張文娟，周雪，李瑞雪，楊茜，夏麗芳，李志紅

(保定市第一中心醫(yī)院 內(nèi)分泌二科，河北 保定 071000 )

·論著·

利拉魯肽激活A(yù)kt通路改善乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷

張文娟，周雪，李瑞雪，楊茜，夏麗芳，李志紅

(保定市第一中心醫(yī)院 內(nèi)分泌二科，河北 保定 071000 )

目的研究利拉魯肽對乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響及機(jī)制。方法分離乳鼠心肌細(xì)胞,分為對照組、缺氧/復(fù)氧組和利拉魯肽組，體外構(gòu)建缺氧/復(fù)氧損傷模型，使用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase- 3、Akt以及Akt磷酸化水平。結(jié)果對乳鼠心肌細(xì)胞進(jìn)行缺氧/復(fù)氧損傷處理后，流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，缺氧/復(fù)氧損傷能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而利拉魯肽則有抗凋亡作用；Western blot結(jié)果提示，缺氧/復(fù)氧損傷可誘導(dǎo)caspase- 3表達(dá)，激活凋亡相關(guān)信號通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而利拉魯肽組細(xì)胞Akt磷酸化水平明顯增加， caspase- 3表達(dá)減少、活性降低。結(jié)論利拉魯肽可以通過增加Akt磷酸化以激活A(yù)kt通路，抑制caspase- 3的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用，改善缺氧/復(fù)氧損傷。

利拉魯肽； 缺氧/復(fù)氧損傷； Akt通路； 細(xì)胞凋亡； 乳鼠

心肌缺血再灌注損傷是指在阻斷冠脈血流一段時間以后，在恢復(fù)供血供氧的情況下，心肌進(jìn)一步發(fā)生損傷和壞死，其甚至可能是造成缺血后心肌損傷的主要原因之一[1]。缺血再灌注損傷發(fā)生的機(jī)制包括恢復(fù)血供后過量自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、微血管損傷等[2]。因此如何保護(hù)缺血后心肌細(xì)胞免受再次損傷是臨床治療缺血性心臟病面臨的重要問題。腸促胰素胰升糖素樣肽- 1(glucagon- like peptide- 1，GLP- 1) 是前甘露醇前體N- 衍生肽家族的一員，基礎(chǔ)和臨床研究均表明GLP- 1可以發(fā)揮心血管保護(hù)作用[3]。GLP- 1受體在心臟中有表達(dá)[4]，GLP- 1受體激動劑能直接激活心肌細(xì)胞信號通路[5]。利拉魯肽是GLP- 1類似物，為GLP- 1受體激動劑，可以減小心梗大鼠動物模型的心梗面積，改善心功能[6]；滕曉煥等[7]通過建立大鼠缺血再灌注損傷模型也發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽可抑制心肌凋亡從而減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。但是對于利拉魯肽在其中的作用并不十分明確，本實驗擬通過分離乳鼠心肌細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧模型，并用利拉魯肽進(jìn)行處理，探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

高糖DMEM(Gibco)，胎牛血清(Hyclone)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，一抗Akt、p- Akt、caspase- 3(Cell Signaling Technology)，相應(yīng)二抗(Abcam),胰蛋白酶(Sigma公司)，Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)，利拉魯肽(諾和諾德公司)，流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)。

1.2 乳鼠心肌細(xì)胞分離及鑒定

參照文獻(xiàn)記錄的方法分離心肌細(xì)胞[8]。選取出生1～3d的SD乳鼠，無菌操作迅速取出心室，放入預(yù)冷的D- Hanks液中，然后將心室剪成1mm3左右的組織塊,并用0.2%的胰蛋白酶消化，直至心肌組織塊消失。用消化終止液終止消化，1000 r·min-1離心15 min 沉淀細(xì)胞，用全培液重懸沉淀的細(xì)胞后接種于細(xì)胞培養(yǎng)皿，于CO2孵箱、37 ℃培養(yǎng)。采用心肌細(xì)胞α- actin 免疫熒光染色鑒定心肌細(xì)胞。

1.3 缺氧/復(fù)氧損傷模型制備

采用Koyama的方法配制缺氧液和復(fù)氧液[9]。缺氧液預(yù)先用高濃度氮氣1 L·min-1飽和30 min，用此培養(yǎng)基培養(yǎng)心肌細(xì)胞，然后放入充有高純度氮氣的密封袋，于常規(guī)培養(yǎng)箱(5%CO2、95%O2)培養(yǎng)為缺氧;復(fù)氧液用純氧1L·min-1飽和30min，然后用于培養(yǎng)心肌細(xì)胞，于常規(guī)培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，此為復(fù)氧。

1.4 實驗分組

取培養(yǎng)72 h的心肌細(xì)胞進(jìn)行實驗，分為3組。對照組：使用復(fù)氧液在常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h；缺氧/復(fù)氧組：缺氧條件培養(yǎng)3 h后復(fù)氧條件培養(yǎng)1 h；利拉魯肽組：在缺氧液和復(fù)氧液中加入終濃度為100 mmol的利拉魯肽，缺氧條件培養(yǎng)3 h后復(fù)氧條件培養(yǎng)1 h。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

實驗結(jié)束后， 用0.05%不含EDTA的胰酶消化細(xì)胞，2 000 r·min-1離心5 min,棄上清液，PBS 洗滌2次，收集細(xì)胞，使用500 μl Binding buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin V- FITC后混勻，加入碘化丙啶(PI)，室溫、避光反應(yīng)10～20 min，1 h內(nèi)上機(jī)檢測。

1.6 Western blot檢測Akt通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

將收集的各組心肌細(xì)胞加入裂解液，置于冰上然后于搖床上搖動15 min，4 ℃下12 000 r·min-1離心10 min，取上清。測定蛋白濃度，加入2×SDS上樣緩沖液和去離子水調(diào)整蛋白濃度，樣品100 ℃煮沸5 min，80 μg·孔-1蛋白上樣、電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜，洗膜后再用HRP標(biāo)記的相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。然后ECL發(fā)光液發(fā)光，拍照，用凝膠圖象處理系統(tǒng)分析目的條帶光密度值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析采用 SPSS 18.0軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間比較采用單因素方差分析(one- way ANOVA)，采用LSD法對組與組間進(jìn)行兩兩比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 乳鼠心肌細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

乳鼠心肌細(xì)胞種于玻片上，用alpha- actinin抗體進(jìn)行免疫熒光染色后鑒定，alpha- actinin陽性的細(xì)胞是心肌細(xì)胞，陰性的為成纖維細(xì)胞(圖1)。

2.2 利拉魯肽對缺氧/復(fù)氧引起的細(xì)胞凋亡的影響

使用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞凋亡情況，其中對照組細(xì)胞凋亡水平非常低[(1.0±0.3)%]，缺氧/復(fù)氧處理明顯增加細(xì)胞凋亡水平[(59.2±6.5)%]，在培養(yǎng)基中加入利拉魯肽可明顯抑制缺氧/復(fù)氧損傷引起的細(xì)胞凋亡[(32.7±3.5)%]。見圖2。

A.alpha- actinin免疫熒光染色;B.Hothest染細(xì)胞核;C.merge圖

圖1乳鼠心肌細(xì)胞

其中Q3象限表示存貨細(xì)胞，Q2為晚期凋亡細(xì)胞，Q4為早期凋亡細(xì)胞，計算細(xì)胞凋亡率時為Q3+Q4的和

圖2流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

2.3 心肌細(xì)胞Akt通路及相關(guān)蛋白的表達(dá)

收集實驗處理后的細(xì)胞，使用Western blot檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。caspase- 3是參與細(xì)胞凋亡的重要蛋白，我們的研究發(fā)現(xiàn)，與對照組細(xì)胞相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞caspase- 3的表達(dá)和剪切明顯增加，而利拉魯肽則能抑制caspase- 3的表達(dá)。Akt是caspase- 3的上游蛋白，具有抗凋亡作用，與對照組和缺氧/復(fù)氧組相比，利拉魯肽能上調(diào)Akt的表達(dá)并增加其磷酸化，從而減少caspase- 3的剪切，發(fā)揮抗凋亡作用。見圖3。

3 討 論

缺血再灌注損傷是心梗后患者心肌發(fā)生梗死的重要機(jī)制，其發(fā)生包括氧自由基的產(chǎn)生、細(xì)胞內(nèi)鈣超載等。GLP- 1是一種由腸腔遠(yuǎn)端L型細(xì)胞分泌的具有降血糖作用的激素。目前有關(guān)GLP- 1的研究多集中在其調(diào)節(jié)血糖方面，其可降低2型糖尿病患者血糖[10]。然而近幾年發(fā)現(xiàn)GLP- 1受體在心臟中也有表達(dá)，因此其對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用越來越受到關(guān)注[11]。利拉魯肽是GLP- 1的類似物，可與GLP- 1受體結(jié)合，激活其下游通路。Shiraki等[12]研究發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可濃度依賴性地減少氧自由基的產(chǎn)生，因此其可能有助于抑制缺血再灌注損傷的發(fā)生，能夠減小心肌梗死后心肌損傷面積，減少細(xì)胞凋亡。

與對照組相比,aP<0.05;與缺氧/復(fù)氧組相比,aP<0.05

A.Western blot結(jié)果圖；B、C.灰度值統(tǒng)計圖

圖3Westernblot檢測利拉魯肽對Akt通路及相關(guān)蛋白的激活

本研究采用分離乳鼠心肌細(xì)胞的方法，在體外構(gòu)建缺氧/復(fù)氧模型模擬在體情況下的心肌缺血再灌注損傷，探索利拉魯肽在抗缺血再灌注損傷中的作用機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)，缺氧/復(fù)氧能明顯增加心肌細(xì)胞的凋亡，而利拉魯肽則能對抗缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的凋亡的發(fā)生。細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞的程序性死亡，受細(xì)胞自身相關(guān)信號通路的調(diào)節(jié)，其中caspase- 3是參與細(xì)胞凋亡的重要分子。在一定條件刺激下，caspase- 3發(fā)生剪切，產(chǎn)生活性參與細(xì)胞凋亡[13]。本研究中，與對照組相比，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞caspase- 3表達(dá)和剪切明顯增加，與流式細(xì)胞結(jié)果相似，而利拉魯肽能減少caspase- 3的表達(dá)和剪切，從而抑制凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，在心梗后的大鼠中，利拉魯肽能增加Akt的磷酸化，Akt處于caspase- 3的上游，能調(diào)節(jié)caspase- 3活性發(fā)揮抗凋亡作用。

我們的研究也證實，利拉魯肽組細(xì)胞Akt磷酸化明顯增加，因而利拉魯肽可能通過激活A(yù)kt通路減少caspase- 3的表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗缺氧/復(fù)氧損傷作用。細(xì)胞凋亡的信號通路十分復(fù)雜，Akt是重要的抗凋亡分子，抑制Akt活性可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。而某些因素可以促進(jìn)Akt活性，抑制caspase- 3激活，從而發(fā)揮抗凋亡作用[14]。

綜上所述，缺氧復(fù)氧損傷可以激活caspase- 3，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生。而利拉魯肽可以通過增加Akt磷酸化以激活A(yù)kt通路，抑制caspase- 3的表達(dá)，發(fā)揮抗凋亡作用，改善缺氧/復(fù)氧損傷。

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LiraglutideactivatestheAktpathwaytoimprovemyocardialcellsofneonatalratswithhypoxia/reoxygenationinjury

ZHANGWen-juan,ZHOUXue,LIRui-xue,YANGQian,XIALi-fang,LIZhi-hong

(DepartmentofEndocrine,BaodingFirstCentralHospital,Baoding071000,China)

Objective: To study the effects of liraglutide on hypoxia/reoxygenation injury in neonatal rat cardiomyocytes and the underlying mechanism.MethodsThe cardiomyocytes were isolated from neonatal rats, and then divided into control group, hypoxia / reoxygenation group and liraglutide group. The model of hypoxia / reoxygenation injury was establishedinvitro. Apoptosis was detected by flow cytometry and apoptosis related proteins including caspase- 3, Akt, and phospho- Akt were detected by Western blot.ResultsCardiomyocytes of neonatal rats were treated with hypoxia / reoxygenation injury, compared with the control group, results of flow cytometry showed that hypoxia / reoxygenation injury could induce apoptosis of neonatal rat cardiomyocytes, while liraglutide had anti- apoptosis effects. Western blot showed that the expression of caspase- 3 was activated by the hypoxia / reoxygenation injury. While in the liraglutide group, the phosphorylation of Akt was increased, as a result, the expression and activation of caspase- 3 was suppressed.ConlusionLiraglutide could improve the hypoxia/reoxygenation injury by increasing Akt phosphorylation to activate the Akt pathway, suppress the expression of caspase- 3, and harbour an anti- apoptotic effect.

liraglutide; hypoxia/reoxygenation injury; Akt pathway; apoptosis; neonatal rats

2017- 02- 15

2017- 06- 30

保定市科學(xué)技術(shù)研究與發(fā)展指導(dǎo)計劃項目(16ZF110)

張文娟(1983-)，女，河北高陽人，主治醫(yī)師。E- mail：2283153844@qq.com

李志紅 E- mail：Lizhihonglfz@126.com

張文娟，周雪，李瑞雪，等. 利拉魯肽激活A(yù)kt通路改善乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷[J].東南大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版,2017,36(5)：764- 768.

R542.22;R33- 33

A

1671- 6264(2017)05- 0764- 05

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.05.016

(本文編輯：何彥梅)