(石家莊 050200)

河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院

實驗研究

補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響*

段彥蒼宋翠淼Δ杜惠蘭(石家莊 050200)

河北中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院

目的：探討補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方與Ⅲ號方高低劑量序貫使用、逍遙丸高低劑量序貫使用對促性腺激素預(yù)處理未成年小鼠排卵數(shù)目的影響。方法：17組未成年雌性小鼠腹腔注射血促性素(PMSG)、絨促性腺素(hCG)的基礎(chǔ)上在實驗第1～3 d灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方或逍遙丸高低劑量(對照組灌服蒸餾水)，實驗第4～5 d灌服Ⅲ號方或逍遙丸高低劑量(對照組灌服蒸餾水)。注射hCG后19 h在體式顯微鏡下將輸卵管壺腹部刺破，釋放出新鮮卵子，拍照后計數(shù)卵子數(shù)，對卵子數(shù)進(jìn)行單因素方差分析、析因分析。結(jié)果：單因素方差分析：補腎組以補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量序貫使用較對照組小鼠排卵數(shù)目增多(P=0.003)，析因分析表明二者序貫使用有交互作用(P=0.047)、排卵數(shù)目增多與使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高、低劑量有關(guān)(P=0.004)。逍遙組以逍遙丸高劑量、低劑量序貫使用較對照組小鼠排卵數(shù)目增多(P=0.007)，析因分析表明二者序貫使用有交互作用(P=0.046)、排卵數(shù)目增多與排卵期使用逍遙丸高、低劑量差異顯著(P=0.039)有關(guān)。結(jié)論：補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方使陰精盛助卵泡發(fā)育成熟而導(dǎo)致排卵數(shù)目增多；逍遙丸低劑量疏肝理氣助陰陽轉(zhuǎn)化順利可使排卵數(shù)目多。補腎法、疏肝法分別序貫使用可提高藥物療效。

補腎調(diào)經(jīng)方；逍遙丸；小鼠排卵障礙；排卵數(shù)目； 補腎法；疏肝法；促性腺激素

基于“腎為先天之本” “女子以肝為先天”等中醫(yī)理論以及腎虛、肝郁是導(dǎo)致排卵障礙性不孕的常見原因之一，課題團(tuán)隊對補腎法、疏肝法對女性生殖功能的影響進(jìn)行了系列研究。補腎調(diào)經(jīng)系列方是課題組在臨床上治療排卵障礙性月經(jīng)不調(diào)、不孕癥的基本方，臨床療效顯著。[1-3]其中補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方主要用于經(jīng)后期滋腎陰以促進(jìn)卵泡發(fā)育，補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號用于排卵期、黃體期溫腎陽理氣活血誘發(fā)排卵促進(jìn)黃體功能。課題組相關(guān)研究表明補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙散可促進(jìn)體外受精—胚胎移植術(shù) ( IVF- ET)患者優(yōu)質(zhì)胚胎率，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量改善妊娠結(jié)局。[4]本實驗在前期臨床研究的基礎(chǔ)上按照兩因素兩水平的析因分析探討卵泡期、排卵期灌服補腎調(diào)經(jīng)方、逍遙丸的高劑量、低劑量對促性腺激素預(yù)處理小鼠排卵數(shù)目的影響及其是否具有協(xié)同作用。

1 材料與方法

1.1 實驗藥物 注射用血促性素(PMSG，內(nèi)蒙古赤峰博恩藥業(yè)有限公司，批號081001)；注射用絨促性腺素(hCG，麗珠集團(tuán)麗珠制藥廠，批號090601B)；逍遙丸(河南省宛西制藥股份有限公司，批號090513)，實驗前將逍遙丸用蒸餾水溶成混懸液含生藥0.116 9 g/mL(高劑量組，等效于臨床用量的2倍)、0.058 5 g/mL(低劑量組，等效于臨床用量)，4℃保存；補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方購自石家莊樂仁堂，常規(guī)煎煮濃縮，低劑量每劑中藥濃縮為154 mL，高劑量每劑中藥濃縮為77 mL，4℃保存。

1.2 實驗動物 清潔級健康雌性昆明種小鼠102只，體質(zhì)量16～18 g，購自河北實驗動物中心，合格證號：2008-1-1003。普通實驗室環(huán)境喂養(yǎng)。

1.3 主要儀器 照相機：Nikon D60，尼康株式會社；連續(xù)變倍體視顯微鏡：SMZ-T4型，重慶奧特光學(xué)儀器有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 分組: 按照隨機數(shù)字表將小鼠隨機分為17組，每組6只。其中1組為對照組(灌服蒸餾水)，補腎組4組(卵泡期灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量、低劑量，排卵期灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量、低劑量)，逍遙組4組(卵泡期灌服逍遙丸高劑量、低劑量，排卵期灌服逍遙丸高劑量、低劑量)，補腎逍遙組4組(卵泡期灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量、低劑量，排卵期灌服逍遙丸高劑量、低劑量)，逍遙補腎組4組(卵泡期灌服逍遙丸高劑量、低劑量，排卵期灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量、低劑量)。

1.4.2 給藥方法: 試驗第1～3 d，補腎組和補腎逍遙丸組、逍遙組、逍遙補腎組小鼠分別灌服補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方(高劑量、低劑量)、逍遙丸(高劑量、低劑量)0.4 mL。試驗第3 d 13:00每只小鼠腹腔注射 5 IU PMSG；第4、5 d補腎組、逍遙補腎組、逍遙組、補腎逍遙丸組小鼠分別灌服Ⅲ號方(高劑量、低劑量)、逍遙丸(高劑量、低劑量)0.4 mL；注射PMSG后48 h各組小鼠均腹腔注射5 IU hCG 。

1.4.3 檢測方法:試驗第6 d 8:00用頸椎脫臼法處死小鼠，開腹取出兩側(cè)輸卵管和卵巢置10 cm培養(yǎng)皿中，暴露膨大透亮的輸卵管壺腹部，置體式顯微鏡下，用無菌4號半針頭刺破壺腹部，輕輕劃出卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，相同條件下拍照，電腦讀取照片計數(shù)新鮮卵子數(shù)目。

對補腎組、逍遙組、補腎逍遙組、逍遙補腎組進(jìn)行兩因素兩水平的析因設(shè)計的方差分析，比較4組小鼠卵泡期、排卵期灌服不同中藥的高劑量、低劑量對排卵數(shù)目的影響，以及不同階段序貫不同藥物、劑量有無交互作用，檢驗水準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 對未成年小鼠進(jìn)行超促排卵后輸卵管壺腹部膨大情況 各組小鼠輸卵管壺腹部均膨大透亮，見圖1箭頭所示，體式顯微鏡下可見：壺腹部充滿白色顆粒狀卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體，輸卵管表面可見平行輸卵管方向排列的細(xì)小血管，刺破輸卵管壺腹部，釋放出團(tuán)狀聚集的由顆粒細(xì)胞包繞的卵母細(xì)胞，詳見圖2。

2.2 各組小鼠排卵數(shù)目 單因素方差分析表明：與對照組比較，補腎組的4組中序貫使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量、補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量排卵數(shù)目增多(P=0.003)；逍遙組的4組中序貫使用逍遙丸高劑量、低劑量排卵數(shù)目增多(P=0.007)。結(jié)果詳見表1。

析因設(shè)計分析表明：補腎組促進(jìn)卵泡發(fā)育使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與低劑量排卵數(shù)目差異顯著(P=0.004)，補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量有交互作用(P=0.047)，結(jié)果詳見表2；逍遙組誘發(fā)排卵使用逍遙丸高、低劑量排卵數(shù)目差異顯著(P=0.039)，逍遙丸高、低劑量序貫使用有交互作用(P=0.046)，結(jié)果詳見表3。

單因素方差分析還顯示，與對照組比較，逍遙補腎組中的4組序貫使用逍遙丸低劑量與補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量排卵數(shù)也增多(P=0.013)，補腎逍遙組中的4組補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高劑量與逍遙丸低劑量序貫使用雖然排卵數(shù)多(P=0.039)，但統(tǒng)計分析逍遙丸、補腎調(diào)經(jīng)方無交互作用(P=0.838，P=0.604)。結(jié)果詳見表4、表5。

圖1 小鼠促性腺激素處理后的卵巢、輸卵管(箭頭所指部位為膨大的壺腹部)(×20)

圖2 小鼠輸卵管壺腹部釋放出的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(×40)

組別 排卵數(shù)P值對照組37.00±10.37補腎組Ⅱ高/Ⅲ高組71.60±19.680.00Ⅱ高/Ⅲ低組48.80±8.010.30Ⅱ低/Ⅲ高組37.00±16.791.00Ⅱ低/Ⅲ低組41.40±8.020.69逍遙組逍高/逍高組33.20±7.950.73逍高/逍低組67.60±13.240.01逍低/逍高組46.20±20.460.41逍低/逍低組52.00±14.710.18補腎逍遙組Ⅱ高/逍高組37.80±11.970.94Ⅱ高/逍低組60.60±19.830.04Ⅱ低/逍高組38.40±27.550.90Ⅱ低/逍低組51.40±20.600.19逍遙補腎組逍高/Ⅲ高組51.80±20.620.19逍高/Ⅲ低組48.60±24.430.30逍低/Ⅲ高組65.60±20.910.01逍低/Ⅲ低組58.40±20.110.24

注：P值，與對照組比較

表2 補腎組2×2 析因設(shè)計分析 (n=6)

表3逍遙組2×2析因設(shè)計分析(n=6)

組別MSFP逍遙丸低劑量2020.059.250.008逍遙丸高劑量8.450.040.847逍遙丸低劑量+逍遙丸高劑量1022.454.680.046

表4 補腎逍遙組2×2 析因設(shè)計分析 (n=6)

表5逍遙補腎組2×2析因設(shè)計分析(n=6)

組別MSFP補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方高劑量135.200.290.598逍遙丸低劑量696.201.490.239Ⅲ號方高劑量+逍遙丸低劑量20.000.040.838

3 討論

成功的排卵是指有卵母細(xì)胞及其周圍的卵丘顆粒細(xì)胞一起從卵巢排卵孔排出的過程。中醫(yī)學(xué)稱排卵期為“氤氳”或“的候”。卵泡的生長發(fā)育成熟、排卵、黃體生成與女性陰陽生長及相互轉(zhuǎn)化相一致，經(jīng)后期即卵泡生長，胞宮以藏為主，即肝、腎所藏之精血滋養(yǎng)沖任，陰長至極，重陰轉(zhuǎn)陽，呈氤氳之狀，此為女子排卵、種子的關(guān)鍵節(jié)點。

補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方中熟地黃、當(dāng)歸、白芍、山茱萸為《傅青主女科》名方養(yǎng)精種玉湯，為四物湯去辛溫活血之川芎加酸收養(yǎng)陰之山茱萸而成，可達(dá)血中養(yǎng)陰、陰中養(yǎng)精之功效；女貞子、枸杞子補益腎陰；山藥健脾補腎；紫河車甘溫，養(yǎng)血、益氣、補精，本方用于卵泡期可滋陰、養(yǎng)精血為卵泡發(fā)育提供物質(zhì)基礎(chǔ)。排卵期重陰轉(zhuǎn)陽，使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅲ號方，方中仙茅為“補腎陽之專藥”(《本草正義》)，淫羊藿“補腎虛，助陽”(《醫(yī)學(xué)入門》)，共為君藥；紫石英鎮(zhèn)心安神、暖子宮，肉蓯蓉“養(yǎng)命門、滋腎陰、補精血”(《本草匯言》)，菟絲子為“補脾腎肝三經(jīng)要藥，……，暖而能補腎中陽氣”(《本草經(jīng)疏》)，覆盆子補肝腎，“女子食之有子”(《藥性論》)，四藥助君藥溫腎陽、滋腎陰，共為臣藥；丹參、枳殼活血理氣，共為佐使。本方在排卵期使用可協(xié)助重陰轉(zhuǎn)陽誘發(fā)排卵。本實驗中，補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方高劑量使促性腺激素預(yù)處理小鼠誘發(fā)排卵數(shù)目較多，且使用補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方高低劑量有區(qū)別，推測與Ⅱ號方滋腎陰、養(yǎng)精血進(jìn)而充分促進(jìn)了卵泡發(fā)育成熟密切相關(guān)。與國醫(yī)大師夏桂成提出重陰有所不足，則精卵發(fā)育欠佳、排卵不利的臨床經(jīng)驗相一致。[5]實驗表明補腎調(diào)經(jīng)Ⅱ號方、Ⅲ號方序貫使用具有協(xié)同作用，即可以增強療效。從統(tǒng)計學(xué)角度說明補腎調(diào)經(jīng)方誘發(fā)排卵的作用是使精血充足促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟的前提下誘發(fā)排卵。灌服補腎調(diào)經(jīng)方的小鼠卵巢組織HE染色鏡下可見較多竇狀卵泡和竇前卵泡，表明補腎法有促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用，從形態(tài)學(xué)闡釋了腎為先天之本、藏先天之精的理論基礎(chǔ)。

逍遙丸為疏肝法的代表方劑，是中醫(yī)臨床廣泛應(yīng)用的“女科圣藥”。方中柴胡為君，為條達(dá)肝氣、疏肝解郁、調(diào)經(jīng)止痛之要藥，又引諸藥歸于肝經(jīng)。當(dāng)歸養(yǎng)血和血，白芍滋陰柔肝、養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，三藥共奏養(yǎng)肝以助肝用而為臣藥。白術(shù)健脾益氣，為脾臟補氣第一要藥，茯苓功善利水滲濕、健脾安神，甘草調(diào)和諸藥，薄荷疏散透達(dá)肝經(jīng)之郁滯，共為佐藥。諸藥合用，可使肝郁得疏，血虛得養(yǎng)，脾運得健，肝脾協(xié)調(diào)。本實驗中，卵泡期使用逍遙丸高劑量、排卵期使用低劑量，二者有協(xié)同作用，即逍遙丸高劑量促進(jìn)卵泡發(fā)育、低劑量誘發(fā)排卵，序貫應(yīng)用可增強療效。逍遙組中的4組，HE染色顯示卵泡期使用逍遙丸高劑量較低劑量有較多的竇狀卵泡，提示逍遙丸高劑量疏肝養(yǎng)血更有利于促進(jìn)卵泡發(fā)育成熟，精血同源，體現(xiàn)了肝主藏血的功能，從形態(tài)學(xué)闡釋肝主藏血、司血海的功能；排卵期逍遙丸低劑量可助陰陽轉(zhuǎn)化誘發(fā)排卵，體現(xiàn)了肝主疏泄、女子以肝為先天的功能對卵子的影響。

實驗中還發(fā)現(xiàn)一有趣的現(xiàn)象，逍遙丸低劑量與Ⅲ號方高劑量序貫使用、Ⅱ號方高劑量與逍遙丸低劑量序貫使用雖然排卵數(shù)也明顯增多，但析因設(shè)計分析二者無交互作用，即不具有增效作用。這可能從統(tǒng)計學(xué)角度闡釋了中醫(yī)的整體觀念。

[1] 杜惠蘭，閆華，白鳳樓，等. 補腎調(diào)經(jīng)系列方周期給藥治療功能失調(diào)性子宮出血的臨床研究[J]. 中國中西醫(yī)結(jié)合雜志,2003，23(3)：178-181

[2] 杜惠蘭，閆華，白鳳樓，等. 補腎調(diào)經(jīng)系列方周期給藥治療功能失調(diào)性子宮出血174例臨床研究[J].中醫(yī)雜志, 2004，45(7)：517-519

[3] 杜惠蘭，閆華，白鳳樓，等. 補腎調(diào)經(jīng)系列方對功能失調(diào)性子宮出血患者生殖激素及子宮內(nèi)膜激素受體的影響[J].中醫(yī)雜志.,2007，48(11)：986-988

[4] 梁瑩, 杜惠蘭, 趙勝男,等.體外受精—胚胎移植術(shù)聯(lián)合補腎、疏肝對不孕癥患者活化素受體樣激酶5的影響[J].中醫(yī)雜志, 2014,55(1 ):34-37

[5] 夏桂成.中醫(yī)臨床家叢書·夏桂成[M]. 北京：中國中醫(yī)藥出版社，2001.40-42

(2017-05-23 收稿)

EffectofBushenTiaojingFormulaandXiaoyaoWanonOvulationNumberofGonadotrophins-PreprocessedMice

DUANYan-cangSONGCui-miaoDUHui-lan(Shijiazhuang 050200)

College of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine, Hebei University of Chinese Medicine

Objective: to explore the effect of sequential use of high and low dose ofBushenTiaojingFormula (Kidney-reinforcing and Menstruation-regulating Formula)II and III, andXiaoyaoWanon ovulation number of gonadotrophins-preprocessed immature mice. Methods: 17 groups of immature female mice were given intraperitoneal injection of pregnant mares' serum gonadotropin (PMSG) and human chorionic gonadotropin (hCG) before being fed with high and low dose of Formula II orXiaoyaoWanon 1～3 days of the experiment, and with Formula III orXiaoyaoWanon 4～5 days (control group were fed with distilled water). After 19 hours of hCG injection, the ampulla of fallopian tube is cut under the stereomicroscope, releasing fresh ovum. Take a picture and count the ovum number which was then analyzed by one-way ANOVA and factorial analysis. Results: One-way ANOVA showed that the ovulation number ofBushengroup increased after sequential use of high and low dose ofBushenTiaojingFormula II and III, compared to control group (P=0.003); factorial analysis showed that there was interaction between the two sequential use (P=0.047), and the increase of ovulation number is related to high and low dose of Formula II (P=0.004). The ovulation number ofXiaoyaogroup increased after sequential use of high and low dosage ofXiaoyaoWan(P=0.007); factorial analysis showed that there was interaction between the two sequential use (P=0.046), and the increase of ovulation number is related to the difference between high and low dosage ofXiaoyaoWanin ovulation period (P=0.039). Conclusion:BushenTiaojingFormula II can enrich yin essence which contributes to follicular maturation so to increase the ovulation number; low dose ofXiaoyaoWancan sooth liver and regulate qi which contributes to yin-yang transformation so to increase the ovulation number. The sequential therapy ofBushenandShugan(soothing liver) can improve the curative effect of the medicine.

BushenTiaojingFormula;XiaoyaoWan; ovulation failure of mice; ovulation number;Bushentherapy;Shugantherapy; gonadotrophins

R285.5

A

1007-5615(2017)05-0001-04

* 國家自然科學(xué)基金資助項目：No.81303002；河北省自然科學(xué)基金資助項目：No.H2013206117；河北省教育廳資助項目：No.Q20122008

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