勒系意，黃運紅，任雨涵，陳柳萌

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梯度有機負荷下農(nóng)業(yè)廢棄物厭氧發(fā)酵特性及微生物群落

勒系意1，黃運紅1，任雨涵1，陳柳萌2※

（1. 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330022； 2. 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，南昌 330200）

為了解梯度負荷對不同C/N農(nóng)業(yè)廢棄物厭氧發(fā)酵特性及微生物群落的影響，該試驗以豬糞、金針菇菌包、稻稈和甘蔗葉等C/N差異較大的廢棄物作為原料，通過逐漸提高全混合厭氧反應(yīng)器（continuous stirred tank reactor, CSTR）的有機負荷率（organic loading rate，OLR），研究物料在4個OLR（1.11、1.67、2.22和2.78 g/(L?d)，以可揮發(fā)性固體計）下的產(chǎn)甲烷特性和微生物群落結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果表明：4種物料的日甲烷產(chǎn)量均隨OLR遞增而增加，但單位物料甲烷產(chǎn)率與微生物菌群結(jié)構(gòu)則因物料C/N差異而表現(xiàn)出不同的變化趨勢。其中：豬糞的日甲烷產(chǎn)量最高，細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)與對照組相比變化不大；多樣性指數(shù)先增后減，甲烷產(chǎn)率也在OLR達到1.67 g/(L?d)后逐漸下降。金針菇菌包甲烷產(chǎn)率相對穩(wěn)定，細菌和古菌的多樣性指數(shù)隨OLR遞增而增長。稻稈和甘蔗葉同屬于碳質(zhì)量分數(shù)高的秸稈類物料，二者的細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)變化明顯；但在OLR達到2.78g/(L?d)時，稻稈受系統(tǒng)酸化（VFA/TIC>0.8）影響，甲烷產(chǎn)率下降明顯，細菌和古菌的多樣性指數(shù)也出現(xiàn)下降；而甘蔗葉則因VFA/TIC<0.8，其甲烷產(chǎn)率在發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯下降。此外，不同C/N物料對優(yōu)勢菌的形成存在影響。其中：為豬糞物料特有的優(yōu)勢古菌；，為金針菇菌包、甘蔗葉特有的優(yōu)勢細菌；為稻稈物料獨有的優(yōu)勢古菌。

廢棄物；發(fā)酵；沼氣；C/N；產(chǎn)甲烷特性；菌群結(jié)構(gòu)

0 引 言

近年來，隨著現(xiàn)代農(nóng)業(yè)規(guī)?；?、集約化的快速發(fā)展，廢棄物產(chǎn)量呈爆發(fā)式快速增長趨勢。相對發(fā)展滯后的資源利用技術(shù)和裝備，以及廢棄物產(chǎn)權(quán)屬性、政府監(jiān)管困難等客觀原因，導(dǎo)致農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用方式粗放，甚至直接燃燒或隨意堆棄，嚴重危害到我國農(nóng)村生態(tài)環(huán)境、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)境和農(nóng)民生活環(huán)境[1]。

當(dāng)前，厭氧發(fā)酵制備沼氣是農(nóng)業(yè)廢棄物能源化利用中工程化程度最為高的一種技術(shù)，其厭氧微生物作為發(fā)酵過程中生命活性的主體[2]，其數(shù)量、種類、活性以及與物料之間的傳質(zhì)是影響沼氣發(fā)酵效率的關(guān)鍵因素。C/N作為發(fā)酵物料的一個重要特性，可直接影響微生物的新陳代謝，并通過影響有機物中碳的轉(zhuǎn)化進而影響沼氣產(chǎn)量，是近年來相關(guān)研究的焦點[3-4]。通常具有較佳產(chǎn)氣性能的發(fā)酵物料一般都具有適宜沼氣發(fā)酵的C/N（10～30:1）[5]。例如，豬糞的C/N約為12～14:1，甲烷產(chǎn)率達可到390 mL/g（OLR=1.36 g/(L?d)）[7]；玉米粉的C/N約為30:1，甲烷產(chǎn)率可達361 mL/g（OLR=1.70 g/(L?d)）[6]；餐廚垃圾因組成多樣，其結(jié)果各有差異，但均表現(xiàn)出較高的甲烷產(chǎn)率（537 mL/g，C/N=22:1，OLR=1.46 g/(L?d)[6]；401 mL/g，C/N=13:1，OLR=2.50 g/(L?d)）[8]。而當(dāng)C/N偏高時，因發(fā)酵系統(tǒng)面臨酸抑制風(fēng)險以及低氮質(zhì)量分數(shù)對菌群繁殖的影響，物料的產(chǎn)氣性能表現(xiàn)不佳。以稻稈（C/N=44:1）、木薯渣（C/N=67:1）、玉米稈（C/N=43:1）為例，其甲烷產(chǎn)率較差，分別僅為134 mL/g（OLR=1.48 g/(L?d)）[7]、246 mL/g（OLR=1.49 g/(L?d)）[7]、186 mL/g（OLR=1.64 g/(L?d)）[7]。當(dāng)?shù)|(zhì)量分數(shù)偏高，如以雞糞（4:1）[8]為發(fā)酵物料，其甲烷產(chǎn)率較低，為277 mL/g（OLR=1.62 g/(L?d)）。相應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)研究也表現(xiàn)出類似的變化趨勢：適宜的C/N有助于發(fā)酵微生物的生長繁殖，發(fā)酵系統(tǒng)的菌群結(jié)構(gòu)組成也更加豐富；C/N過高、過低均會引起發(fā)酵菌群活性的降低。此外，李東等[9]通過雞糞混合稻草方式調(diào)節(jié)物料C/N，以此獲得更佳的厭氧產(chǎn)氣性能。由此可見，無論是單一物料、還是混合物料，C/N均是一個調(diào)控厭氧發(fā)酵過程的關(guān)鍵參數(shù)，不僅影響著厭氧產(chǎn)氣性能，而且對微生物的菌群結(jié)構(gòu)、數(shù)量及變化規(guī)律存在較大影響。但是，上述研究多為固定有機負荷下的連續(xù)厭氧發(fā)酵；缺乏梯度有機負荷條件下的厭氧產(chǎn)氣特性及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化規(guī)律研究，以及不同C/N物料之間差異性分析。

為此，本研究選擇豬糞、金針菇菌包、稻稈和甘蔗葉等4種C/N差異較大的廢棄物作為發(fā)酵物料，分別進行單一物料的連續(xù)厭氧發(fā)酵試驗，在梯度有機負荷條件下，考察不同C/N物料的日產(chǎn)甲烷量、單位甲烷產(chǎn)率、pH、氨氮（NH4+-N）濃度、揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acids，VFAs）濃度、碳酸氫鹽（TIC）堿度和VFA/TIC等指標的變化趨勢；分析不同負荷階段的優(yōu)勢菌群及菌群變化規(guī)律。以此，為提高不同類型物料的產(chǎn)氣效率及優(yōu)化多原料混合發(fā)酵提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 發(fā)酵原料與接種物

甘蔗葉取自廣東省湛江市甘蔗園，陰干后粉碎至1 mm備用；金針菇菌包取自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所金針菇示范基地，陰干后粉碎至1 mm備用；水稻秸稈取自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所試驗田，陰干后粉碎至1 mm備用；新鮮豬糞取自江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所豬場，經(jīng)簡單手工剔除動物毛發(fā)和大塊石子等雜物后置于4 ℃冰柜內(nèi)備用；4種發(fā)酵物料的基本特性如表1所示；接種物取自江西省新余市羅坊鎮(zhèn)沼氣站正常運行的沼氣工程發(fā)酵罐（以豬糞為原料），基本特性如表2所示。

表1 發(fā)酵物料的基本特性

注：實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，下同。

Note: Experimental data are expressed as Mean±SD, same as below.

表2 接種物的基本特性Table 2 Basic characteristics of inoculum

注：TIC代表碳酸氫鹽堿度，VFA代表的揮發(fā)性脂肪酸濃度。

Note: TIC is bicarbonate alkalinity; VFA is volatile fatty acid.

1.2 接種物的活化

接種物的活化方法[10]：首先將厭氧污泥調(diào)總固形物質(zhì)量分數(shù)（TS）為6%，加入質(zhì)量分數(shù)1%的活性炭，然后以豬糞為原料在厭氧反應(yīng)器中進行厭氧發(fā)酵（OLR=0.5 g/(L?d)，以揮發(fā)性固體計），待產(chǎn)氣穩(wěn)定后（日產(chǎn)氣量無顯著性差異）的罐內(nèi)發(fā)酵物即為本實驗所需的接種物。

1.3 試驗裝置與設(shè)計

試驗裝置采用自行改裝的厭氧發(fā)酵反應(yīng)器，該裝置分A（發(fā)酵單元）、B（酸性氣體吸附）和C（甲烷體積測量）3個單元。其中A單元是購自瑞典碧普（Sweden Bioprocess）的2 L裝厭氧發(fā)酵罐（有效容積1.8 L），每個發(fā)酵瓶配有可調(diào)轉(zhuǎn)速的機械攪拌系統(tǒng)；B單元配有3 mol/L氫氧化鈉溶液以吸附沼氣中的酸性氣體（CO2和H2S等，溴百里酚酞指示劑顯示吸收容量上限）；C單元采用排水法收集甲烷并測量其體積（圖1）。

注：A為發(fā)酵單元（1-1：進料斗，1-2：攪拌軸，1-3：出料閥，1-4：出氣閥，1-5：水浴鍋）；B為CO2吸收單元；C為測氣單元（3-1：集氣瓶，3-2：集水瓶）

分別向4個厭氧發(fā)酵反應(yīng)器中，按VS接種物﹕VS物料= 2:1的比例加入接種物和物料（總質(zhì)量為1.8 kg，TS質(zhì)量分數(shù)約6%）；按圖1所示組裝厭氧發(fā)酵反應(yīng)器裝置，關(guān)閉出料閥（1-3），打開出氣閥（1-4），通過進料口（1-1）向反應(yīng)器中鼓吹氮氣30～45 s，以排空反應(yīng)器內(nèi)部空氣，確保發(fā)酵的厭氧環(huán)境；然后將發(fā)酵單元（A）置于水浴鍋（1-5）內(nèi)；待37 ℃厭氧發(fā)酵至日產(chǎn)甲烷量低于100 mL/d后，開始進入連續(xù)厭氧發(fā)酵階段，即分別投加4種發(fā)酵物料（甘蔗葉、金針菇菌包、稻稈和豬糞），進行中溫（37±1 ℃）連續(xù)厭氧發(fā)酵。設(shè)計OLR分別為1.11、1.67、2.22和2.78 g/(L?d)，以可揮發(fā)性固體計；水力停留時間為30 d，日進料總量為60 g（各物料添加量詳見表3，由蒸餾水補足至60 g）。每天進料6 h后按每隔3 h攪拌10 min的頻率進行定時攪拌；每天上午9:00記錄甲烷體積；每隔3d對發(fā)酵出料檢測pH、碳酸氫鹽（TIC）堿度、氨氮（NH4+-N）濃度和揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）濃度。

表3 發(fā)酵物料的添加量

1.4 分析方法

總固形物（TS）濃度和揮發(fā)性固體（VS）濃度采用稱質(zhì)量法測定[11]。甲烷產(chǎn)量采用沼氣通過氫氧化鈉溶液后采用排水法測定。發(fā)酵液pH值在取樣后立即采用上海雷磁PHS-3C型酸度計測定。發(fā)酵液的揮發(fā)酸（VFAs）濃度和碳酸氫鹽（TIC）堿度采用Nordmann聯(lián)合滴定法[12]測定，樣品在4 ℃條件下6 000 r/min離心10 min，取上清液進行指標測定。氨氮（NH4+-N）濃度采用納氏試劑分光光度法[13]，并通過公式（1）折算游離氨濃度，其中pH指pH值。發(fā)酵物料的產(chǎn)甲烷潛力（biochemical methane potential，BMP，即發(fā)酵物料的每克可揮發(fā)性固體組分所產(chǎn)生的甲烷標準體積）采用瑞典BioProcess公司研發(fā)的全自動產(chǎn)甲烷潛力分析測試系統(tǒng)（AMPTS II）進行測定[14]。

1.5 群落結(jié)構(gòu)分析方法

1.5.1 基因組總DNA的提取

為保證條件的均一穩(wěn)定，在發(fā)酵物料的4個OLR中取甲烷產(chǎn)率穩(wěn)定期的出料為樣品，即從當(dāng)日的出料中取6-8mL發(fā)酵液存于10 mL的離心管中，?80 ℃保存，實驗結(jié)束后統(tǒng)一進行基因組DNA提取。其中，對照組的取樣時間為各物料進入連續(xù)厭氧發(fā)酵階段的前1 d。采用蛋白酶K法進行基因組DNA提取，具體方法參見文獻[15]。

1.5.2 PCR擴增

擴增對象為細菌16s rDNA的V3可變區(qū)；引物為518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）和341F（5′-CCTACGGGAGGCAGCAG-3′）；對于古菌，引物為518R（5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′）和109F（5′-ACGGCTCAGTAACACGT-3′）；為提高變性梯度凝膠電泳（DGGE）分辨率，在518R的5′端加GC夾子（-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGCACGGGGGG-）[16-18]。

反應(yīng)體系：天根Mastermix 12.5L，引物各1L，模板2L，加無菌水至25L。產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

反應(yīng)條件：對于細菌，94 ℃預(yù)變性4 min，然后94 ℃變性45 s，55 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，最后72 ℃保溫7 min，30個循環(huán)；對于古菌，94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性1 min，56 ℃退火37 s，72 ℃延伸1 min，最后72 ℃保溫10 min，35個循環(huán)。

1.5.3 變性梯度凝膠電泳

在INGENY phorU- 2Dcode Universal Mutation system上進行DGGE分析，聚丙烯酰胺凝膠質(zhì)量分數(shù)為8%，細菌和古菌的變性劑濃度范圍分別是35%～65%和35%～50%，在1×TAE緩沖液（稱量三羥甲基氨基甲烷 242 g和乙二胺四乙酸 18.612 g于1 L燒杯中，用800 mL去離子水溶解；加入57.1 mL的冰乙酸；用NaOH調(diào)pH值至8.3，加去離子水定容至1 L后，室溫保存）中，以220 V電壓，60 ℃預(yù)電泳10 min，然后以140 V電壓，60 ℃恒溫電泳8 h。電泳結(jié)束后，進行硝酸銀染色[19]并拍照。用Quantity One軟件對DGGE圖譜進行分析。

1.5.4 DGGE條帶回收及序列分析

選擇DGGE圖譜中清晰的優(yōu)勢條帶，切膠并溶于30L滅菌水中，4 ℃過夜，然后取1L做模板進行PCR反應(yīng)，引物不帶GC“夾子”外，反應(yīng)條件同上。將重新擴增的DNA片段切膠回收和純化后，連接到pMD18-T載體上，并轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，篩選陽性克隆，進行16sRNA測序，登陸NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)，將測序結(jié)果與數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行比對分析。Shannon-Wiener指數(shù)（）采用公式（2）計算。

式中為豐富度，為第條帶的灰度值與該泳道所有條帶灰度值總和的比值。

2 結(jié)果分析

2.1 4種物料產(chǎn)甲烷潛力

試驗結(jié)果表明：4種物料（豬糞、金針菇菌包、稻稈、甘蔗葉）的產(chǎn)甲烷潛力分別為387.4±8.6、210.2±12.0、269.0±8.8和152.4±16.7 mL/g（以揮發(fā)性固體計），按大小排序依次分別為：豬糞>稻稈>金針菇菌包>甘蔗葉。其中：豬糞因氮質(zhì)量分數(shù)高，在產(chǎn)甲烷潛力測試中表現(xiàn)最好。稻稈和甘蔗葉的纖維結(jié)構(gòu)致密復(fù)雜，且纖維素和半纖維素等可甲烷化的物質(zhì)組成被木質(zhì)素包裹，很難被酶水解成可發(fā)酵性糖，加之較高的C/N，導(dǎo)致它們的產(chǎn)甲烷潛力遠低于豬糞物料。金針菇菌包為食用菌栽培后的廢棄物（以木屑、棉籽殼、麥麩等為主），雖然擁有適宜厭氧發(fā)酵的C/N（23.7:1），但子實體在生長過程中消耗了大量的纖維素和半纖維素，致使其產(chǎn)甲烷潛力低于C/N（66:1）更高的稻稈。這表明：除C/N外，物料的產(chǎn)甲烷潛力還受物料組成、物理結(jié)構(gòu)等因素影響。

2.2 單一物料的連續(xù)厭氧發(fā)酵特性

2.2.1 4種不同C/N物料的產(chǎn)甲烷特性變化

日產(chǎn)甲烷量是連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中一個重要監(jiān)測指標，能夠直觀反映發(fā)酵物料的產(chǎn)氣性能。如圖2a可知，在連續(xù)厭氧發(fā)酵反應(yīng)器中，4種物料的日產(chǎn)甲烷量均隨OLR的遞增而增加；按大小排序依次為豬糞＞稻稈＞金針菇菌包＞甘蔗葉。其中：豬糞的厭氧產(chǎn)氣表現(xiàn)最好，對OLR增加響應(yīng)迅速；其余3種物料的日產(chǎn)甲烷量隨OLR的增加而響應(yīng)滯后、且增速較緩。

甲烷產(chǎn)率通常用于分析物料在某一發(fā)酵條件下的產(chǎn)甲烷能力，其產(chǎn)甲烷潛力轉(zhuǎn)化率（簡稱BMP轉(zhuǎn)化率）可反映在當(dāng)前發(fā)酵條件下對產(chǎn)甲烷潛力的釋放程度。如圖2b所示，4種物料的甲烷產(chǎn)率按大小排序依次為豬糞＞稻稈＞金針菇菌包＞甘蔗葉。通過SPASS軟件對4種物料在不同OLR階段的甲烷產(chǎn)率進行差異性分析可知（見表4），隨OLR遞增，不同C/N物料的產(chǎn)甲烷特性變化趨勢各有差異；其中：豬糞的甲烷產(chǎn)率在第2～4個OLR中表現(xiàn)出較為明顯的下降趨勢，BMP轉(zhuǎn)化率由94.48%降至85.83%；稻稈在前3個OLR的甲烷產(chǎn)率無顯著性變化，但在第4個OLR時，甲烷產(chǎn)率下降明顯，BMP轉(zhuǎn)化率也由79.78%降至65.24%；而金針菇菌包與甘蔗葉在整個發(fā)酵期間，甲烷產(chǎn)率的變化無顯著性差異，但BMP轉(zhuǎn)化率不高，均未超過70%。

a. 日產(chǎn)甲烷量的變化情況a. Change of daily methane production b. 單位甲烷產(chǎn)率的變化情況b. Change of methane yield

表4 不同C/N物料的平均甲烷產(chǎn)率*和BMP轉(zhuǎn)化率**

注：顯著性水平為0.05，“*”平均甲烷產(chǎn)率為物料在不同OLR下的甲烷產(chǎn)率的平均值，“**”BMP轉(zhuǎn)化率為物料在不同OLR下的平均單位甲烷產(chǎn)率與其甲烷潛力的比值（以百分比計），表中相同字母表示無顯著性差異。

Note: Significant difference value is 0.05, “*” average methane yield is the average of daily methane yield under different OLR, “**” BMP conversion rate is defined as average methane yield of material under different OLR against its methane potential (in percentage terms), the same letter in the table shows no significant difference..

2.2.2 不同C/N物料的pH值、NH4+-N、VFAs和VFA/TIC變化

pH值、NH4+-N、VFAs和VFA/TIC等參數(shù)與厭氧微生物的物質(zhì)代謝和發(fā)酵活動密切相關(guān)。根據(jù)已報道文獻提出的穩(wěn)定參考限值如表5所示。

表5 厭氧發(fā)酵參數(shù)的穩(wěn)定性限值[5,20-21]

如圖3所示，不同物料之間的發(fā)酵特性存在較大差異，其C/N差異直接影響4個參數(shù)的變化趨勢。除pH值在7.5～8.0間波動外，豬糞發(fā)酵液的VFAs和NH4+-N濃度均隨OLR遞增而增加，其中：VFAs濃度和VFA/TIC均在穩(wěn)定范圍內(nèi)變化；NH4+-N濃度則在第79 d（第3個OLR）時達到5 235 mg/L，突破了5 000 mg/L的穩(wěn)定參考限值。經(jīng)公式（1）折算，此時的游離氨濃度約為308 mg/L，是200 mg/L（Liu等[22]認為低于200 mg/L的游離氨濃度有利于厭氧發(fā)酵）的1.54倍，使得第3、4個OLR下的氨抑制作用顯著增強，這與其甲烷產(chǎn)率的逐步下降趨勢一致；但由于接種物源自以豬糞為主要原料的沼氣工程，發(fā)酵菌群對高濃度的氨氮具有一定的耐受性[23]，使其在第4個OLR下仍可釋放85.83%的產(chǎn)甲烷潛力。金針菇菌包的VFAs濃度和VFA/TIC隨OLR遞增而增加，pH值和NH4+-N濃度則隨OLR遞增呈下降趨勢，但4個參數(shù)均處于穩(wěn)定范圍內(nèi)，推測這是甲烷產(chǎn)率保持相對穩(wěn)定的主要原因。稻稈和甘蔗葉的VFAs濃度及VFA/TIC隨OLR遞增均呈現(xiàn)增加趨勢；而pH值則逐漸下降，并且在第4個OLR時均小于6.5的穩(wěn)定值下限，表明VFA的累積超出了發(fā)酵系統(tǒng)的緩沖能力，發(fā)酵系統(tǒng)面臨酸化風(fēng)險，這也是稻稈的甲烷產(chǎn)率在VFA/TIC超過0.8后明顯下降的主要原因。

圖3 不同C/N物料的厭氧發(fā)酵特性參數(shù)隨時間變化

2.3 細菌菌群結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 細菌DGGE電泳圖譜及特征條帶序列分析

DGGE 圖譜中條帶的數(shù)目、強度及遷移位置反映了樣品中微生物種群的多樣性。理論上圖譜中每一個條帶代表某個微生物優(yōu)勢菌群，條帶數(shù)目及強度與微生物的種類及相對含量成正比，通過測序和序列比對,可以得出此優(yōu)勢菌群的種類。

如圖4所示，4種物料細菌的菌群結(jié)構(gòu)在連續(xù)厭氧發(fā)酵過程中的表現(xiàn)各有不同。與對照組相比，豬糞的菌落結(jié)構(gòu)在發(fā)酵過程中保持相對穩(wěn)定，推測其原因是接種物取自以豬糞為原料的沼氣工程，菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)適應(yīng)了氮素豐富的豬糞物料；僅靠OLR的增加無法引起菌群結(jié)構(gòu)上的明顯變化，但會引起主要優(yōu)勢細菌在種類和相對含量上的變化，特別是在氨氮濃度大幅超過穩(wěn)定限值后（第4個OLR）的變化最為明顯，這表明主要優(yōu)勢細菌為應(yīng)對氨抑制的增強正在作出適應(yīng)性調(diào)整。其余3種物料的菌群結(jié)構(gòu)在發(fā)酵過程中變化明顯，OLR的增加不僅產(chǎn)生了新的條帶，而且主要優(yōu)勢細菌的種類和相對含量也隨之變化，其中：金針菇菌包的主要優(yōu)勢細菌在第3個OLR后的變化不大，而甘蔗葉和稻稈的主要優(yōu)勢細菌則在種類和相對含量不斷改變以適應(yīng)物料OLR的增加。

注：編號1~5為金針菇菌包、6~10為甘蔗葉、11~15為豬糞、16~20為稻稈；橫坐標中2,7,12,17為1.11 g?((L?d)-1)負荷；3,8,13,18為1.67 g?((L?d)-1)負荷；4,9,14,19為2.22 g?((L?d)-1)負荷；5,10,15,20為2.78 g?((L?d)-1)負荷；1,6,11,16為對照組,下同。A~K為條帶編號。

從圖4中選取11個條帶進行割膠克隆，送上海生工測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行局部同源性比較，比對結(jié)果如表6所示，主要為水解和發(fā)酵類細菌。條帶A，B，K屬擬桿菌屬()，專性厭氧，有降解蛋白胨或葡萄糖等產(chǎn)酸的功能[24]，為甲烷轉(zhuǎn)化提供前體。條帶C屬于梭菌屬()，專性厭氧，可以分解淀粉、纖維二糖、葡萄糖為碳源和能量，生產(chǎn)氫、乙酸等，但不能利用纖維素[25]；推測這是在豬糞發(fā)酵液中條帶亮度較強的主要原因。條帶D屬脫硫代硫酸鹽弧菌屬()，嚴格厭氧，主要發(fā)酵終產(chǎn)物為乙酸鹽和琥珀酸鹽[26]，是甘蔗葉對照組中的優(yōu)勢細菌，但在進入連續(xù)發(fā)酵后逐漸消失。條帶E是擬桿菌門一個新屬，首次是從海洋沉積物中的分離獲得，兼性厭氧，具有產(chǎn)酸功能[27]；在豬糞發(fā)酵液中的條帶亮度最高。條帶F屬于普雷沃菌屬()，可降解蛋白產(chǎn)生乙酸，在金針菇菌包、甘蔗葉和稻稈的發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)，這與史偉宏[8]等在果蔬、麥秸等富含纖維物料的發(fā)現(xiàn)普雷沃菌屬()的結(jié)論一致。條帶G為解纖維素醋弧菌，屬于醋弧菌屬()[4]，嚴格厭氧，降解纖維素類物質(zhì)產(chǎn)酸，并對發(fā)酵液中的酸性環(huán)境有較好的耐受和調(diào)節(jié)能力。條帶H和條帶I分別屬于羧酸利用桿菌屬()和密螺旋體屬()，這2類菌的作用相似，促進物料中的多糖、單糖等水解和產(chǎn)酸[8]。

表6 DGGE圖譜中不同條帶的序列比對結(jié)果

2.3.2 細菌菌群多樣性分析

Shannon-Wiener指數(shù)（）是反映了細菌菌群多樣性高低的常見方法。如圖5所示：稻稈的指數(shù)介于2.671～3.396，豬糞的指數(shù)介于2.668～3.198，甘蔗葉的指數(shù)介于2.147～3.020，金針菇菌包的指數(shù)介于1.922～3.394。豬糞的多樣性指數(shù)較對照組相比均有不同程度的下降，且隨OLR遞增呈現(xiàn)先增后減的現(xiàn)象；這表明在第1個OLR時，細菌就因游離氨的細胞毒性（氨氮濃度超過3 000 mg/L）出現(xiàn)減少，多樣性指數(shù)大幅下跌，但由于氮素濃度的增長處于細菌菌群的耐受范圍，細菌逐漸適應(yīng)，其種類逐漸恢復(fù)，多樣性指數(shù)回升；直至第4個OLR時，因氨氮濃度大幅超過穩(wěn)定限值，細菌菌群重新受到抑制，多樣性指數(shù)又出現(xiàn)回落。金針菇菌包的多樣性指數(shù)隨著OLR遞增而增加，這表明適宜的C/N不僅有助于發(fā)酵系統(tǒng)的穩(wěn)定，也為細菌的增殖提供了良好的生長環(huán)境。甘蔗葉和稻稈的多樣性指數(shù)隨著OLR遞增而增加，但在第4個OLR后，細菌因酸累積抑制導(dǎo)致指數(shù)遞減。

圖5 細菌的Shannon-Weaver指數(shù)

2.4 古菌菌群變化

2.4.1 古菌DGGE圖譜及特征條帶序列分析

如圖6所示：與對照組相比，豬糞物料中的菌群結(jié)構(gòu)無明顯變化，只是代表主要優(yōu)勢古菌的條帶亮度在逐漸增強；直至第4個OLR時，主要優(yōu)勢古菌的種類和相對含量從出現(xiàn)較大的改變，推測這是古菌菌群在氨氮濃度大幅超過5 000 mg/L后作出的適應(yīng)性調(diào)整。金針菇菌包和甘蔗葉在發(fā)酵過程中的菌群結(jié)構(gòu)變化較大，其條帶數(shù)量與對照組相比明顯增多，而且主要優(yōu)勢古菌的種類和相對含量也發(fā)生了較大變化，表明古菌菌群正在不斷適應(yīng)物料OLR的遞增。稻稈物料的菌群結(jié)構(gòu)與對照組相比變化最大，不僅形成了新的優(yōu)勢古菌，而且對照組中的主要優(yōu)勢古菌在連續(xù)發(fā)酵過程中逐漸消失。

注：a~n為條帶編號

從圖6中選取14個條帶進行割膠克隆，送上海生工測序，測序結(jié)果經(jīng)Blast程序與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進行局部同源性比較，比對結(jié)果如表7所示。1）條帶a，b，i，j，l屬于甲烷桿菌屬（），極端嚴格厭氧，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，利用甲酸鹽、H2等電子供體還原CO2為CH4[28]。其中：條帶a在金針菇菌包、甘蔗葉的發(fā)酵期間隨OLR的遞增逐漸減弱；條帶b在金針菇菌包、甘蔗葉和豬糞發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)；條帶i，j，l在4種發(fā)酵物料的所均有發(fā)現(xiàn)。2）條帶c屬于甲烷熱球菌屬()，極端嚴格厭氧，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[28-29]，在金針菇菌包、甘蔗葉和豬糞發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)。3）條帶e，f，k分別屬于甲烷球菌屬()、甲烷短桿菌屬()和甲烷囊菌屬()，極端嚴格厭氧，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌[30-31]，其中：條帶e在稻稈和甘蔗葉的發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)；條帶f在金針菇、甘蔗葉和稻稈的發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)，且在金針菇和甘蔗葉的發(fā)酵中表現(xiàn)出隨OLR遞增逐漸減弱的趨勢；條帶k盡管在4種物料的發(fā)酵液中均有發(fā)現(xiàn)，但在甘蔗葉和稻稈中的條帶清晰、相對含量較高。JOBLIN等[30]在反芻動物瘤胃內(nèi)發(fā)現(xiàn)上述3個屬的大部分古菌，推測這3種古菌比較適宜于纖維類物料的厭氧發(fā)酵。4）條帶n屬于甲烷螺菌屬()，極端嚴格厭氧，為氫營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷菌[28,29]，僅在稻稈發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)。5）條帶m屬于甲烷鬢菌屬()，極端嚴格厭氧，為乙酸營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌，以乙酸為唯一能源，代謝產(chǎn)物為CH4和CO2，乙酸和CO2是其生長的碳源[31]；為金針菇菌包、甘蔗葉和稻稈等富含纖維物料發(fā)酵液中所共有；在果蔬廢棄物[32]、秸稈[24,33]、青貯飼用甜菜[34]、造紙廢水[35]等為原料的厭氧發(fā)酵罐及反芻動物瘤胃中均能檢測到甲烷鬢菌屬()，推測其在富含纖維物料的厭氧消化過程中發(fā)揮重要作用。6）條帶g屬于甲烷葉菌屬（），極端嚴格厭氧，最適pH為6.50～6.80，為甲基營養(yǎng)型產(chǎn)甲烷古菌[28-29]，利用甲基類化合物（如甲醇）、甲胺類化合物（如甲胺、二甲胺、三甲胺）和甲基硫化合物（如甲硫醇、二甲基硫）進行生產(chǎn)CH4，逐漸成為豬糞發(fā)酵的主要優(yōu)勢古菌。7）條帶d為，是從人體糞便分離出的第3個產(chǎn)甲烷古菌新種，只能在H2/甲醇條件下生產(chǎn)CH4，現(xiàn)被歸到產(chǎn)甲烷古菌的第7個目中[36-37]，是豬糞和金針菇菌包發(fā)酵液中的優(yōu)勢古菌，而在稻稈和甘蔗葉的發(fā)酵過程中逐漸丟失。

表7 DGGE圖譜中不同條帶的序列比對結(jié)果

2.4.2 古細菌菌群多樣性分析

如圖7所示：金針菇菌包的指數(shù)介于2.254～3.139，甘蔗葉的指數(shù)介于2.589～3.394，豬糞的指數(shù)介于2.400～3.070，稻草秸稈的指數(shù)介于1.763～2.860。其中：豬糞的古菌多樣性指數(shù)，較對照組相比均出現(xiàn)不同程度的下降，且隨OLR的遞增呈先增后減的趨勢，這與細菌的多樣性指數(shù)的變化趨勢類似，表明古菌菌群在連續(xù)發(fā)酵過程中同樣受到了游離氨的抑制。金針菇菌包的多樣性指數(shù)隨著OLR遞增而增加。稻稈的多樣性指數(shù)在發(fā)酵過程中表現(xiàn)出隨OLR遞增而增加，但在第4個OLR時，因系統(tǒng)酸累積影響，其多樣性指數(shù)出現(xiàn)下降現(xiàn)象。甘蔗葉的多樣性指數(shù)的呈先增后減再增，表明古菌菌群的種類變化比較劇烈，這說明發(fā)酵系統(tǒng)的不穩(wěn)定直接影響了古菌菌群結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

圖7 古菌的Shannon-Weaver指數(shù)

3 結(jié) 論

1）受物料C/N的差異影響，4種物料在發(fā)酵特性與微生物菌群結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出不同的變化趨勢。豬糞的氮素豐富，日產(chǎn)甲烷量最高，且隨OLR遞增而響應(yīng)迅速，細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)在連續(xù)發(fā)酵過程中與對照組相比變化不大；但受OLR遞增以及氨抑制不斷增強的影響，主要優(yōu)勢菌在種類和相對含量上作出適應(yīng)性改變，細菌和古菌的多樣性指數(shù)呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，甲烷產(chǎn)率在第2個OLR后也逐漸下降，相應(yīng)的BMP轉(zhuǎn)化率也由94.48%逐漸降至85.32%。金針菇菌包含有適宜厭氧發(fā)酵的C/N（約23.7:1），甲烷產(chǎn)率相對穩(wěn)定，日產(chǎn)甲烷量隨OLR遞增而穩(wěn)步增長，但BMP轉(zhuǎn)化率不高，介于62.42～68.27%之間；由于物料組成變化和OLR增加，細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)與對照組相比變化明顯，主要優(yōu)勢菌的種類和相對含量也發(fā)生明顯改變，細菌和古菌的多樣性指數(shù)穩(wěn)步升高。稻稈和甘蔗葉同屬于碳質(zhì)量分數(shù)較高（66:1，121:1）的秸稈類物料，它們的日產(chǎn)甲烷量均隨OLR遞增而增加，細菌和古菌的菌群結(jié)構(gòu)也在發(fā)酵過程中發(fā)生了明顯變化；但稻稈在第4個OLR時受系統(tǒng)酸化（VFA/TIC>0.8）影響，甲烷產(chǎn)率下降明顯，BMP轉(zhuǎn)化率僅為65.24%，細菌和古菌的多樣性指數(shù)也出現(xiàn)下降；而甘蔗葉則因VFA/TIC<0.8，其甲烷產(chǎn)率在發(fā)酵過程中未出現(xiàn)明顯下降。

2）不同C/N物料對發(fā)酵菌群中主要優(yōu)勢菌的形成存在影響。在鑒定的優(yōu)勢細菌中，可降解蛋白產(chǎn)生乙酸，在金針菇菌包、甘蔗葉和稻稈等物料發(fā)酵液中發(fā)現(xiàn)；可降解纖維素產(chǎn)酸，并對酸性環(huán)境有較好的耐受和調(diào)節(jié)能力，在甘蔗葉和金針菇菌包的發(fā)酵液中發(fā)生。鑒定的優(yōu)勢古菌包括乙酸營養(yǎng)型、氫營養(yǎng)型以及甲基營養(yǎng)型等3類產(chǎn)甲烷古菌。、、、和在富含纖維物料（金針菇菌包、甘蔗葉和稻稈）的發(fā)酵過程中均有發(fā)現(xiàn)，其中為稻稈獨有的優(yōu)勢古菌；（甲烷葉菌屬，甲基營養(yǎng)型）是在豬糞厭氧發(fā)酵過程中獨有的優(yōu)勢菌。

[1] 李鵬. 農(nóng)業(yè)廢棄物循環(huán)利用的績效評價及產(chǎn)業(yè)發(fā)展機制研究[D]. 武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué). 2014.

[2] 鄧良偉，沼氣工程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2015.

[3] 王欣，蘇小紅，郭廣亮，等. 變性梯度凝膠電泳（DGGE）技術(shù)在畜禽糞便厭氧發(fā)酵液中的研究進展[J]. 黑龍江科學(xué)，2015(1)：12－13.

Wang Xin, Su Xiaohong, Guo Guangliang, et al. Advances in anaerobic fermentation broth denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) technique in animal feces[J]. Hei Long Jiang Science, 2015(1): 12－13. (in Chinese with English abstract)

[4] 夏吉慶，馬添翼，鄭國香，等. PCR-DGGE法解析牛糞厭氧發(fā)酵穩(wěn)定期微生物多樣性[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2013，44(2)：146－150.

Xia Jiqing, Ma Tianyi, Zhang Guoxiang, et al. Analysis of microbial diversity during the stationary phase in cattle manure anaerobic fermentation with PCR-DGGE[J]. Journal of Northeast Agricultural University, 2013, 44(2): 146－150. (in Chinese with English abstract)

[5] 董仁杰，伯恩哈特·藍寧閣. 沼氣工程與技術(shù)沼氣指南：從生產(chǎn)到使用（第四卷）[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2013.

[6] 王明. 生物質(zhì)組成成分對厭氧發(fā)酵產(chǎn)甲烷的影響[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[7] 李海紅，巴琦玥，閆志英，等. 不同原料厭氧發(fā)酵及其微生物種群的研究[J]. 中國環(huán)境科學(xué)，2015，35(5)：1449－1457.

Li Haihong, Ba Qiyue, Yan Zhiying, et al. Studies on microbial community of different materials and anaerobic fermentation[J]. China Environment Science, 2015, 35(5): 1449－1457. (in Chinese with English abstract)

[8] 史宏偉，鄒德勛，左劍惡，等. 原料差異對厭氧消化微生物群落的影響[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報，2011，30(8)：1675－1682.

Shi Hongwei, Zuo Dexun, Zuo Jian’e, et al. The effect of feedstocks on microbial communities in anaerobic digesters[J]. Journal of agro-environment Science, 2011, 30(8): 1675－1682. (in Chinese with English abstract)

[9] 李東，葉景清，甄峰，等. 稻草與雞糞配比對混合厭氧消化產(chǎn)氣率的影響[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2013，29(2)：232－238.

Li Dong, Ye Jingqing, Zhen Feng, et al. Effects of anaerobic co-digestion of different proportions between rice straw and chicken manure on biogas yield rate[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2013, 29(2): 232－238. (in Chinese with English abstract)

[10] 陳柳萌，勒系意，聶紅，等. 4 ℃冷藏對厭氧發(fā)酵接種物活性的影響[J]. 江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，29(1)：102－106.

Chen Liumeng, Le Xiyi, Nie Hong, et al. Effect of cold storage at 4 ℃ on activity of inoculum for anaerobic fermentation[J]. Acta Agriculturae Jiangxi, 2017, 29(1): 102－106. (in Chinese with English abstract)

[11] 賀延齡. 廢水的厭氧生物處理[M]. 北京：中國輕工業(yè)出版社，1998.

[12] 劉芳，張萬欽，吳樹彪，等. 厭氧發(fā)酵中揮發(fā)酸含量與碳酸氫鹽堿度的滴定法修正[J]. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2013，44(9)：91－96.

Liu Fang, Zhang Wanqin, Wu Shubiao, et al. Titration method for total inorganic carbon and volatile fatty acids determination in anaerobic digestion[J]. Transactions of The Chinese Society of Agricultural Machinery, 2013, 44(9): 91－96. (in Chinesewith English abstract)

[13] 魏復(fù)盛. 水和廢水監(jiān)測分析方法（第四版）[M]. 北京：中國環(huán)境科學(xué)出版社，2002.

[14] Operation and Maintenance Manual of Automatic Methane Potential Test System[Z]. 2014.

[15] 劉飛. PCR-DGGE技術(shù)分析多菌態(tài)混合樣品中微生物群落結(jié)構(gòu)[D]. 廣州：華南理工大學(xué)，2012.

[16] Muyzer G, de Waal EC, Uitterlinden AG, et al. Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction- amplified genes coding for 16S rRNA[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1993, 59(3): 695－700.

[17] Ovre?s L, Forney L, Daae F L, et al. Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1997, 69(3): 3367－3373.

[18] Regine Gro?kopf, Peter H. Janssen, Werner Liesack, et al. Diversity and structure of the methanogenic community in anoxic rice paddy soil microcosms as examined by cultivation and direct 16S rRNA gene sequence retrieval[J]. Applied & Environmental Microbiology, 1998, 64(3): 960－969.

[19] Sanguinetti C J, Dias Neto E, Simpson A J, et al. Rapid silver staining and recovery of PCR products separated on polyacrylamide gels[J]. Biotechniques, 1994, 17(5): 914－921.

[20] 鄧良偉. 沼氣工程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2015.

[21] Bernhard DROSG. Process Monitoring in Biogas Plants[Z]. IEA Bioenergy, 2013.

[22] Liu T, Sung S. Ammonia inhibition on thermophilic aceticlasticmethanogens[J]. Water Science & Technology, 2002, 45(10): 113－120.

[23] Hansen K H, Angelidaki I, Ahring B K. Anaerobic digestion of swine manure:inhibition by ammonia[J]. Water Research, 1998, 32(1): 5－12.

[24] 張蕾，梁軍鋒，崔文文，等. 規(guī)?；斩捳託獍l(fā)酵反應(yīng)器中微生物群落特征[J]. 農(nóng)業(yè)環(huán)節(jié)科學(xué)學(xué)報，2014，33(3)：584－592.

Zhang Lei, Lang Junfeng, Cui Wenwen, et al. Characteristics of microbial communities in full-scale biogas digesters with straw as substrate[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2014, 33(3): 584－592. (in Chinesewith English abstract)

[25] Hatsumi Shiratori, Kinuyo Sasaya, Hitomi Ohiwa, et al.sp. nov. andsp. nov., moderately thermophilic, cellulose-/cellobiose- digesting bacteria isolated from methanogenic sludge[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2009(59): 1764－1770.

[26] D?az Cardenas C, Lopez G, Patel G K C, et al.sp. nov, an anaerobic,slightly halophilic bacterium isolated from a saline spring[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010(60): 850－853.

[27] Jaewoo Yoon, Hiroaki Kasai.sp. nov., a new member of thephylum Bacteroidetes isolated from marine sediment[J]. J. Gen. Appl. Microbiol., 2014(60): 28－32.

[28] 承磊，鄭珍珍，王聰，等.產(chǎn)甲烷古菌研究進展[J]. 微生物學(xué)通報，2016，43(5)：1143－1164.

Cheng Lei, Zhang Zhenzhen, Wang Cong, et al. Recent advances in methanogens[J]. Microbiology China, 2016, 43(5): 1143－1164. (in Chinesewith English abstract)

[29] 方曉瑜，李家寶，芮俊鵬，等. 產(chǎn)甲烷生化代謝途徑研究進展[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報，2015，21(1)：1－9.

Fang Xiaoyu, Li Jiabao, Rui Junpeng, et al. Research progress in biochemical pathways of methanogenesis[J]. Chin J Appl Environ Biol, 2015, 21(1): 1－9. (in Chinese with English abstract)

[30] Joblin K N. Methanogenic archaea[M]. Methods in Gut Microbial Ecology for Ruminants.The Netherlands: Kluwer Academic, 2005.

[31] 祝金星. 甲烷鬃菌基因組學(xué)及其碳代謝途徑新功能研究[D]. 北京：中國科學(xué)院，2012.

[32] 史宏偉，鄒德勛，左劍惡，等. 梯度負荷下果蔬垃圾厭氧消化性能及微生物群落結(jié)構(gòu)的研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報2012，32(1)：232－240.

Shi Hongwei, Zou Dexun, Zou Jian’e, et al. Investigation on anaerobic digestion preformance and microbial structure of vegetable wastes under gradient organic loadings[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(1): 232－240. (in Chinese with English abstract)

[33] 朱文秀，黃振興，任洪艷，等. IC反應(yīng)器處理啤酒廢水的效能及其微生物群落動態(tài)分析[J]. 環(huán)境科學(xué)，2012，33(8)：2715－2722.

Zhu Wenxiu, Huang Zhenxing, Ren Hongyan, et al. Performance and microbial community dynamic characteristics of an internal circulation reactor treating brewery wastrwater[J]. Envionmental Science, 2012, 33(8): 2715－2722. (in Chinese with English abstract)

[34] Klocke M, Mahnert P, Mundt K, et al. Microbial community analysis of a biogas-producing completely stirred tank reactor fed continuously with fodder beet silage as mono-sbustrate[J]. Systematic and Applied Microbiology, 2007, 30(2): 139－151.

[35] 尹礎(chǔ). 高濃度造紙廢水厭氧處理中顆粒污泥的微生物群落結(jié)構(gòu)及形成的研究[D]. 長沙：中南大學(xué)，2008.

[36] Borrel G, Parisot N, Harris H M B, et al. Comparative genomics highlights the unique biology of, a The rmoplasmatales-related seventh order of methanogenic archaea that encodes pyrrolysine[J]. BMC Genomics, 2014, 15(679): 1－23.

[37] Paul K, Nonoh J O, Mik ulski L, et al. “Methanoplasmatales”, Thermoplasmatales-related archaea in termite guts and other environments,are the seventh order of methanogens[J]. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(23): 8245－8253.

Anaerobic digestion characteristics and microbial structure of agricultural wastes under gradient organic loadings

Le Xiyi1, Huang Yunhong1, Ren Yuhan1, Chen Liumeng2※

(1.330022,; 2.,330200,)

In recent years, along with the rapid development of modern large-scale and intensive agriculture in China, the output of agricultural wastes shows a rapid increasing trend. Some objective reasons (the lagged development of resource utilization technology and equipment, the attributes of property rights of agricultural wastes, the difficult government regulatory, and so on) lead to the extensive cyclic utilization and even direct combustion or arbitrary discard of agricultural wastes, which has caused serious harms to the rural ecological environment, agricultural production environment and farmers’ living environment in China. The preparation of biogas through anaerobic fermentation is a high-engineering technology for the energy-oriented use of agricultural wastes, and the quantity, species and activity of anaerobic microorganisms for anaerobic fermentation, as well as the fermented substance are the key factors affecting the efficiency of biogas production. C/N, an important character of the fermented substance, can directly affect the metabolism of microorganisms, and also can affect the methane yield through influencing the transformation of carbon in organic matters. In order to understand the effects of gradient organic loadings on the anaerobic digestion characteristics and microbial community structure of greatly different C/N-containing agricultural wastes, the author investigated the performance of methane production and the changes in microbial community structure of anaerobically-digested swine manure, Flammulina velutipes fungal bag, rice straw, and sugarcane top in continuous stirred tank reactor (CSTR) under gradient organic loading rates (OLRs) [1.11, 1.67, 2.22 and 2.78 g/(L?d), being counted as volatile solid]. The results showed that the daily methane yield of the above four substrates all increased with the increase in OLR, but their methane productive rate and microbial community structure revealed different variation trends due to different C/N ratios of substrates. Among four substrates, swine manure with C/N of 13:1 had the highest daily methane yield, and its bacterial and archaea community structure was similar to that in the control group; whereas due to the increase in OLR and the enhancement of ammonia inhibition, the diversity index of bacteria and archaea increased firstly and then decreased, and the methane productive rate decreased gradually when the OLR reached 1.67 g/(L?d). Because Flammulina velutipes fungal bag contained a suitable C/N (about 23.7:1) for anaerobic digestion, it had a relatively stable methane productive rate, and its diversity index of bacteria and archaea increased with the increase in OLR, but its microbial community structure was obviously different from that in the control group. Rice straw and sugarcane top had a higher carbon content, with C/N as 66:1 and 121:1 respectively, and their community structure of bacteria and archaea changed obviously in the anaerobic digestion process. When OLR reached 2.78 g/(L?d), due to the acid accumulation and VFA/TIC above 0.8, the methane productive rate of rice straw decreased obviously, and its diversity index of bacteria and archaea also reduced. However, the methane productive rate of sugarcane top did not decrease obviously in the course of anaerobic digestion, because its VFA/TIC was less than 0.8. Furthermore, the substrate with different C/N had effects on the formation of specific dominant microbial species, and it was found that: Methanolobus zinderi was the specific dominant archaea species in the digested swine manure; Proteiniphilum acetatigenes and Acetivibrio cellulolyticus were the specific dominant bacterial species in the digested Flammulina velutipes fungal bag and sugarcane top, respectively; Methanospirillum hungatei was the specific dominant archaea species in the digested rice straw.

wastes; fermentation; biogas; C/N; methane production characteristic; mircobial structure

10.11975/j.issn.1002-6819.2017.17.032

S216.4

A

1002-6819(2017)-17-0239-09

2017-04-05

2017-08-09

國家科技支撐計劃項目(2014BAC04B02)；江西省重大項目(20152ACF60023)；江西省協(xié)同創(chuàng)新專項（JXXTCX201600304）。

勒系意，江西南昌人，主要從事農(nóng)村能源方面的研究。南昌 江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，330022。Email：1542885948@qq.com。

陳柳萌，江西贛州人，主要從事農(nóng)業(yè)廢棄物的厭氧發(fā)酵技術(shù)研究。南昌 江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)應(yīng)用微生物研究所，330200。Email：13931409@qq.com