王 智，施宗偉，郗存顯，曹淑瑞，王國(guó)民，唐柏彬，鄭 佳 ，母昭德*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016;2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶 400020;3.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016 )

PRiMEHLB固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測(cè)牛肝中18種促生長(zhǎng)劑類藥物殘留

王 智1,3，施宗偉2，郗存顯2，曹淑瑞2，王國(guó)民2，唐柏彬2，鄭 佳1,3，母昭德1,3*

(1.重慶醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，重慶 400016;2.重慶出入境檢驗(yàn)檢疫局 重慶市進(jìn)出口食品安全工程技術(shù)研究中心，重慶 400020;3.重慶市生物化學(xué)與分子藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016 )

建立了PRiME HLB固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)高通量快速檢測(cè)牛肝中8種激素、6種β-受體激動(dòng)劑及4種抗生素類促生長(zhǎng)劑藥物的方法。分別對(duì)色譜分離條件、MS/MS檢測(cè)參數(shù)及樣品前處理進(jìn)行了優(yōu)化。樣品經(jīng)β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酯酶酶解后，以甲醇和乙腈-甲醇(90∶10，體積比)分步提取后，直接通過(guò)PRiME HLB凈化，收集流出液氮?dú)獯蹈珊笠砸译?水(3∶7，體積比)復(fù)溶，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。結(jié)果表明18種化合物在1.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.990；方法檢出限(LOD)為0.07～0.78 μg/kg，定量下限(LOQ)為0.23～2.58 μg/kg。在3個(gè)加標(biāo)水平下(0.5、1.0、5.0 μg/kg)的回收率為67.5%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確，適用于動(dòng)物組織中多種促生長(zhǎng)劑類藥物的同時(shí)檢測(cè)。

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；PRiME HLB固相萃??；促生長(zhǎng)劑；牛肝

促生長(zhǎng)劑(激素、抗生素和受體激動(dòng)劑等)是一類促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率的藥物。激素類藥物如睪酮能夠促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)，提高飼料轉(zhuǎn)化率，有利于蛋白質(zhì)的沉積，在畜牧業(yè)養(yǎng)殖中廣泛使用[1]?？股仡愃幬镒畛踔皇且活惪咕委熕幬?，20世紀(jì)70年代被發(fā)現(xiàn)除了治療和預(yù)防外，還能夠殺死腸道類的細(xì)菌微生物而明顯促進(jìn)動(dòng)物的生長(zhǎng)，因此此類藥物還用作飼料添加劑[2-3]；受體激動(dòng)劑藥物俗稱“瘦肉精”，因能夠提高動(dòng)物的生長(zhǎng)率和瘦肉率常被用于動(dòng)物的飼養(yǎng)過(guò)程[4]。這類藥物被大量濫用，最終對(duì)食品安全產(chǎn)生極大的威脅。因此我國(guó)及歐盟等國(guó)家制定了嚴(yán)格規(guī)定，建立了相關(guān)的限量標(biāo)準(zhǔn)或禁止使用某些副作用極大的藥物。

肝臟是藥物主要代謝器官，常被作為藥物殘留監(jiān)測(cè)的最佳靶組織。近年來(lái)針對(duì)激素、抗生素和受體激動(dòng)劑等促生長(zhǎng)劑殘留的檢測(cè)方法主要包括光激化學(xué)發(fā)光納米均相時(shí)間分辨熒光免疫法(AlphaLISA)[5]、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)[6-11]等。雖然AlphaLISA法前處理簡(jiǎn)單，但該方法局限于某一藥物或某幾個(gè)結(jié)構(gòu)類似化合物的篩查，不能同時(shí)進(jìn)行多種藥物殘留的定性定量分析，易出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性。UPLC-MS/MS因具有良好的分離效能，能夠同時(shí)對(duì)多種藥物進(jìn)行定性定量分析的特點(diǎn)，越來(lái)越多的用于各種樣品中獸藥的殘留分析。然而同時(shí)檢測(cè)多種藥物時(shí)，因?yàn)槠浠瘜W(xué)性質(zhì)差異，在復(fù)雜的樣品基質(zhì)中提取凈化目標(biāo)物的前處理過(guò)程復(fù)雜耗時(shí)，因此目前少有報(bào)道采用UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)牛肝中激素、抗生素和受體激動(dòng)劑。牛肝是一種極為復(fù)雜的基質(zhì)，為了降低干擾物對(duì)目標(biāo)物的干擾，檢測(cè)前必須進(jìn)行凈化處理。目前常用的凈化方式主要有磁固相萃取[12]和固相萃取[13-15]。磁固相萃取雖然簡(jiǎn)單、快速，但不能有效去除動(dòng)物源性食品中脂類、蛋白質(zhì)類干擾物，且需復(fù)雜合成過(guò)程，合成條件不易控制，耗時(shí)；固相萃取的HLB、MCX和C18柱等常用柱子在使用前需進(jìn)行平衡活化等處理，過(guò)程繁瑣，工作量大。新型Oasis PRiME HLB 固相萃取柱無(wú)需平衡活化、潤(rùn)洗和洗脫等過(guò)程，大大節(jié)省了凈化時(shí)間，并能夠有效除去復(fù)雜基質(zhì)中的多種干擾雜質(zhì)，延長(zhǎng)色譜柱使用壽命，已逐漸被用于獸藥殘留的凈化[16-17]。

本試驗(yàn)以牛肝為研究對(duì)象，首次以O(shè)asis PRiME HLB為凈化手段，采用UPLC-MS/MS同時(shí)檢測(cè)牛肝中18種促生長(zhǎng)劑的殘留，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、準(zhǔn)確和高通量的特點(diǎn)。為食品質(zhì)量安全的監(jiān)控提供了新的檢測(cè)技術(shù)選擇。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

API5500QTRAP高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國(guó)ABsciex公司)；LC-30AD超高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；BS224S型天平(德國(guó)Sartorius公司)；渦旋振蕩混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；3-30K臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Sigma公司)；N-EVAP116水浴式氮吹濃縮儀(美國(guó)Or-ganomation Associates公司)；Milli-Q超純水系統(tǒng)(美國(guó)Millipore公司)。Oasis PRiME HLB固相萃取小柱(3 mL，60 mg，美國(guó)Waters公司)。

乙腈、甲醇(色譜純，美國(guó)Tedia公司)；甲酸(色譜純，美國(guó)Roe Scientific Ing 公司)；β-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酯酶(≥100 000 U/mL，Sigma 公司)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

標(biāo)準(zhǔn)品：甲羥孕酮、醋酸甲羥孕酮、醋酸美侖孕酮、丙酸睪酮、17α-羥孕酮、諾龍、睪酮、甲睪酮純度均≥98%，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司或德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。沙丁胺醇、噴布特羅、萊克多巴胺、妥布特羅、克倫特羅、溴布特羅純度均≥98%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司；竹桃霉素(純度≥98%)購(gòu)自英國(guó)加拿大Toronto research chemicals inc;林可霉素、紅霉素、維吉霉素純度均≥98%，購(gòu)自德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備：分別稱取適量的標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-18 ℃儲(chǔ)存。分別移取一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制成1 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液及不同質(zhì)量濃度的單標(biāo)工作液，儲(chǔ)存于-4 ℃冰箱中。

1.2 樣品前處理方法

稱取2 g(精確至0.01 g)樣品于50 mL 具塞離心管中，加入40 μLβ-葡萄糖醛苷酶/芳基硫酯酶和5 mL pH 5.2 的乙酸銨于60 ℃ 以110 r/min酶解1 h。酶解后加入5 mL甲醇振蕩提取15 min，8 000 r/min離心3 min，移取上清液，再向離心管中加入10 mL乙腈-甲醇(90∶10，體積比)振蕩提取15 min，合并兩次上清液渦旋混勻。用移液管取4 mL提取液過(guò)Oasis PRiME HLB柱，收集流出液40 ℃ 氮?dú)獯蹈桑?.2 mL 乙腈-水(3∶7，體積比)復(fù)溶，渦旋混勻，過(guò)0.22 μm微孔濾膜，供UPLC-MS/MS檢測(cè)。

1.3 色譜及質(zhì)譜條件

色譜條件：ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相：A為乙腈，B為2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)，洗脫程序?yàn)椋?～1 min，5%A;1～4 min，80%A;4～10 min,95%A;10～12 min，5%A；流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：2 μL,柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：采用電噴霧離子源(ESI)，正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)模式進(jìn)行檢測(cè)。電噴霧電壓(IS)：4.5 kV；霧化氣壓力(GS1)：0.55 MPa；氣簾氣壓力(CUR):0.30 MPa；輔助氣壓力(GS2):0.55 MPa；離子源溫度(TEM):550 ℃；碰撞室入口電壓(EP):10 V；碰撞電壓(CE)、去簇離子電壓(DP)等參數(shù)見(jiàn)表1。

表1 18種化合物的質(zhì)譜參數(shù)及保留時(shí)間Table 1 Mass parameters and retention times of 18 compounds

*quantitative ion

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜與色譜條件的優(yōu)化

質(zhì)譜條件優(yōu)化：將18種化合物混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(100 μg/L)直接進(jìn)樣，進(jìn)行全掃描，準(zhǔn)確找出分子離子[M+H]+,然后對(duì)準(zhǔn)分子離子進(jìn)行轟擊獲得二次碎裂離子，將準(zhǔn)分子離子和2個(gè)信號(hào)強(qiáng)度最高的子離子組成檢測(cè)離子對(duì)，以MRM模式檢測(cè)。并進(jìn)一步優(yōu)化碰撞電壓、去簇離子電壓，選擇其中豐度較大的子離子作為定量離子。具體參數(shù)見(jiàn)表1。

色譜條件優(yōu)化：分別考察了不同體積比的乙腈-水(3∶7、2∶8、1∶9)作為定容溶液時(shí)對(duì)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，上述不同配比的乙腈-水對(duì)18種化合物的分離效果均良好，但乙腈-水體積比為3∶7時(shí)效果最好。進(jìn)一步考察了以甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液、甲醇-2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)、乙腈-2 mmol/L乙酸銨水溶液和乙腈-2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)為流動(dòng)相時(shí)對(duì)化合物分離效果的影響。結(jié)果表明，以乙腈-2 mmol/L乙酸銨水溶液(含0.2%甲酸)為流動(dòng)相時(shí)，18種化合物的分離效果最好，且在含有0.2%甲酸的條件下，靈敏度更高，峰形更好。

圖1 不同提取溶劑對(duì)18種化合物提取效果的影響Fig.1 Effect of different solvents on extraction efficiencies of 18 compounds the number denoted was the same as that in Table 1

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)的18種目標(biāo)物屬于不同類別化合物，性質(zhì)差異大，因此分別考察了甲醇、酸性甲醇、乙腈、酸性乙腈、乙腈-水和乙腈-甲醇作為提取溶劑時(shí)對(duì)化合物回收率的影響。結(jié)果如圖1所示，大部分化合物在乙腈-甲醇中的回收率較好，進(jìn)一步考察不同乙腈-甲醇比例的提取效果發(fā)現(xiàn)，乙腈-甲醇體積比為90∶10時(shí)的提取回收率最好，但激素類化合物在甲醇中的回收率比在其他溶劑中高，因此選擇甲醇和乙腈-甲醇(90∶10)作為提取溶劑，進(jìn)行分步提取。

2.3 凈化方式的選擇

實(shí)驗(yàn)分別采用HLB柱、MCX柱、C18柱、Oasis PRiME HLB對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行了考察。在C18柱上只有個(gè)別化合物的回收率達(dá)到60%以上，其余均低于40%。在陽(yáng)離子交換柱MCX柱上，化合物需要調(diào)節(jié)pH值至酸性，但回收率依然達(dá)不到60%以上，尤其在酸性條件下大環(huán)內(nèi)酯類化合物(如紅霉素)會(huì)分解，導(dǎo)致回收率降低。在HLB柱和Oasis PRiME HLB柱上，所有目標(biāo)化合物的回收率均能達(dá)到65%以上，而Oasis PRiME HLB凈化過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、快速、省時(shí)，且能夠有效除去樣品中脂類和蛋白質(zhì)等干擾物，因此選擇Oasis PRiME HLB柱對(duì)目標(biāo)分析物進(jìn)行凈化。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1線性方程、檢出限及定量下限采用空白基質(zhì)提取液配制質(zhì)量濃度分別為1.0、5.0、10.0、20.0、 50.0、70.0、 100.0 μg/L的18種目標(biāo)化合物的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最優(yōu)條件下進(jìn)行測(cè)定，以定量離子峰面積(y)對(duì)質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制線性曲線。結(jié)果表明，18種化合物在1.0～100.0 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)大于0.990，檢出限(LOD，S/N=3)和定量下限(LOQ，S/N=10)分別為0.07～0.78 μg/kg和0.23～2.58 μg/kg(表2)。

表2 18種化合物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量下限Table 2 Regression equation，correlation coefficients(r2)，LOD and LOQ of 18 compounds

2.4.2回收率與精密度在2 g空白樣品中添加0.5、1.0、5.0 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率測(cè)定，每個(gè)濃度水平重復(fù)測(cè)定6次。按“1.2”方法處理后供UPLC-MS/MS分析，計(jì)算回收率。由表3可知，18種化合物的回收率為67.5%～102.0%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于15%。

表3 18種化合物的回收率與精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions for 18 compounds(n=6)

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

利用本文所建立的方法分析了17份牛肝樣品，其中1份樣品中檢出萊克多巴胺，檢出量為2.19 μg/kg，3份樣品中檢出丙酸睪酮，檢出量為3.87～31.2 μg/kg，其余藥物均未被檢出。

3 結(jié) 論

本文基于PRiME HLB固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜建立了同時(shí)檢測(cè)牛肝中18種促生長(zhǎng)劑藥物殘留的分析方法，分別對(duì)色譜、質(zhì)譜、提取溶劑及凈化柱進(jìn)行優(yōu)化。在最佳條件下，方法檢出限為0.07～0.78 μg/kg，定量下限為0.23～2.58 μg/kg；在0.5、1.0、5.0 μg/kg加標(biāo)水平下的回收率為67.5%～102.0%，RSD小于15%。本方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確且靈敏度好，可用于不同動(dòng)物組織內(nèi)臟中促生長(zhǎng)劑類藥物的檢測(cè)。

[1] Chen J H，Lu Y，F(xiàn)eng N，Jiang J,Xie W D，Jiang Y，Zhao J P，Lu F.Sci.Technol.FoodInd.(陳君慧，路勇，馮楠，姜潔，謝文東，江英，趙俊平，魯緋.食品工業(yè)科技)，2013,34(8):74-79.

[2] Kan C A，Jager L P，Grommers F J.Anim.Welf.，1998，7:397-414.

[3] McGuffey R K，Richardson L F，Wilkinson J D.J.DairySci.，2001，84(1):E194-E203.

[4] Zhao S J，Zheng Z R，Qu Z N，Xiao X，Wang Y D，Wang J，Lu P.ChinaAnimalHealthInspection(趙思俊，鄭增忍，曲志娜，肖肖，王玉東，王娟，路平.中國(guó)動(dòng)物檢疫)，2011，28(4)：1-4.

[5] Gong Q，Xi C X，Nie F P，Cao S R，Tang B B，Wang G M，Chen D D，Mu Z D.J.Instrum.Anal.(龔倩，郗存顯，聶福平，曹淑瑞，唐柏彬，王國(guó)民，陳冬東，母昭德.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2017，36(1)：117-121.

[6] Wang F M，Zhang H W，Pang S P，Tang Z X，Niu Z Y，Luo X.Chin.J.Anal.Chem.(王鳳美，張鴻偉，龐士平，湯志旭，牛增元，羅忻.分析化學(xué))，2008,36(12):1629-1635.

[7] He X Q，Xi C X，Tang B B，Wang G M，Chen D D，Peng T，Mu Z D.FoodAddit.Contam.PartA，2014，31(10):1625-1638.

[8] You Y W，Uboh C E，Soma L R，Guan F Y，Li X Q，Liu Y，Rudy J A，Chen J W，Tsang D B.J.Chromatogr.A,2011,1218(26):3982-3993.

[9] Freitas A，Leston S，Rosa J，Castilho Mda C，Barbosa J，Rema，P，Pardal M A，Ramos F.FoodAddit.Contam.PartA，2014，31(5):817-826.

[10] González de la Huebra M J，Vincent U，Bordin G，Rodríguez A R.Anal.Bioanal.Chem.，2004，382(2):433-439.

[11] Han R W，Zheng N，Yu Z N，Wang J，Xu X M，Qu X Y，Li S L，Zhang Y D，Wang J Q.FoodChem.，2015,181：119-126.

[12] Zhu J G，Li P W，Zhang W，Sun X M，Yang Q Q，Zhang Q，Zhang Z W，Ding X X.J.Instrum.Anal.(朱建國(guó)，李培武，張文，孫曉曼，楊青青，張奇，張兆威，丁小霞.分析測(cè)試學(xué)報(bào))，2016,35(9):1087-1093.

[13] Ha J，Song G，Ai L F，Li J C.J.Chromatogr.B，2016,1017/1018:187.

[14] Jorge B，F(xiàn)ernando R，F(xiàn)reitasa A.J.Chromatogr.B，2015,976/977:49-54.

[15] Kaufmann A，Butcher P，Maden K.Anal.Chim.Acta，2012,711:46-53.

[16] Tian H，Wang J Q，Zhang Y D，Li S L，Jiang J D，Tao D L，Zheng N.J.Chromatogr.B，2016，1033/1034:172.

[17] Sun Q R，Guo L Q，Zhang J L，Liu Y Q.FoodRes.Dev.(孫清榮，郭禮強(qiáng)，張金玲，劉永強(qiáng).食品研究與開(kāi)發(fā))，2017,38(4)：127-132.

Rapid Determination of 18 Growth Promoting Agents in Bovine Liver by UPLC-MS/MS Coupled with PRiME HLB SPE Clean-up

WANG Zhi1,3，SHI Zong-wei2，XI Cun-xian2，CAO Shu-rui2，WANG Guo-min2，TANG Bo-bin2，ZHENG Jia1,3，MU Zhao-de1,3*

(1.College of Pharmacy，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China;2.Chongqing Engineering Technology Research Center of Import and Export Food Safety，Chongqing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Chongqing 400020，China;3.Chongqing Key Laboratory of Biochemistry and Molecular Pharmacology，Chongqing 400016，China)

A method was developed for the rapid detection of 8 hormones，6β-receptor agonists and 4 antibiotics growth promoting agents in bovine liver by PRiME HLB solid-phase extraction/ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS).The chromatographic separation conditions，MS/MS detection parameters and sample pretreatment were optimized，respectively.The sample was firstly added NH4OAc buffer solution(pH 5.2)，and hydrolyzed with a mixed solution ofβ-glucuronidase/sulfatase，then extracted with methanol(MeOH) and acetonitrile(ACN)-MeOH(90∶10，by volume) step by step，finally purified with PRiME HLB.The effluent was collected and concentrated to dryness，and redissolved with ACN-water(3∶7，by volume) for UPLC-MS/MS detection.The results showed that 18 kinds of compounds had good linear relationships in the range of 1.0-100.0 μg/L with their correlation coefficients higher than 0.990.The detection limits(LODs) ranged from 0.07-0.78 μg/kg，and the quantitation limits(LOQs) ranged from 0.23-2.58 μg/kg.The average recoveries of 18 compounds at three spiked levels(0.5，1.0，5.0 μg/kg) were in the range of 67.5%-102.0%with relative standard deviations(RSDs) less than 15%.The method was simple，rapid and accurate，and was suitable for the simultaneous detection of 18 growth promoting agents in animal tissues.

UPLC-MS/MS;PRiME HLB solid-phase extraction;growth promoting agents;bovine liver

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.10.009

O657.63；TS201.6

A

1004-4957(2017)10-1219-06

2017-06-19；

2017-07-05

重慶市重大應(yīng)用技術(shù)開(kāi)發(fā)項(xiàng)目(cstc2015yykfC80001)

*

母昭德，博士，教授，研究方向：藥物分析，E-mail:wzsophia@yeah.net