發(fā)光分析儀的樣品池中，以光電倍增管在961 V高壓下進(jìn)行靜態(tài)檢測，檢測時間為20 s。

2 結(jié)果與討論

2.1 化學(xué)發(fā)光光譜

分別使用350、420、480、540、600、650 nm濾光片，研究了luminol-H2O2、luminol-H2O2-AgNPs、luminol-H2O2-AgNPs-丹參酮ⅡA磺酸鈉3個體系的化學(xué)發(fā)光隨波長變化的譜圖，發(fā)現(xiàn)其最大發(fā)射波長均在425 nm左右(圖2)，表明3個體系的發(fā)光體均為激發(fā)態(tài)3-氨基鄰苯二甲酸[8,18]。

圖2 Luminol-H2O2(a)、luminol-H2O2-AgNPs(b)、luminol-H2O2-AgNPs-丹參酮ⅡA磺酸鈉(c)的化學(xué)發(fā)光光譜Fig.2 CL spectra of luminol-H2O2(a),luminol-H2O2-AgNPs(b)and luminol-H2O2-AgNPs-sodium tanshinon ⅡA sulfonate(c)conditions:0.625 mmol/L NaOH,2.5×10-3 mol/L luminol,1.25 mol/L H2O2,3.0×10-8 mol/L AgNPs,1.0×10-3 mol/L sodium tanshinon ⅡA sulfonate

2.2 實(shí)驗條件的優(yōu)化

2.2.1反應(yīng)介質(zhì)及其濃度優(yōu)化分別比較luminol-H2O2-AgNPs體系在NaOH、Na2CO3和Na2CO3-NaHCO33種堿性介質(zhì)中的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，發(fā)現(xiàn)該體系在NaOH中化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度最大。在0.5～12.5 mmol/L范圍內(nèi)考察了NaOH濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著NaOH濃度增大而增大，當(dāng)濃度為0.625 mmol/L時，體系的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，濃度大于0.625 mmol/L時體系的發(fā)光強(qiáng)度反而下降，故選擇0.625 mmol/L為NaOH的最優(yōu)濃度。

2.2.2Luminol濃度優(yōu)化在2.5×10-5～0.01 mol/L范圍內(nèi)考察了luminol濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，結(jié)果表明，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著luminol濃度增大而增大，當(dāng)濃度為2.5×10-3mol/L時，體系的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，濃度大于2.5×10-3mol/L時體系的發(fā)光強(qiáng)度反而下降，故選擇2.5×10-3mol/L為luminol的最優(yōu)濃度。

2.2.3H2O2濃度優(yōu)化在0.01～10 mol/L范圍內(nèi)考察了H2O2濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著H2O2濃度增大而增大，當(dāng)濃度為1.25 mol/L時，體系的發(fā)光強(qiáng)度達(dá)到最大，當(dāng)濃度大于1.25 mol/L時，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度反而下降，故選擇1.25 mol/L為H2O2的最優(yōu)濃度。

2.2.4AgNPs濃度優(yōu)化在7.5×10-10～3.0×10-8mol/L范圍內(nèi)考察了AgNPs濃度對化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度隨著AgNPs濃度增大而增大，因此AgNPs的最優(yōu)濃度為3.0×10-8mol/L。

2.3 工作曲線、精密度和檢出限

在優(yōu)化實(shí)驗條件下，考察了luminol-H2O2-AgNPs-丹參酮ⅡA磺酸鈉的化學(xué)發(fā)光隨時間的變化，結(jié)果顯示，luminol-H2O2體系本身化學(xué)發(fā)光并不強(qiáng)，隨著AgNPs的加入，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度明顯增大，而丹參酮ⅡA磺酸鈉則對luminol-H2O2-AgNPs的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度具有明顯的抑制作用，并且隨著丹參酮ⅡA磺酸鈉濃度的增加而逐漸降低。

在最佳實(shí)驗條件下，當(dāng)?shù)⑼駻磺酸鈉濃度在5.0×10-6～0.08 mol/L范圍內(nèi)，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度(Y)與其濃度(X，mol/L)對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=-4.14×105-3.78×105lgX，r2=0.999 9，檢出限(LOD)為9.38×10-7mol/L。

對8.0×10-4mol/L丹參酮ⅡA磺酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液平行測定9次，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.0%，說明該方法精密度良好。

2.4 干擾試驗

在最佳實(shí)驗條件下，當(dāng)?shù)⑼駻磺酸鈉濃度為1.0×10-3mol/L，800倍的葡萄糖，200倍的Na+，100倍的K+、NO3-、F-、SO42-，相同濃度的Mg2+、Ca2+、原兒茶酸、紫草酸、鹽酸川芎嗪均不干擾測定，表明該方法具有很好的選擇性。

2.5 機(jī)理探討

2.5.1銀納米粒子的表征利用透射電子顯微鏡(Transmission electron microscope，TEM)對制備好的AgNPs進(jìn)行表征，得到其外觀和尺寸：所制AgNPs均為球形，平均直徑約為6 nm(圖3A)；其紫外可見光譜在390 nm處出現(xiàn)最大吸收峰(圖3B)，與文獻(xiàn)中合成的銀納米粒子的紫外吸收峰大致相同[20]。

2.5.2化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線考察了luminol-H2O2、luminol-H2O2-AgNPs和luminol-H2O2-AgNPs-丹參酮ⅡA磺酸鈉的化學(xué)發(fā)光動力學(xué)曲線，結(jié)果表明，3種體系的化學(xué)發(fā)光值均迅速上升，分別在8.4、7.2、8.4 s左右達(dá)到最大值后緩慢下降，說明AgNPs的引入加快了化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，而丹參酮ⅡA磺酸鈉的存在會延緩這一進(jìn)程。

圖4 銀納米粒子催化化學(xué)發(fā)光的可能機(jī)理Fig.4 Possible mechanism of CL reaction catalyzed by AgNPs

2.5.3可能的機(jī)理根據(jù)以往納米粒子增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光的報道，結(jié)合化學(xué)發(fā)光最大波長、動力學(xué)曲線可以推知，本研究中，AgNPs是luminol-H2O2體系的催化劑，可能的機(jī)理如圖4所示：AgNPs催化H2O2分解生成羥基自由基[21-22]，羥基自由基與魯米諾陰離子反應(yīng)，生成魯米諾自由基和超氧陰離子，繼而產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光。向luminol-H2O2-AgNPs體系內(nèi)加入抗壞血酸，化學(xué)發(fā)光抑制了95.4%，證實(shí)了羥基自由基的存在及作用。一方面，AgNPs能夠加快電子轉(zhuǎn)移過程并促進(jìn)自由基生成，另一方面，羥基自由基可以穩(wěn)定在AgNPs表面，使大量的3-氨基鄰苯二甲酸激發(fā)態(tài)在銀納米粒子表面生成，降低了激發(fā)態(tài)與溶劑分子的碰撞幾率。兩方面協(xié)同作用，大大增強(qiáng)了化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度[23-24]。

2.6 分析應(yīng)用

在線性范圍內(nèi)，將丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液(標(biāo)示量5 mg/mL)分別稀釋5、10、20倍作為3種實(shí)際分析樣品(分別記為樣品1、2、3)。在最佳實(shí)驗條件下，按本方法測定3種樣品中丹參酮 Ⅱ A磺酸鈉的濃度并進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗。結(jié)果表明：方法的回收率為99.2%～102%，RSD(n=6)為1.1%～2.4%，與HPLC的測定結(jié)果進(jìn)行對比，相對誤差絕對值≤3.64%(見表1)，表明該方法準(zhǔn)確可靠，實(shí)用性良好。

表1 實(shí)際樣品分析及加標(biāo)回收實(shí)驗結(jié)果Table 1 Assay and recovery results of sodium tanshinon ⅡA sulfonate in analytical samples

3 結(jié) 論

本文利用堿性條件下丹參酮ⅡA磺酸鈉對魯米諾-過氧化氫-銀納米粒子化學(xué)發(fā)光體系的抑制作用，首次建立了測定丹參酮ⅡA磺酸鈉的化學(xué)發(fā)光分析方法。與其它方法比較，本方法操作簡單、檢測時間短(20 s)、檢測范圍寬(5.0×10-6～0.08 mol/L)、檢出限低(9.38×10-7mol/L)、消耗樣品量少(4 μL)。該法應(yīng)用于丹參酮ⅡA磺酸鈉注射液中丹參酮ⅡA磺酸鈉的含量測定，結(jié)果準(zhǔn)確，在藥物分析、質(zhì)量控制中具有應(yīng)用前景。

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Detection of Sodium Tanshinon ⅡA Sulfonate Based on Silver Nanoparticles-Luminol-H2O2Chemiluminescence System

ZHANG Duo-duo1,2,ZONG Chen2,WANG Shu-mei1,LI Ping1,2*

(1.College of Traditional Chinese Medicine,Guangdong Pharmaceutical University,Guangzhou 510006,China;2.State Key Laboratory of Natural Medicines,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China)

A novel method for the detection of sodium tanshinon ⅡA sulfonate was developed based on the inhibition effect of sodium tanshinon ⅡA sulfonate on luminol-H2O2-silver nanoparticles(AgNPs)chemiluminescence(CL) under alkaline condition.The optimal experiment conditions were established by optimizing the concentration of CL substrates,reaction medium and its concentration,and the concentration of AgNPs.The possible mechanism of the CL system was also investigated.Under the optimal conditions,the CL intensity was inversely proportional to logarithm value of sodium tanshinon ⅡA sulfonate concentration in the range of 5.0×10-6-0.08 mol/L with a detection limit of 9.38×10-7mol/L and a detection time of 20 s.With a considerable sensitivity and a wide detection range,the proposed method could be applied in the simple and fast detection of sodium tanshinon ⅡA sulfonate in the injection solution with satisfactory results which are in good agreement with the reference values obtained by high performance liquid chromatography.

chemiluminescence;silver nanoparticles;luminol;sodium tanshinon ⅡA sulfonate

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.014

O657.3；R917

A

1004-4957(2017)10-1245-05

2017-06-22；

2017-07-12

國家自然科學(xué)基金青年基金(21505160)

*

李 萍，博士，教授，研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)與質(zhì)量控制，Tel：025-83271379，E-mail：liping2004@126.com