●鄒曉穎 王柏欣

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎診斷中的應(yīng)用與研究

●鄒曉穎 王柏欣

目的：探討結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）在結(jié)核性胸膜炎診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。方法：選取牡丹江市康安醫(yī)院診治的胸腔積液患者45例，根據(jù)診斷標(biāo)準(zhǔn)分為結(jié)核性胸膜炎組（A組）與惡性胸腔積液組（B組），所有患者在入院后均行外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)、胸水腺苷脫氨酶（ADA）檢測(cè)及胸水結(jié)核桿菌培養(yǎng)，進(jìn)而分別對(duì)三個(gè)不同檢驗(yàn)方法的檢驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)價(jià)。結(jié)果：經(jīng)臨床診斷：A組34例、B組11例。外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)、胸水ADA檢測(cè)、胸水結(jié)核桿菌培養(yǎng)的敏感性分別是91.1%、64.7%%、14.7%，特異性分別是：90.9%、27.3%、100%。外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性高于胸水ADA的敏感性（P＜0.05），且高于胸水結(jié)核菌培養(yǎng)的敏感性（P＜0.05）。外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的特異性高于胸水ADA的特異性（P＜0.05），但與胸水結(jié)核菌培養(yǎng)的特異性無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05）。結(jié)論：外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)可作為臨床診斷結(jié)核性胸膜炎的有效方法。

結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)；結(jié)核性胸膜炎；診斷；療效

結(jié)核病作為發(fā)病率和死亡率最高的傳染病之一，在我國(guó)，約30%人口感染過(guò)結(jié)核分枝桿菌，而這其中約15%的人口將會(huì)發(fā)展為結(jié)核病。近年來(lái)，佳木斯市的結(jié)核桿菌感染率呈上升趨勢(shì)[1]。結(jié)核性胸膜炎、胸腔惡性腫瘤、胸膜腔感染均可形成胸腔積液，在我國(guó)，結(jié)核性胸腔積液可占到滲出性胸腔積液的50.0%-53.5%[2]。結(jié)核性胸膜炎作為最常見(jiàn)的肺外結(jié)核病[3-4]，其診斷需要根據(jù)患者的臨床表現(xiàn)、胸腔積液的生化檢查，必要時(shí)還要行胸膜活檢等有創(chuàng)檢查進(jìn)行綜合判斷。傳統(tǒng)的檢驗(yàn)手段（如結(jié)核菌素試驗(yàn)）的敏感性及特異性較低，胸腔積液結(jié)核菌培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)且陽(yáng)性率低，對(duì)于合并肺結(jié)核的結(jié)核性胸膜炎患者，痰培養(yǎng)雖然也具有一定的診斷價(jià)值[5]，但這些方法均不能在臨床上做出快速的診斷。胸膜活檢作為結(jié)核性胸膜炎診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，大大提高了其確診率，但因其是有創(chuàng)檢查，并發(fā)癥較多，大多數(shù)患者難以接受，且陽(yáng)性率僅為62.2%-69.7%[6-7]，因此不適合作為常規(guī)檢查。作為這一種新型結(jié)核菌感染的診斷手段，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（ELISPOT）已經(jīng)被世界衛(wèi)生組織列為結(jié)核菌感染的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，近年來(lái)，基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展有力地推動(dòng)了臨床檢驗(yàn)的水平，使其從細(xì)胞水平擴(kuò)展到分子水平。

1 方法

1.1 研究對(duì)象

選取2014年3月至2016年3月牡丹江市康安醫(yī)院診治的胸腔積液患者45例，排除漏出液后(測(cè)胸水LDH與血LDH的比值，大于0.6則為滲出性胸腔積液)，按臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)分為結(jié)核性胸膜炎組(A組)和惡性胸腔積液組（B組），所有受試者均行外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)、胸水ADA檢驗(yàn)及胸水中結(jié)核桿菌培養(yǎng)。對(duì)于A組進(jìn)行抗結(jié)核治療12周后再次進(jìn)行外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)。

1.2 分組方法

（1）A組診斷依據(jù)∶①有消瘦、地?zé)岬冉Y(jié)核菌中毒癥狀;②B超提示有胸腔積液；③胸水為滲出液（胸水中ADA≥45U/L）;④抗結(jié)核治療后可見(jiàn)胸腔積液吸收，且癥狀明顯好轉(zhuǎn);⑤胸水中癌細(xì)胞檢查陰性;⑥痰中結(jié)核分枝桿菌涂片陽(yáng)性或胸膜活檢(如結(jié)核性肉芽腫等)明確診斷為結(jié)核病變;符合①一⑤或⑥[8-9]。

（2）B組診斷標(biāo)準(zhǔn)∶病理學(xué)或細(xì)胞學(xué)檢查診斷為惡性胸腔積液，末經(jīng)過(guò)治療，既往無(wú)結(jié)核病病史與接觸史，無(wú)活動(dòng)性肺結(jié)核。

所選患者均無(wú)HIV感染。

1.3 試驗(yàn)方法

（1）T-SPOT.TB試驗(yàn)步驟∶采集4-6ml血液標(biāo)本（使用肝素鈉抗凝管），實(shí)驗(yàn)室提取外周血單個(gè)核細(xì)胞并計(jì)數(shù);分別加入陽(yáng)性對(duì)照孔（a孔），結(jié)核特異性抗原ESAT-6（b孔）和抗原CFP-10（c孔），空白對(duì)照孔（d孔）。放入37度恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)16-24 h。后加入酶和顯色劑，使得測(cè)試孔顯色產(chǎn)生斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)數(shù)判斷結(jié)果∶a孔＜5時(shí)，b孔、c孔、或d孔的斑點(diǎn)數(shù)≥6時(shí)為陽(yáng)性;如不符合以上要求，且陽(yáng)性孔未見(jiàn)異常則為陰性。

（2）胸腔積液中腺苷脫氨酶(ADA)檢測(cè)∶采用速率法檢測(cè)，采集5ml胸腔積液樣本,2000r/min離心10分鐘后，再上清液，應(yīng)用TBA-40FR生化分析儀進(jìn)行分析，結(jié)果判斷∶當(dāng)ADA＞45U/L時(shí)為陽(yáng)性，反之則為陰性。

（3）胸腔積液結(jié)核菌培養(yǎng)∶取5ml胸水于試管中進(jìn)行消化處理，取0.5ml胸水，然后分別放入培養(yǎng)基內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)陽(yáng)性者均以鑒別培養(yǎng)基對(duì)其菌種進(jìn)行鑒別，將非結(jié)核菌排除。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

（1）A組34例患者均行外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)、胸水ADA檢測(cè)、胸水結(jié)核菌培養(yǎng)三種檢驗(yàn)方法檢測(cè)，其結(jié)果如下∶在A組34例患者中，外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)∶陽(yáng)性患者31例，陰性患者3例；胸水ADA檢測(cè)∶陽(yáng)性患者22例，陰性患者12例；胸水結(jié)核菌培養(yǎng)∶陽(yáng)性患者5例，陰性患者29例，對(duì)于A組患者，外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性為91.1%（3134）,胸水ADA檢測(cè)的敏感性為64.7%（2234），胸水結(jié)核菌培養(yǎng)的敏感性為14.7%（534）。外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)與其他兩種檢驗(yàn)方法的敏感性比較如表1。

表1 外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)與其他兩種檢驗(yàn)方法敏感性比較

由表1可知∶外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性高于胸水ADA（P＜0.05）；外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性高于胸水結(jié)核菌培養(yǎng)（P＜0.05）。

（2）B組11例患者均行外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)、胸水ADA檢測(cè)、胸水結(jié)核菌培養(yǎng)三種檢驗(yàn)方法檢測(cè)，其結(jié)果如下∶在A組11例患者中，外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)∶陽(yáng)性患1例，陰性患者10例；胸水ADA檢測(cè)∶陽(yáng)性患者8例，陰性患者3例；胸水結(jié)核菌培養(yǎng)∶陽(yáng)性患者0例，陰性患者11例。對(duì)于B組患者外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的特異性為90.9%（1011）;胸水ADA檢測(cè)的特異性為27.3%（311）；胸水結(jié)核菌培養(yǎng)的特異性為100%（1111），外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)與其他兩種檢驗(yàn)方法的特異性比較如表2。

表2 外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)與其他兩種檢驗(yàn)方法特異性比較

由表2可知∶外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的特異性高于胸水ADA（P＜0.05）；外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的特異性與胸水結(jié)核菌培養(yǎng)無(wú)明顯區(qū)別（P＞0.05）。

3 結(jié)論

T-SPOT.TB試驗(yàn)是在2001年由Lalvani等人發(fā)明，并在4年后被美國(guó)食品藥品管理局視作結(jié)核菌感染的快速診斷方法，近來(lái)已經(jīng)在美國(guó)、歐洲等國(guó)家得到了一致認(rèn)可。T-SPOT.TB試驗(yàn)原理基于以下2點(diǎn)∶(1)ESAT-6和CFP-10可刺激人體T淋巴細(xì)胞成為效應(yīng)T細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生γ因子；(2)T-SPOT.TB檢測(cè)是由ELISPOT（一種新型的酶聯(lián)免疫技術(shù)）發(fā)展而來(lái)的，通過(guò)此項(xiàng)技術(shù)檢測(cè)產(chǎn)生γ干擾素的單個(gè)T細(xì)胞，進(jìn)而判斷機(jī)體是否處于結(jié)核菌感染狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)于外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)，無(wú)論是斑點(diǎn)形成數(shù)目還是陽(yáng)性率，A組均高于B組。

Lee等對(duì)45例胸腔積液患者(其中20例確診為結(jié)核性胸膜炎)的胸腔積液和外周血分別進(jìn)行了T-SPOT.TB試驗(yàn)，胸腔積液T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性、特異性分別為94.5%、80.7%，外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的敏感性、特異性分別為78.8%、89.5%，本實(shí)驗(yàn)的敏感性高于Lee等的研究結(jié)果，特異性與Lee等的研究結(jié)果相類(lèi)似。Lois等認(rèn)為胸腔積液中的單核細(xì)胞比外周血中的單核細(xì)胞更加具有診斷價(jià)值，但外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)作為一種非創(chuàng)傷性檢驗(yàn)手段，仍有其存在價(jià)值。

研究顯示，效應(yīng)T淋巴細(xì)胞伴隨著結(jié)核菌存在或消失，因此檢查效應(yīng)T淋巴細(xì)胞也能判斷人體有沒(méi)有結(jié)核菌，進(jìn)而進(jìn)行治療效果評(píng)定。因本實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)對(duì)象較少，希望將來(lái)有更多的實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步支持。

綜上所述，對(duì)于外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)總結(jié)如下∶(1)體外試驗(yàn)，非創(chuàng)傷性；（2）檢測(cè)快速，檢測(cè)全過(guò)程只需24一48h;(3)特異性高，不受卡介苗接種的影響，交叉反應(yīng)較少;(4)敏感性高，可以從100 0000個(gè)細(xì)胞因子分泌細(xì)胞中檢測(cè)出單個(gè)細(xì)胞。因此外周血T-SPOT.TB試驗(yàn)在結(jié)核性胸膜炎的診斷中具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

（作者單位：佳木斯大學(xué)）

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鄒曉穎（1973～），女，在讀研究生。

王柏欣（1969～），男，佳木斯大學(xué)碩士研究生導(dǎo)師，副教授，碩士。