賀道遠 倪吉祥

（三峽大學體育學院，三峽大學人民醫(yī)院）

耐力運動上調(diào)老年小鼠心肌神經(jīng)生長因子的表達

賀道遠 倪吉祥

（三峽大學體育學院，三峽大學人民醫(yī)院）

目的 研究耐力運動對老年小鼠心臟神經(jīng)生長因子（NGF）蛋白表達的變化影響，揭示NGF在運動預防老年心衰中的作用及機制。方法 C57/BL6小鼠分為5組：15天齡（D15）、30天齡小鼠為幼年組（D30），90天齡小鼠為成年組（D90），360天小鼠為老年組（D360），360天齡運動小鼠為老年運動組（ED360），（n=8）運動方案為跑臺運動，上坡跑，坡度5°，速度16 m/min，每次30 min連續(xù)運動，每日1次，每周5天，共5周。采用Western blot法測定NGF蛋白表達。結果 幼年組、成年組心肌NGF蛋白表達比老年組高（p＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義；運動老年組心肌NGF蛋白表達比非運動老年組高（p＜0.05），差異具有統(tǒng)計學意義。結論 運動上調(diào)老年小鼠心肌NGF蛋白的表達。

耐力運動；心??；神經(jīng)生長因子

隨年齡增大，心血管疾病如高血壓、動脈粥樣硬化、心肌梗死等發(fā)生的風險越來越高，衰老是心血管疾病的主要危險因素[1]。引起心力衰竭的心肌梗死，其發(fā)生也與衰老密切相關。心肌梗死發(fā)生后心臟的主要生理病理變化是心臟重構，此外，還存在交感神經(jīng)重塑。這些后續(xù)變化會引起心臟結構及功能的進一步惡化，危及生命。神經(jīng)生長因子N G F是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的生長發(fā)育，維持神經(jīng)細胞的存活[2]，對心臟的交感緊張起調(diào)節(jié)作用[3]。研究發(fā)現(xiàn)，N G F的作用機制是通過結合其受體T r k A發(fā)揮抗凋亡作用[4]。有研究提示N G F在心肌梗死后出現(xiàn)的交感神經(jīng)重塑中可能起抑制作用，而在衰老過程中N G F的表達及作用還不太清楚。有規(guī)律的體力活動對于老年人心衰的預防和康復具有積極作用，可降低心衰患者死亡率、提高生存質量，但運動的這種正效應的具體機制還不太清楚，是否參與到抑制交感神經(jīng)重塑等從而使心臟結構和功能的發(fā)生良性逆轉？需要進一步研究證實。該研究旨在研究耐力運動對老年小鼠心臟N G F表達的變化影響，揭示N G F在運動預防老年心衰中的作用及機制。

1 對象和方法

1.1 實驗對象

C 57/B L 6小鼠分為5組：15天齡（D 15）、30天齡小鼠為幼年組（D 30），90天齡小鼠為成年組（D 90），360天小鼠為老年組（D 360），360天齡的運動小鼠為運動老年組（ED 360），D 15、D 30、D 90、D 360組小鼠不運動，ED 360組進行跑臺運動，每組10只，正常飲食。

1.2 實驗方法

耐力運動方案為跑臺運動，上坡跑，坡度5°，速度16 m/min，每次30 min連續(xù)運動，每日1次，每周5天，共5周。運動組正式運動前先進行一周的預適應跑臺運動，速度8～10 m/min，每次5 min，每兩天1次，一周共3次。運動后2 h處死后取心臟，去血及附著物后迅速置于液氮中并轉移至-80 ℃冰箱凍存待測。運動老年組（ED 360）按上述方案運動，其他組不運動。

1.3 指標測定

取組織在液氮中碾磨，裂解液溶解提取蛋白質（碧云天蛋白提取試劑盒），測總蛋白質濃度（碧云天B C A 法蛋白測定試劑盒）。蛋白表達的測定采用westernblot法，測定NGF蛋白表達。常規(guī)SDS-PAGE，PVDF膜轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入一抗（NGF一抗，1∶1000，Abcam；抗β-肌動蛋白一抗，1∶ 2000，Cell Signaling），4 ℃ 過夜；二抗（1∶2000，Cell Signaling）室溫下孵育 2h，ECL 顯影（Advansta），Bio-Rad成像，Imagelab 軟件對各樣本灰度值進行分析。

1.4 統(tǒng)計學處理

結果采用目標蛋白光密度與內(nèi)參光密度的比值作為測量蛋白的相對表達量。所有數(shù)據(jù)均用SPSS19. 0 軟件進行統(tǒng)計學分析，各數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差（）表示，p＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同年齡小鼠心肌NGF表達

與老年組（D 360）比，幼年組（D 15、D 30）、成年組（D 90）心肌N G F蛋白表達均升高（p＜0.05），變化具有統(tǒng)計學意義，見圖1。結果顯示，隨著小鼠年齡增長，小鼠心肌N G F蛋白表達為一條先升后降的曲線。

2.2 運動小鼠NGF表達

與老年組（D 360）比，運動老年組（ED 360）小鼠心肌N G F蛋白表達升高，p＜0.05，見圖2。結果表明五周耐力運動后老年小鼠心肌N G F蛋白表達上升。

3 結論與討論

N G F是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子，對神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育、成熟起非常重要的作用。同時它還具有其他廣泛的作用，參與調(diào)節(jié)免疫、造血、內(nèi)分泌、生殖等系統(tǒng)的功能[5]。另外，心肌細胞能自分泌的N G F，心肌產(chǎn)生的N G F在心血管系統(tǒng)中也發(fā)揮至關重要的作用[6]。

圖1 不同年齡小鼠心肌NGF蛋白表達

圖2 非運動老年組和運動老年組小鼠心肌NGF蛋白表達

該研究結果表明，心肌N G F表達具有時程性特點，即不同年齡時期心肌N G F表達水平不同。幼年期隨年齡增長表達增加，成年期、老年期又呈下降趨勢。這可能與心肌在整個生命周期的不同發(fā)育階段有關，發(fā)育階段心肌生長，成熟和衰老階段心肌也逐漸衰弱。該研究結果顯示，心肌N G F蛋白表達量的變化與心肌的發(fā)育及個體發(fā)育的變化同步，顯示了心肌N G F在調(diào)節(jié)心肌結構的重構和功能的發(fā)揮中的作用。

國外文獻極少見運動與N G F蛋白表達關系的研究報道，但近幾年相關研究報道出現(xiàn)在了國內(nèi)期刊上，但主要是運動對神經(jīng)分泌N G F蛋白影響的研究，而未見運動影響心肌N G F蛋白表達的研究?？梢?，運動與心肌N G F表達的關系還未引起研究者的重視。而鑒于N G F對心肌結構、功能的重要性[7]，而運動在延緩衰老等相關疾病中又起重要作用，因而運動對心肌N G F表達影響的研究是不容忽視的。該研究結果表明，運動能上調(diào)老年小鼠心肌N G F表達，這可能是老年個體對運動的適應性的體現(xiàn)。但其機制及其具體的生物學意義還有待進一步研究。

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[5] Frossard N，F(xiàn)reund V，Advenier C. Nerve growth factor and its receptors in asthma and inflammation[J].Eur J Pharmacol，2004，500（3）：453-465.

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[7] 劉曉柳，熊彥娥.神經(jīng)生長因子及其受體在心血管系統(tǒng)中作用的研究進展 . 生命科學，2017，29（5）：468-472.

Endurance Exercise Regulate the Expression of Cardiac Nerve Growth Factor Protein in Mice

He Daoyuan1Ni Jixiang2
（1. College of Physical Education，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China；2.People’s Hospital of China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443000，China）

Objective To investigate the effect of endurance exercise on the expression of cardiac nerve growth factor (NGF) protein in aged mice and to reveal the role and mechanism of NGF in exercise prevention of senile heart failure. Methods C57/BL6 mice were divided into 5 groups, 15-day (D15), 30-day mice (D30) were used as the young group; 90-day as the adult group (D90), 360-day mice for the aged group (D360), exercising mice 360-day the aged exercise group (ED360) (n=8). Exercise program is to run the treadmill, uphill running, whit 5° slope，16 speed m/min, for 30 min each time, once a day, 5 days a week for 5 weeks. The expression of NGF protein was determined by Western blot. Results The expression of myocardial NGF protein in mice of the young group and the adult group was higher than that in old group (p＜0.05), the difference was statistically significant、The expression of myocardial NGF protein in mice of aged exercise group was higher than that in mice of aged group(p＜0.05), the difference was statistically significant. Conclusion Exercise can upregulate the expression of NGF protein in the myocardium of aged mice.

endurance exercise；myocardium；nerve growth factor(NGF)

湖北省自然科學基金項目（2012FFB03707）

賀道遠，博士，教授，研究方向：運動生理學。倪吉祥，碩士，副主任醫(yī)師，研究方向：肺間質病。