田 心 王淵博 馮嘉豪 劉超峰

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安710003；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，陜西 西安710032）

紅景天苷對乳鼠缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞及線粒體損傷的保護(hù)作用*

田 心1，2王淵博2馮嘉豪2劉超峰1△

（1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安710003；2.第四軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部生理學(xué)教研室，陜西 西安710032）

目的觀察紅景天苷對乳鼠缺氧/復(fù)氧后心肌細(xì)胞及線粒體損傷的保護(hù)作用并探討其機(jī)制。方法將乳鼠心肌細(xì)胞分為對照組、對照加紅景天苷組、缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組，分別用CCK8試劑盒檢測細(xì)胞活力，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、線粒體膜電位情況，激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)，并采用蛋白免疫印跡〔Western blot〕法分別檢測線粒體和胞漿細(xì)胞色素C（Cytochrome C）蛋白的表達(dá)。結(jié)果紅景天苷能使缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡減少，增加細(xì)胞活力，升高線粒體膜電位，減少線粒體分裂，減少線粒體細(xì)胞色素C的釋放，實現(xiàn)缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞及線粒體損傷的保護(hù)作用。結(jié)論紅景天苷可減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷，減少心肌細(xì)胞的凋亡，保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體功能。

紅景天苷 缺氧/復(fù)氧損傷 線粒體 保護(hù)作用

心肌缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷是急性心肌梗死溶栓和介入治療的過程中經(jīng)常伴隨的一種病理、生理過程，其損傷機(jī)制復(fù)雜沒有明確的治療方法[1-2]。近年來，中藥紅景天的一些有效成分對其作用的機(jī)制研究較多，相關(guān)證據(jù)[3-4]顯示紅景天苷對在體和離體心肌有明確的保護(hù)作用，并有抗氧化應(yīng)激損傷的效果。本研究擬在細(xì)胞水平模擬心肌缺血再灌注損傷建模基礎(chǔ)上，通過細(xì)胞活性和凋亡的測定探討紅景天苷的保護(hù)作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1材料

H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細(xì)胞，購自中科院上海生命科學(xué)研究院；1～3 d日齡的SD乳鼠，第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。高糖DMEM培養(yǎng)液購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Gibco公司，Ⅱ型膠原酶、胰蛋白及酶基質(zhì)膠與Mdivi-1購自美國Sigma公司；JC-1試劑盒，小鼠抗β-actin、兔抗Cytochrome C抗體購自美國abcam公司；MitoTracker-Red熒光探針購自碧云天公司；CCK8試劑盒購自上海貝博生物公司；流式細(xì)胞儀為美國BD Immunocytometry Systems產(chǎn)品；酶標(biāo)儀為美國Molecular Devises公司；電泳系統(tǒng)及凝膠成像系統(tǒng)均為Bio Rad公司產(chǎn)品；紅景天苷購于中國藥品生物制品檢定所，藥品純度≥98.0%（HPLC），藥品批號：110818-201206。

1.2方法

1.2 .1 H9C2（2-1）大鼠胚胎心肌細(xì)胞系的培養(yǎng)[5]將含10%胎牛血清的高糖培養(yǎng)基的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞生長至互相接近時，用胰酶消化按照1∶3～1∶5開始傳代，在實驗前1 d，更換為含2%胎牛血清的培養(yǎng)基，使其向心肌細(xì)胞分化。

1.2 .2心肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)和鑒定[5]無菌條件下取1～3 d SD乳鼠心臟，剪碎，加入含1.0 g/L的膠原酶消化液中，3～5min 37℃水浴中反復(fù)吹打后棄上清液，沉淀中再加消化液，再于37℃水浴中3～5 min，反復(fù)吹打后取上清液，置于含100 mL/L的高糖培養(yǎng)基中（加100U/mL青霉素及0.1mg/mL鏈霉素）。重復(fù)以上操作，離心后取沉淀重懸于培養(yǎng)基中，差速貼壁90～120min，將細(xì)胞懸液移至培養(yǎng)皿中，間斷觀察細(xì)胞形態(tài)，必要時換液，若由圓形變成不規(guī)則形或梭狀，由靜止變?yōu)橛幸?guī)律地收縮時進(jìn)行實驗。

1.2 .3建立缺氧/復(fù)氧模型 將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞置于37℃缺氧孵箱內(nèi)孵育3 h，即為模擬缺血。更換正常培養(yǎng)液，37℃5%CO2孵箱內(nèi)復(fù)氧2 h即為模擬再灌注處理組給藥選擇在復(fù)氧階段，紅景天苷給藥濃度為5μmol/L[6]。

1.2 .4試驗分組 將心肌細(xì)胞分為對照組、對照加紅景天組，缺氧/復(fù)氧組、缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組，對照組及缺氧/復(fù)氧組給予等體積的無菌PBS溶液。

1.2 .5細(xì)胞活力檢測 將心肌細(xì)胞均勻接種于96孔板中，每孔加培養(yǎng)液100μL，同時設(shè)置空白孔，置于37℃5%CO2孵箱中過夜，按照前述實驗分組進(jìn)行缺氧造模，統(tǒng)一在復(fù)氧時進(jìn)行給藥，復(fù)氧結(jié)束后各組細(xì)胞每孔加入10μL CCK-8溶液，37℃孵育1～2 h，酶標(biāo)儀450 nm下依據(jù)吸光度測定各孔吸光值，細(xì)胞活力=（OD實驗孔-OD空白孔）/（OD對照孔-OD空白孔）×100%，結(jié)果為細(xì)胞活力的比率（相對于常氧對照組）。

1.2 .6流式法檢測心肌細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率 將心肌細(xì)胞均勻接種于直徑6 cm培養(yǎng)皿中，前述缺氧、復(fù)氧操作同上，給藥復(fù)氧結(jié)束后，將所有各組培養(yǎng)皿中的細(xì)胞消化下來重懸于15mL離心管中低速離心3min后棄上清液，無菌PBS液加入重懸，再次低速離心后棄上清液，將沉淀細(xì)胞移至流式專用管中，加入10μL的FITC-conjugated-Annexin V和5μL的碘化吡啶（PI），搖勻后室溫下避光反應(yīng)15 min，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測。

1.2 .7流式法檢測心肌細(xì)胞線粒體膜電位 將心肌細(xì)胞均勻接種于6孔板中，前述缺氧、復(fù)氧操作同上，給藥復(fù)氧結(jié)束后，按照J(rèn)C-1試劑盒規(guī)范操作，將培養(yǎng)板中的細(xì)胞消化下來重懸于15mL離心管中低速離心3 min后棄上清液，無菌PBS液洗滌1遍后，加入JC-1工作液染色，于37℃恒溫箱中避光反應(yīng)30 min后，再次用無菌PBS液洗滌1遍后，將沉淀細(xì)胞移至流式專用管中，經(jīng)流式細(xì)胞儀分析檢測。

1.2 .8激光共聚焦顯微鏡觀察 將培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞鋪于激光共聚焦皿中，進(jìn)行處理同上，將無水DMSO溶劑配置MitoTracker-Red為100μmol/L的工作液，然后按照1 mL培養(yǎng)基加入1μL的工作液進(jìn)行線粒體染色，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min，立即用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體形態(tài)。

1.2 .9蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測Cytochrome C蛋白在線粒體及胞漿中的表達(dá) 心肌細(xì)胞經(jīng)過處理后由線粒體/胞漿蛋白提取試劑盒提取蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，用SDS-PAGE進(jìn)行電泳，并將其轉(zhuǎn)膜到硝酸纖維素 （NC）膜上，100 g/L的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，滴加1∶1000的抗Cyto C和β-actin一抗孵育過夜，PBST洗膜（5 min×5次），再用1∶5000的辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，再次洗膜（5 min×5次），后于膜上滴加顯影液，進(jìn)入發(fā)光儀器后曝光后觀察結(jié)果，并利用該系統(tǒng)軟件對目的條帶進(jìn)行分析獲取統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1紅景天苷對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的影響

見表1。與對照組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞活力明顯降低（P＜0.01）；與缺氧/復(fù)氧組比較，缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組細(xì)胞活力明顯提升（P＜0.01）。

表1 各組心肌細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞線粒體膜電位及心肌細(xì)胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達(dá)的比較（±s）

表1 各組心肌細(xì)胞活力、心肌細(xì)胞凋亡、心肌細(xì)胞線粒體膜電位及心肌細(xì)胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達(dá)的比較（±s）

與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與缺氧復(fù)氧組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

組 別 細(xì)胞活力比率 灰度比值（Mito/Cyto）細(xì)胞凋亡率（%） 相對紅染率（%）對照組0.99±0.01 2.07±0.15對照加紅景天苷組0.99±0.01 1.93±0.12缺氧/復(fù)氧組0.56±0.04**0.46±0.04*4.52±0.49 98.00±1.00 4.80±0.30 96.33±1.53 39.80±3.48**68.33±2.52**缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組0.87±0.03△△1.43±0.15△15.13±2.40△△88.33±2.52△△

2.2紅景天苷對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧凋亡的影響

見圖1，表1。與對照組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞凋亡率明顯增高（P＜0.01）；與缺氧/復(fù)氧組比較，缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組細(xì)胞凋亡率明顯降低（P＜0.01）。

2.3紅景天苷對心肌細(xì)胞線粒體的膜電位的影響

圖1 心肌細(xì)胞凋亡圖

見圖2，表1。與對照組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞線粒體膜電位明顯下降（P＜0.01）與缺氧/復(fù)氧組比較，缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組細(xì)胞線粒體膜電位明顯上升（P＜0.01）。

圖2 心肌細(xì)胞線粒體膜電位圖

2.4紅景天苷對缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體分裂的影響

見圖3，表1。激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞線粒體，對照組、對照加紅景天苷組線粒體呈網(wǎng)管狀結(jié)構(gòu)，而缺氧復(fù)氧組細(xì)胞線粒體呈點(diǎn)狀、碎片化，提示分裂增加；對比缺氧/復(fù)氧組，缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組的分裂明顯減少。

圖3 紅景天苷對心肌細(xì)胞線粒體形態(tài)的影響（600倍）

2.5紅景天苷對心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)Cytochrome C表達(dá)的影響

見圖4，表1。與對照組比較，缺氧/復(fù)氧組細(xì)胞線粒體內(nèi)Cytochrome C表達(dá)降低，而胞漿內(nèi)Cytochrome C表達(dá)升高（P＜0.05）；與缺氧/復(fù)氧組比較，缺氧/復(fù)氧加紅景天苷組的線粒體內(nèi)Cytochrome C表達(dá)升高，而胞漿內(nèi)Cytochrome C表達(dá)降低（P＜0.05）。

3 討 論

圖4 心肌細(xì)胞線粒體及胞漿的Cytochrome C表達(dá)電泳條帶

急性心梗是由于冠脈斑塊破裂入血阻塞血管引發(fā)，過程往往伴隨著缺血/再灌注損傷心肌細(xì)胞，而線粒體為細(xì)胞能量代謝保證有效供氧、ATP，以及有效的離子交換，線粒體結(jié)構(gòu)和功能的改變對心血管系統(tǒng)的生理和病理起著關(guān)鍵作用[7]。線粒體膜電位是由內(nèi)膜兩側(cè)質(zhì)子及其他離子的不對稱分布而形成，在缺血再灌注時，氧化磷酸化功能障礙，在此過程中，可伴隨線粒體裂解增加，DNA碎片化，線粒體膜電位升高，線粒體膜通透孔開放，并釋放細(xì)胞色素C從線粒體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[8]。如何有效采用藥物干預(yù)保護(hù)心肌細(xì)胞線粒體，減少心肌細(xì)胞的損傷是心血管領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)?；谝陨显颍狙芯客ㄟ^細(xì)胞活性、凋亡、線粒體膜電位、線粒體形態(tài)學(xué)改變以及細(xì)胞色素C蛋白表達(dá)水平的測定，證實了紅景天苷具有減輕缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致的心肌細(xì)胞線粒體損傷，實現(xiàn)抗心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。

傳統(tǒng)中藥紅景天的有效活性成分為紅景天苷，紅景天苷是一種苯乙醇類化合物，心血管系統(tǒng)藥理研究較多[9]。其具有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老等功效，亦在神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病方面具有顯著的療效[10-11]。龍怡等研究發(fā)現(xiàn)紅景天在心肌細(xì)胞中有明顯抗缺氧作用，其5種單體成分對缺氧缺糖心肌細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，與上調(diào)HIF-1αmRNA的表達(dá)有關(guān)[12]。付金容等證實在慢性間斷性缺氧中，紅景天苷通過減少凋亡相關(guān)因子的表達(dá)，抑制Caspase-3的活性，從而保護(hù)心功能[13]。朱寧等認(rèn)為紅景天苷對缺氧誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用，與其減輕氧自由基損傷及提高肌漿網(wǎng)鈣泵活性有關(guān)[14]。

線粒體呼吸氧化過程是轉(zhuǎn)換底物的氧化還原勢能為質(zhì)子電化學(xué)勢能，質(zhì)子電化學(xué)勢能再轉(zhuǎn)為ATP的高磷酸鍵的過程[15]。其呼吸氧化過程伴隨著膜電位的除極和復(fù)極，最早被發(fā)現(xiàn)用來染線粒體的染色劑是rhodamine 123（Rh 123），能被活細(xì)胞攝取，與膜電位成正比，之后陸續(xù)出現(xiàn)各種染色劑，如MitoTracker系列染料等，此類熒光染料常用于需要固定的情況，如免疫細(xì)胞化學(xué)、TUNEL染色等，而JC-1被認(rèn)為對線粒體膜電位具有較高的敏感性和辨識度，其特性是490 nm激發(fā)光則為綠色，隨著膜電位上升，590 nm激發(fā)光時則為橙色，因此，JC-1是電壓依賴性熒光染料，能夠用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡做定性定量分析[16]。

本研究采用體外心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模擬心肌缺血再灌注損傷，從細(xì)胞水平觀察紅景天苷能否抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷，并對心肌細(xì)胞線粒體產(chǎn)生保護(hù)作用，可見紅景天苷對缺氧復(fù)氧所致心肌細(xì)胞損傷、凋亡具有抑制作用，并闡述紅景天苷能夠維持缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體膜電位、抑制線粒體分裂。Western blot結(jié)果顯示，紅景天苷能夠抑制細(xì)胞色素C的釋放，升高線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的濃度，減少胞漿中細(xì)胞色素C的濃度這可能跟其有效減少線粒體膜通透孔的開放的機(jī)制有關(guān)，表明紅景天苷能夠保護(hù)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞線粒體功能。但其調(diào)控的具體信號通路，是如何抑制缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞損傷，實現(xiàn)保護(hù)線粒體作用，有待于進(jìn)一步研究。

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Protective Effects of Salidroside in Cardiomyocyte and Mitochondria Injury Induced by Hypoxia/Reoxygenation

TIAN Xin，WANG Yuanbo，F(xiàn)U Feng，et al.Department of Cardiology，Traditional Chinese Medical Hospital of Shanxi Province，Shanxi，Xian 710003，China.

Objective：To study the protective effects of Salidroside in cardiomyocyte and mitochondria induced by hypoxia/reoxygenation.Methods：Cardiomyocyte were divided into the control group，the control and Salidroside group，hypoxia/reoxygenation group，hypoxia/reoxygenation and Salidroside group.Cell viabilitieswere detected by cell counting kit（CCK-8）；apoptotic cells were detected by flow cytometry；mitochondria membrane potentials were measured by JC-1 kit.The morphology of cell mitochondria was observed by laser scanning confocal microscopy.The expression of cytochrome C protein in mitochondria and cytoplasm was detected with Western blot.ResultsSalidroside could decrease hypoxia/reoxygenation myocardial cells apoptosis，increase cell viability，increase mitochondrial membrane potential，reduce mitochondrial fission，reduce mitochondrial cytochrome C release and protect cardiomyocyte and mitochondria against hypoxia/reoxygenation injury.Conclusions：Salidroside can alleviate hypoxia/reoxygenation injury，reduce cardiomyocyte apoptosis and protect cell mitochondrial function.

Salidroside；Hypoxia/reoxygenation injury；Mitochondria；Protective effect

R285.5

A

1004-745X（2017）10-1714-04

10.3969/j.issn.1004-745X.2017.10.007

陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計劃項目（2016KTZDSF01-03-02）

△通信作者（電子郵箱：Liu.reld@aliyun.com）

2017-06-15）