師萱，陽勇，秦偉瀚，徐嘉紅，楊大堅(jiān)，郭延壘

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

研究報(bào)告

環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫抑制作用過程中代謝通路變化的代謝組學(xué)研究

師萱，陽勇，秦偉瀚，徐嘉紅，楊大堅(jiān)，郭延壘*

(重慶市中藥研究院，重慶 400065)

目的采用代謝組學(xué)方法，研究環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠免疫抑制作用過程中代謝通路的變化。方法采用流式細(xì)胞術(shù)了解免疫細(xì)胞變化情況，通過建立偏最小二乘法模型多結(jié)果進(jìn)行判別。以偏最小二乘法模型中變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)參數(shù)篩選潛在的生物標(biāo)志物，通過統(tǒng)計(jì)分析確定差異性代謝物，借助代謝組學(xué)小分子化合物快速鑒定分析軟件系統(tǒng)對(duì)差異性代謝物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析，通過搜庫及運(yùn)算最終確定差異代謝物質(zhì)9種，通路富集結(jié)果分析差異代謝通路3條。結(jié)果環(huán)磷酰胺對(duì)正常機(jī)體的不飽和脂肪酸的生物合成、線粒體脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素的生物合成、花生四烯酸代謝、脂肪酸代謝、嘧啶的生物合成等代謝通路均產(chǎn)生明顯影響。結(jié)論環(huán)磷酰胺在正常組與實(shí)驗(yàn)組中影響最重要的代謝通路為花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和嘧啶代謝。

環(huán)磷酰胺；免疫抑制；代謝組學(xué)；代謝通路

人體依靠由自身細(xì)胞免疫和體液免疫組成的強(qiáng)大免疫力，抵御著種類龐大、數(shù)量繁多的各種疾病。正常情況下，異體物質(zhì)侵入機(jī)體后，免疫細(xì)胞將產(chǎn)生包圍、分解、吞噬、消滅和清除作用。但是，過度免疫反應(yīng)產(chǎn)生的大量免疫細(xì)胞和堆積的大量免疫球蛋白，將導(dǎo)致組織損害和器官功能障礙而形成原發(fā)性的自身免疫性疾病[1-3]。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)作為常用烷化劑類抗腫瘤藥物和細(xì)胞毒性藥物，臨床上主要用于治療腫瘤、自身免疫性疾病和器官移植等，但是環(huán)磷酰胺對(duì)免疫功能和造血系統(tǒng)存在抑制作用的不良反應(yīng)，目前臨床尚無有效的防治手段。環(huán)磷酰胺對(duì)處于有絲分裂循環(huán)周期的細(xì)胞產(chǎn)生破壞和殺滅作用，因此對(duì)活化增殖的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，表現(xiàn)為對(duì)免疫相關(guān)細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制作用，所以環(huán)磷酰胺在免疫抑制研究中常作為陽性對(duì)照物，如對(duì)細(xì)胞免疫、體液免疫和巨噬細(xì)胞活性測(cè)定研究[4-6]。

代謝通路的變化研究在疾病發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，藥物的作用機(jī)制研究及闡釋中具有重要意義。通過前期研究發(fā)現(xiàn)環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的體液免疫產(chǎn)生明顯抑制作用，但是，在體液免疫抑制作用的過程中代謝通路的變化暫無研究。因此，本實(shí)驗(yàn)通過環(huán)磷酰胺對(duì)小鼠的體液免疫產(chǎn)生過程中代謝通路的變化研究，對(duì)環(huán)磷酰胺在自身免疫性疾病的作用機(jī)制等方面的研究具有重要意義[7,8]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)采用雄性KM小鼠20只，9周齡，體重(18±3)g，由重慶市中藥研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供【SCXK(渝)2012-0006】。飼養(yǎng)于重慶市中藥研究院屏障環(huán)境中【SYXK(渝)2012-000】。

1.1.2 儀器與試劑

Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)(美國AB Sciex公司)；LC-30AD超高效液相系統(tǒng)(日本Shimadzu公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(美國貝克曼庫爾特公司)；Microfuge 20R高速冷凍離心機(jī)(美國貝克曼庫爾特公司)；渦旋振蕩器(德國IKA公司)；XS-105十萬分之一精密電子天平(瑞士Mettler Toledo公司)。

環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX，美國Sigma公司)，甲酸(formic acid，Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：56302-10ML)，抗體試劑盒(MolCpx FITC MAB 0.5MG 17A2，PERCP-CY5.5 MAB 0.1 MG 1D3；PE MAB 0.2MG GK1.5；CD8A PE-CY5 MAB 0.1MG 53-6.72168；APC MAB 0.1MG 53-7.3；美國BD公司)，水、腈、甲醇均為質(zhì)譜級(jí)(美國Fisher公司)，其他試劑均為市售分析純。

1.2方法

1.2.1 分組與給藥

在SPF清潔級(jí)環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，將20只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組各10只，每籠5只。實(shí)驗(yàn)組按照劑量灌胃給予環(huán)磷酰胺20 mg/kg[9]，空白對(duì)照組給予同體積的生理鹽水。連續(xù)給藥7 d，每天稱重，于第8天取全血于EP管中，靜置后離心取血清備用[10,11]。

1.2.2 全血檢測(cè)

另取全血，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T、B細(xì)胞及亞群等指標(biāo)，包括CD3+/CD8+、CD3+/CD4+、CD19+/CD5+、CD19-/CD5-、CD19+/CD5-、CD3+等指標(biāo)。

1.2.3 血清樣品處理及QC樣品制備

精密吸收小鼠血清樣品50 μL置1.5 mL EP管中，加入甲醇150 μL后于渦旋儀上混勻2 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液3 μL進(jìn)樣，進(jìn)行UPLC/Q-TOF-MS/MS分析。另取處理后樣品各20 μL混合后混勻作為QC樣品。

1.2.4 Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)的分析條件

系統(tǒng)選用Kinetex XB-C18柱 (100 mm×2.1 mm，2.6 μm)，流動(dòng)相為含0.1%甲酸的超純水(A)/乙腈(B)，采用梯度洗脫程序：起始B為10%并持續(xù)1.00 min；1.00～8.00 min B變?yōu)?0%，并持續(xù)至12.00 min；12.01 min B變?yōu)?0%并持續(xù)至15.00 min。流速為300 μL/min；柱溫為30℃。

Triple TOF 4600高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)采用ESI離子源，分別采用Positive離子化方式和Negative離子化方式；質(zhì)量掃描范圍m/z 100～1000；鞘氣為55 Psi，輔助氣為55 Psi；氣簾氣為25 Psi，霧化溫度600℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA掃描模式，TOF/MS一級(jí)預(yù)掃描和觸發(fā)的二級(jí)掃描Product Ion-IDA離子累積時(shí)間分別為250、100 ms，采用動(dòng)態(tài)背景扣除(DBS)作為二級(jí)觸發(fā)條件，解簇電壓80 V，CE碰撞能量為35 eV，CES碰撞能量疊加為(35±15) eV。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1全血檢測(cè)結(jié)果

T抑制細(xì)胞對(duì)體液免疫和細(xì)胞免疫起負(fù)向調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，T輔助細(xì)胞具有協(xié)助體液免疫和細(xì)胞免疫的功能。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)T、B細(xì)胞及亞群等指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，總T細(xì)胞和T輔助細(xì)胞上升明顯，而T抑制細(xì)胞出現(xiàn)下降現(xiàn)象；總B細(xì)胞明顯降低，同時(shí)，B1細(xì)胞和B2細(xì)胞均出現(xiàn)下降。說明環(huán)磷酰胺對(duì)T 抑制細(xì)胞和T輔助細(xì)胞均產(chǎn)生明顯影響，同時(shí)對(duì)B1細(xì)胞和B2細(xì)胞均產(chǎn)生不同程度影響(如表1所示)。

2.2QC樣品檢測(cè)分析結(jié)果

QC樣品檢測(cè)結(jié)果主要用于判斷樣品數(shù)據(jù)采集過程中儀器的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。通過連續(xù)10次連續(xù)進(jìn)樣分析結(jié)果可知，UPLC/Q-TOF-MS/MS質(zhì)譜系統(tǒng)在連續(xù)進(jìn)樣中快速平衡，連續(xù)進(jìn)樣至第10次重現(xiàn)性良好，適合大批量樣品數(shù)據(jù)采集(如圖1所示)。

2.3正常組與實(shí)驗(yàn)組代謝組學(xué)分析

為了研究將正常組與實(shí)驗(yàn)組代謝通路變化，將所得的原始數(shù)據(jù)通過MarkView軟件轉(zhuǎn)化后用進(jìn)行峰識(shí)別、峰對(duì)齊、扣除溶劑峰、雜質(zhì)峰的處理，濾噪等處理，導(dǎo)出的數(shù)據(jù)表得到由一系列三維矩陣，并進(jìn)行偏最小二乘法(PLS-DA)分析代謝譜變化，研究發(fā)現(xiàn)正常組與實(shí)驗(yàn)組存在明顯差異(如圖2所示,參數(shù)見表2)。

表1 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果Tab.1 The results of flow cytometry analysis

注：實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組，*P< 0.05,**P< 0.01。

Note: Compared with the CON group，*P< 0.05,**P< 0.01.

圖1 QC樣品重復(fù)十次進(jìn)樣的總離子流疊加圖Fig.1 The overlay chart of TIC spectra of the QC samples repeated ten times

圖2 正負(fù)兩種離子模式下小鼠血清樣品PLS-DA分析后的Score plot圖Fig.2 The score plot chart of PLS-DA of mouse serum samples by positive ion and negative ion modes

組別GroupsR2XR2YQ2正離子Positiveion0.5610.9910.938負(fù)離子Negativeion0.3540.9170.568

2.4差異物質(zhì)的解析

正常組與實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)明顯差異，為了研究造成兩組之間的差異性物質(zhì)，采用PLS-DA模型進(jìn)一步進(jìn)行處理。PLS-DA模型中變量重要性投影(variable importance in projection，VIP)參數(shù)篩選潛在的生物標(biāo)志物，VIP值是兩組中含量顯著改變的差異物質(zhì)的值，VIP >1，P<0.05時(shí)，說明對(duì)應(yīng)的代謝物是差異性代謝物。通過代謝組學(xué)小分子化合物快速鑒定分析軟件系統(tǒng)(OSI/SMMS，大連達(dá)碩信息技術(shù)有限公司)對(duì)差異性代謝物進(jìn)行進(jìn)一步鑒定分析，以MS1和MS2強(qiáng)度(加權(quán)法)進(jìn)行運(yùn)算最終鑒定代謝物15種。以P<0.05，VIP>1.00為差異物質(zhì)判斷規(guī)則，最終確定差異代謝物質(zhì)9種(如表3)。

2.5差異代謝通路富集分析

作為小分子物質(zhì)，差異性代謝物在機(jī)體內(nèi)多參與重要功能的調(diào)控，為了研究其各自發(fā)揮重要作用，借助KEGG網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫，找出其具體位置，并對(duì)各差異性代謝物相關(guān)代謝通路運(yùn)用Metaboanalyst 3.0(http://www.metaboanalyst.ca/)系統(tǒng)進(jìn)行通路富集，找出通路之間關(guān)聯(lián)，最終確定正常組與實(shí)驗(yàn)組代謝通路的差異與關(guān)聯(lián)(如圖3所示)。

3 結(jié)論與討論

通過分析發(fā)現(xiàn)，環(huán)磷酰胺對(duì)正常機(jī)體的不飽和脂肪酸的生物合成、線粒體脂肪酸代謝、甘油磷脂代謝、甾類激素的生物合成、花生四烯酸代謝、脂肪酸代謝、嘧啶的生物合成等代謝通路均產(chǎn)生明顯影響。通過通路富集結(jié)果顯示，環(huán)磷酰胺在正常組與實(shí)驗(yàn)組中影響最重要的代謝通路為花生四烯酸代謝、甘油磷脂代謝和嘧啶代謝。

環(huán)磷酰胺能抑制免疫細(xì)胞，又能抑制骨髓的造血功能，因此對(duì)于機(jī)體的損害是全身性的毒性作用[12,13]。環(huán)磷酰胺對(duì)處于有絲分裂循環(huán)周期的細(xì)胞產(chǎn)生破壞和殺滅作用，因此對(duì)活化增殖的細(xì)胞具有細(xì)胞毒性作用，表現(xiàn)為對(duì)免疫相關(guān)細(xì)胞呈現(xiàn)出較強(qiáng)的免疫抑制作用，所以環(huán)磷酰胺在免疫抑制研究中常作為陽性對(duì)照物，同時(shí)也有報(bào)道與代謝組學(xué)研究相關(guān)研究中。但是對(duì)于環(huán)磷酰胺對(duì)正常機(jī)體的相關(guān)研究卻不是相關(guān)研究重點(diǎn)，因此并未引起足夠重視。

表3 差異代謝物質(zhì)鑒定結(jié)果Tab.3 Characterization results of the differential metabolites

注：YES為最終確定差異代謝物質(zhì)，NO為未確定。

Note.“YES”is the metabolic substances for the final differences；“NO”meant not sure.

圖3 通路富集分析結(jié)果圖Fig.3 The chart of pathway view analysis results

在本研究中，環(huán)磷酰胺對(duì)正常機(jī)體產(chǎn)生明顯影響，不僅體現(xiàn)在機(jī)體生物學(xué)生理指標(biāo)和免疫細(xì)胞的變化，還通過代謝組學(xué)研究深入到相關(guān)作用機(jī)制的分子水平變化，對(duì)于后期相關(guān)研究采用環(huán)磷酰胺作為陽性對(duì)照物時(shí)，提供相關(guān)對(duì)照研究結(jié)果，具有一定的借鑒意義。

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Metabolomicanalysisofthechangesofpathwaysinimmunosuppressivemechanismcausedbycyclophosphamideinmice

SHI Xuan, YANG Yong, QIN Wei-han, XU Jia-hong, YANG Da-jian, GUO Yan-lei*

(Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, Chongqing 400065, China)

ObjectiveTo investigate the changes of metabolic pathways in the process of immunesuppression in mice caused by cyclophosphamide by metabolomic analysis.MethodsFlow cytometry was used to detect the changes of immune cells, and the results were analyzed using partial least squares model. The potential biomarkers were screened by variable importance in projection (VIP) parameters in the partial least squares model, and the differential metabolites were determined by statistical analysis. The differential metabolites were identified using the metabolomics rapid identification and analysis software. Nine kinds of metabolites were identified by searching and calculation, and result of pathway enrichment showed three differential metabolic pathways.ResultsCyclophosphamide had a significant effect on the biosynthesis of unsaturated fatty acids, metabolism of mitochondrial fatty acids, metabolism of glycophospholipid, biosynthesis of steroid hormones, metabolism of arachidonic acid, metabolism of fatty acids, and the biosynthesis of pyrimidine.ConclusionsThe most important metabolic pathways affected by cyclophosphamide in the normal body are the metabolism of arachidonic acid, glycophospholipid and pyrimidine.

Cyclophosphamide; Immunosuppression; Metabolomics; Metabolic pathway

GUO Yan-lei.Email: guoyanlei1210 @cqacmm.com

Q95-33

A

1005-4847(2017) 05-0539-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2017.05.013

2017-08-16

重慶市科委應(yīng)用開發(fā)(重大)項(xiàng)目(cstc2014yykfC10004)；(cstc2014yykfC10005)；重慶市科委基本業(yè)務(wù)費(fèi)(2016cstc-jbky-01912)；重慶市科委社會(huì)事業(yè)與民生保障科技創(chuàng)新專項(xiàng)(cstc2017shmsA130090、cstc2017shmsA130035)。

師萱，助理研究員，研究方向：食品科學(xué)。 E-mail： shixuan0932@126.com

郭延壘，助理研究員，研究方向：中藥藥代動(dòng)力學(xué)與代謝組學(xué)。E-mail： guoyanlei1210 @cqacmm.com