陳峰，徐建第*，姜明松，張全芳，朱文銀，李廣賢，周學標，楊連群，

(1.山東省水稻研究所，山東 濟南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100)

利用ARMS-Tm-shift-qPCR技術檢測水稻低直鏈淀粉含量基因Wx-mq

陳峰1，徐建第1*，姜明松1，張全芳2，朱文銀1，李廣賢1，周學標1，楊連群1，2

(1.山東省水稻研究所，山東 濟南 250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究中心，山東 濟南 250100)

Wx-mq基因是水稻低直鏈淀粉性狀控制基因，與米飯食味品質(zhì)密切相關。本研究根據(jù)水稻控制低直鏈淀粉含量Wx-mq基因第497位存在的G>A單核苷酸變異，將基于SYBR GreenⅠ的ARMS和Tm-shift的兩種實時PCR基因分型方法相結合，建立了可準確區(qū)分Wx-mq基因第497位的GG純合、AA純合及GA雜合三種類型的實時熒光定量PCR體系。試驗表明這種基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift實時PCR基因分型方法無需合成探針，試驗設計簡單，是一種快速、簡便、特異性好的基因分型方法，可用于Wx-mq基因分子標記輔助育種中基因的高通量分型。

水稻；Wx-mq基因；低直鏈淀粉含量；ARMS-Tm-shift-qPCR

近年來, 隨著人民生活水平的提高, 消費者對稻米食味品質(zhì)的要求越來越高。研究表明，直鏈淀粉含量是決定米飯質(zhì)地和食味品質(zhì)的重要因素[1,2]。低直鏈淀粉含量的水稻其米飯表面光澤透亮，綜合了糯米的柔軟性和粳米的彈性, 適口性好，食味品質(zhì)佳，具有較高的商品性。

水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq是通過化學誘變劑N-甲基-N-亞硝基脲處理日本水稻品種越光而獲得的低直鏈淀粉含量變異基因，序列分析表明，與來自野生型親本越光中的Wx基因相比，Wx-mq在編碼區(qū)發(fā)生了2個堿基的替換，其中497位的G突變?yōu)锳，595位的T突變?yōu)镃，從而使相應的氨基酸序列產(chǎn)生了2個錯義突變，即位于第4外顯子的精氨酸和第5外顯子的色氨酸均突變?yōu)榻M氨酸，推測這2個錯義突變是造成直鏈淀粉含量下降的原因。低直鏈淀粉含量基因Wx-mq在稻米食味品質(zhì)改良中的作用尤為重要，如何在育種中快捷、準確地對其基因型進行鑒定、選擇已成為亟待解決的技術難題。Sato等[2]針對Wx-mq基因第497位單核苷酸變異設計了能區(qū)分Wx-mq基因型的顯性PCR標記；Chen等[3]根據(jù)該突變位點設計了能準確區(qū)分三種基因型的CAPS標記；陳濤等[4]利用四引物擴增受阻突變體系(Amplification Refractory Mutation System, ARMS)進行等位基因特異擴增來檢測水稻低直鏈淀粉含量基因。由于Wx-mq基因僅存在單堿基的變異，采用普通的分子生物學技術(如DNA測序、PCR酶切法)對其基因型(特別是雜合基因型)進行區(qū)分，試驗過程往往比較煩瑣，且存在PCR產(chǎn)物污染等問題。因此，有必要嘗試采用新的方法對水稻W(wǎng)x-mq基因型進行快速鑒定。

鄭薇薇等[5]采用序列特異的ARMS引物對原癌基因K-ras進行擴增, 建立了以SYBR GreenⅠ熒光染料為實時PCR指示劑的ARMS實時PCR基因分型體系，無需合成探針、設計簡單，是一種快速、 簡便、 經(jīng)濟、準確的基因分型方法。本研究則將ARMS法與Tm-shift法結合，建立基于SYBR GreenⅠ能同時區(qū)分Wx-mq基因第497位的GG純合、AA純合及GA雜合三種基因型的實時熒光PCR基因分型體系，旨在實現(xiàn)對水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq第497位單核苷酸多態(tài)性快速、高效、精確的檢測。

1 材料與方法

1.1供試材料

供試水稻材料包括5個含低直鏈淀粉含量基因Wx-mq的水稻品種關東194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10(均引自江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所)，4個直鏈淀粉含量正常的水稻品種日本晴、圣稻18、徐稻3號、圣稻15，以及關東194/圣稻15、南粳46/圣稻18雜種F1代，JS06/圣稻18的F3代群體，南粳9108/津稻263的F2代群體。

1.2引物設計

用于Wx-mq基因497位G>A位點檢測的Tm-shift和ARMS方法結合引物設計為: 野生型GG上游引物(Wx-mqW): 5′-CGCCCGTCCCGCCGGTTTTTCCATTGCTACAATCG-3′，突變型AA上游引物(Wx-mqM)：5′-GATTACCGGTTTTTCCATTGCTACAAACA-3′，下游引物(Wx-mqR)：5′-GCGAAAGGTAAACTAATGATGACTCCAC-3′，其中野生型GG上游引物的5′端添加14 bp的序列5′-CGCCCGTCCCGCCG-3′；突變型AA上游引物的5′端添加8 bp的短序列5′-GATTACCG-3′；2條ARMS引物分別在3′末端堿基與待檢測突變型的突變堿基匹配，同時在其3′末端倒數(shù)第3位增加一個堿基錯配，進行實時熒光定量PCR擴增，每個樣本的突變檢測分單管進行。

1.3基因組DNA的準備及反應體系

采用CTAB法提取葉片DNA，將純化后的DNA用Nanodrop分光光度計定量，分取一部分定量到100 ng/μL水平，備用；引物溶解，稀釋至100 μmol/L原始濃度，-20℃保存?zhèn)溆?。熒光定量PCR反應體系(20.0 μL)：SYBR PremixExTaqMix(2×)10.0 μL，Primer mix(100 μmol/L)1.0 μL，DNA Template(10 ng/μL)2.0 μL，ROX ref(50×)2.0 μL，雙蒸水補齊至20.0 μL。反應程序：①預變性：95℃預變性2 min；②PCR反應：95℃下變性5 s，60℃下復性35 s，40個循環(huán)；③熔解曲線分析：95℃ 0 s 20℃/s，65℃ 15 s 20℃/s，95℃ 0 s 0.1℃/s。

2 結果與分析

2.1不同水稻品種及F1代Wx-mq基因型的檢測

對9個水稻品種(系)及雜種F1的DNA 進行ARMS-Tm-shift-qPCR檢測。常規(guī)粳稻品種(野生型)日本晴、圣稻18、徐稻3號、圣稻15均出現(xiàn)單峰且Tm值為(83.09±0.50)℃的熔解曲線(圖1)，且有Ct<35的單一擴增曲線(圖2)。5個含有低直鏈淀粉含量基因Wx-mq的水稻材料關東194、南粳46、南粳9108、JS06、JS10均出現(xiàn)單峰且Tm值為(81.01±0.50)℃的熔解曲線(圖3)，且有Ct<35的單一擴增曲線(圖4)。當樣本為雜合型(關東194/圣稻15、南粳46/圣稻18雜種F1代)，熔解曲線有雙峰，Tm值分別為(83.09±0.50)℃和(81.01±0.50)℃(圖5)，雙條擴增曲線的Ct<35(圖6)。

結果顯示，ARMS-Tm-shift-qPCR檢測結果與表型完全一致。因此，利用該方法可以快速、準確地鑒定和區(qū)分含Wx-mq純合基因型的低直鏈淀粉水稻材料、常規(guī)粳型材料及雜合體材料。

圖1野生型(GG)定量PCR熔解曲線

圖2 野生型(GG)定量PCR擴增曲線

圖3 突變型(AA)定量PCR熔解曲線

圖4 突變型(AA)定量PCR擴增曲線

圖5 雜合型(GA)定量PCR熔解曲線

圖6 雜合型(GA)定量PCR擴增曲線

2.2分離群體Wx-mq基因檢測

對2個分離群體(JS06/圣稻18的F3代群體和南粳9108/津稻263的F2代群體)于分蘗盛期，掛牌選取120個單株葉片，進行Wx-mq基因檢測，共檢測到突變型(AA)單株57株、野生型(GG)單株33株、雜合型(GA)單株40株。成熟后對掛牌單株收獲，進行胚乳外觀考查，結果表明，分子標記檢測為突變型和野生型的單株與表型鑒定完全一致。因直鏈淀粉含量的性狀表達屬于胚乳性狀，胚乳是三倍體組織，胚乳性狀是母株的子代性狀，因此對于雜合型單株，其外觀呈現(xiàn)分離表型[6]。

3 討論與結論

目前，水稻優(yōu)質(zhì)食味米品種選育越來越受到育種家的重視，并育成了一批優(yōu)質(zhì)米品種。例如，江蘇省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所以高產(chǎn)粳稻品種武香粳14作母本、以具有暗胚乳突變基因的優(yōu)質(zhì)粳稻品種關東194作父本配制雜交組合，利用與暗胚乳突變基因Wx-mq直接相關的分子標記進行輔助選擇，育成含有暗胚乳突變基因Wx-mq的優(yōu)良食味粳稻新品種南粳46、南粳5055、南粳9108[7-9]。山東省水稻研究所與江蘇農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所合作，選育出優(yōu)質(zhì)食味半糯品種南粳505，2017年通過山東省審定。北方稻作科技協(xié)會從2007年開始組織了全國優(yōu)良食味粳稻品評活動，評選出寧粳43、龍稻7號、吉粳509、寧9108等優(yōu)質(zhì)食味粳稻品種，推動了優(yōu)質(zhì)米育種及食味粳米開發(fā)[10]。

本研究采用ARMS-Tm-shift-qPCR技術對水稻低直鏈淀粉基因Wx-mq進行檢測，試驗表明這種基于SYBR GreenⅠ的ARMS-Tm-shift實時PCR基因分型方法，無需合成探針，試驗設計簡單，在苗期即可完成對Wx-mq不同基因型的鑒定，是一種快速、簡便、經(jīng)濟、特異性好的基因分型方法，可以提高育種工作的預見性和選擇效率，可用于Wx-mq基因分子標記輔助育種中基因的高通量分型。

[1] Matsuo T, Futsuhara Y, Kikuchi F, et al．Science of the rice plant (Vol.3:Genetics)[M]．Rural Culture Association, Tokyo, Japan, 1990:351-354．

[2] Sato H, Suzuki Y, Sakai M, et al．Molecular characterization ofWx-mq, a novel mutant gene for low-amylose content in endosperm of rice (OryzasativaL. )[J]. Breeding science, 2002, 52(2): 131-135．

[3] Chen T, Zhang Y D, Zhao L, et al．A cleaved amplified polymorphic sequence marker to detect variation inWxlocus conditioning translucent endosperm in rice[J]．Rice Sci., 2009, 16(2): 206-110.

[4] 陳濤，駱名瑞，張亞東，等. 利用四引物擴增受阻突變體系PCR 技術檢測水稻低直鏈淀粉含量基因Wx-mq[J]. 中國水稻科學，2013，27(5)：529-534.

[5] 鄭薇薇, 梁基選, 李慶閣. ARMS 實時PCR 基因分型特異性的研究[J].廈門大學學報(自然科學版)，2005，44(增刊)：135-139.

[6] 莫惠棟.谷類作物胚乳品質(zhì)性狀的遺傳研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學，1995，28(2)：1-7.

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DetectionofWx-mqGeneforLow-AmyloseContentbyARMS-Tm-shift-qPCRTechnology

Chen Feng1，Xu Jiandi1*，Jiang Mingsong1，Zhang Quanfang2，Zhu Wenyin1，Li Guangxian1，Zhou Xuebiao1，Yang Lianqun1，2

(1.ShandongRiceResearchInstitute，Jinan250100，China; 2.BiotechnologyInstitute，ShandongAcademyofAgriculturalSciences，Jinan250100，China)

Wx-mqgene is a low amylose trait controlled gene and closely relates with the eating quality of rice. According to the rice low amylose starch content control geneWx-mqNo. 497 position existing G>A single nucleotide variants, two real-time PCR genotyping methods, ARMS and Tm-shift based on SYBR Green I, was combined to establish the fluorescence real-time quantitative PCR system, which could accurately distinguish the GG homozygote, AA homozygote and GA heterozygosis ofWx-mqgene No. 497 position. The experiment results showed that the ARMS-Tm-shift real-time PCR genotyping method based on SYBR Green I did not need probe synthesis with simple designs. It was a rapid, simple and specific genotyping method. It could be used in high-throughput genotyping ofWx-mqgene in molecular marker assisted breeding.

Rice;Wx-mqgene; Low-amylose content; ARMS-Tm-shift-qPCR

S511.01

A

1001-4942(2017)10-0015-05

10.14083/j.issn.1001-4942.2017.10.003

2017-06-13

國家重點研發(fā)計劃項目(2017YFD0100505)；國家水稻產(chǎn)業(yè)體系濟寧綜合試驗站(CARS-01-60)；國家科技支撐計劃子課題(2015BAD01B02-1-3)；山東省水稻產(chǎn)業(yè)體系項目(SDAIT-17-01)；山東省重點研發(fā)計劃項目(2017GNC11111)；山東省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新重點項目(2014CXZ10-5)；山東省農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程項目(CXGC2016A11)；山東省農(nóng)業(yè)科學院重大成果培育項目(2016CGPY09)

陳峰(1979—)，男，助理研究員,山東曲阜人，主要從事水稻育種。E-mail：Chenfeng7902@163.com 徐建第(1979—)，男，副研究員，山東昌邑人，主要從事水稻分子育種。E-mail:Xjiandi79@163.com

*同為第一作者。

楊連群(1961—)，男，研究員，山東汶上人，從事水稻遺傳育種研究。 周學標(1967—)，男，研究員，山東金鄉(xiāng)人，從事水稻遺傳育種研究。