葉興東 高方銘 曹文苓 林宏達(dá) 任澤舫

510095廣州市皮膚病防治所（葉興東、高方銘、曹文苓）；中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（林宏達(dá)、任澤舫）

巢式-實時PCR檢測梅毒初診患者不同樣本中梅毒螺旋體靶DNA

葉興東 高方銘 曹文苓 林宏達(dá) 任澤舫

510095廣州市皮膚病防治所（葉興東、高方銘、曹文苓）；中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（林宏達(dá)、任澤舫）

目的探討巢式-實時PCR（NR-PCR）檢測初診梅毒患者不同樣本中梅毒螺旋體（Tp）靶DNA的可行性及應(yīng)用前景。方法以Tp polA為靶基因，用NR-PCR檢測梅毒患者初診時皮損拭子、血清、全血、腦脊液、末梢耳垂血等樣本中的靶DNA，用統(tǒng)計軟件SPSS.13分析結(jié)果。結(jié)果NRPCR檢測Tp polA靶DNA的極限為2個Tp/ml，總體陽性率為71.7%，檢測不同類樣本的陽性率從高到低依次為：耳垂血92.0%＞腦脊液90.2%＞拭子74.3%＞血清66.9%＞全血64.2%。NR-PCR結(jié)果與血清學(xué)檢查結(jié)果的一致性為76.0%（152/200）。進(jìn)一步分析顯示：一期、二期梅毒拭子DNA陽性率（63.2%比87.5%）差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=2.62，P＞0.05）；血清樣本中，二期梅毒DNA陽性率高于一期梅毒（χ2=3.6，P=0.06）；全血樣本中，二期梅毒DNA陽性率高于其他各類型梅毒；神經(jīng)梅毒耳垂末梢血陽性率與腦脊液比較，P=0.06。隱性梅毒血清（RPR）滴度≥1∶8組的Tp DNA陽性率高于RPR≤1∶4組。結(jié)論NR-PCR方法檢測梅毒患者不同樣本中Tp DNA是可行的，不同類型梅毒、不同類型樣本以及其血清RPR滴度水平都影響Tp DNA陽性率。

梅毒；蒼白密螺旋體；臨床實驗室技術(shù)；實時聚合酶鏈反應(yīng)；巢式聚合酶鏈反應(yīng)

梅毒是梅毒蒼白螺旋體（Treponema palladium，Tp）感染引起的慢性系統(tǒng)性疾病。Tp還不能在體外培養(yǎng)［1］，采用熒光抗體或暗視野顯微鏡直接鏡檢發(fā)現(xiàn)，Tp和（或）血液梅毒抗體檢測是目前診斷梅毒的主要方法，常規(guī)PCR檢測Tp DNA診斷梅毒主要適用于疑似梅毒患者的拭子樣本，而檢測血液樣本的敏感性低［2］，Tp早期感染及神經(jīng)梅毒的診斷面臨挑戰(zhàn)，以Tp polA，tpp47為靶基因的巢式PCR是較理想的分子生物學(xué)檢測手段［3］。結(jié)合巢式PCR和實時PCR的巢式-實時PCR（NR-PCR）檢測梅毒患者體液中Tp DNA在臨床的應(yīng)用尚未見報道。我們于2012—2015年間收集臨床診斷為各類型梅毒的體液（血漿、血清、耳垂血、腦脊液、拭子）樣本進(jìn)行了NR-PCR檢測，取得較理想的效果，報道如下。

資料與方法

1.病例來源：2012年7月至2015年6月，取得患者知情同意后，收集在廣州市皮膚病防治所、番禺區(qū)中心醫(yī)院、廣東省第二人民醫(yī)院、番禺區(qū)慢性病防治站、廣州市第一人民醫(yī)院、廣州市腦科醫(yī)院等醫(yī)院初診且血清梅毒螺旋體明膠顆粒凝集試驗（TPPA）和快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗（RPR）雙陽性的患者血液/血清、皮損/組織液拭子、腦脊液。一期梅毒、二期梅毒、三期梅毒、隱性梅毒以及神經(jīng)梅毒的診斷參照文獻(xiàn)［4］。按照性病診療指南［4］梅毒診療方案治療首診后梅毒患者200例，男121例，女79例；年齡21～65歲，平均36歲。一期梅毒19例均有硬下疳；23例二期梅毒（11例表現(xiàn)為軀干丘疹、掌部銅紅色脫屑性紅斑，5例為外陰、肛周扁平濕疣，7例為脫發(fā)，色素減退斑、礪殼樣痂屑）；三期梅毒10例及隱性梅毒106例、神經(jīng)梅毒42例。本研究通過廣州市皮膚病防治所醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2.樣本采集：①皮損拭子或組織液：治療前用生理氯化鈉溶液清潔皮損后，左手拇、食指捏緊皮損，右手用棉拭子擦拭或鈍刀刮取潰瘍或斑疹或扁平濕疣皮損，直至肉眼可見組織液，將拭子或鈍刀置標(biāo)記好的試管內(nèi)來回攪拌數(shù)次，將洗脫的樣本置-80℃保存?zhèn)溆茫虎谘汉脱澹褐委熐叭「稍镌嚬懿杉范净颊哽o脈血3 ml，200 μl分裝5份全血，其余2 ml離心收集血清，按200 μl分裝于1 ml離心管，-80℃保存?zhèn)溆谩Ｔ讷@得患者知情同意后同時采集患者耳垂血和腦脊液檢查，耳垂血采集50～100 μl，加氯化鈉生理溶液至200 μl保存；選擇無禁忌證患者常規(guī)腰穿收集2 ml腦脊液-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.試劑：TIANA mp Micro DNA試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，兔睪丸培養(yǎng)后純化的Tp陽性標(biāo)準(zhǔn)品（Nichol株）由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所性病參比實驗室尹躍平教授饋贈。所有引物及探針序列參照文獻(xiàn)［5］由美國Invitrogen公司合成。常規(guī)PCR polA基因引物：引物對F1/R1，序列F1：5′-TGCGCGTGTGCGAATGGTGTGGTC-3′，R1：5′-CAC AGTGCTCAAAAACGCCTGCACG-3′，產(chǎn)物長度為377 bp。實時PCR引物及探針序列參照文獻(xiàn)［6］合成 SyphTF：5′-AGGATCCGGCATATGTCCAA-3′，SyphTR：5′-GTGAGCGTCTCATCATTCCAAA-3′，MGB探針SyphTP的序列：ATGCACCAGCTT CGA。

4.檢測方法：參照說明書，用TIANA mp Micro DNA試劑盒提取Tp基因組DNA，紫外分光光度計測定DNA濃度后-80℃凍存?zhèn)溆?。外引物PCR反應(yīng)體系包括：Plantium PCR Super MIX 20 μl，正反向引物各1 μl（終濃度為0.4 μmol/L），DNA模板為3 μl，總體積25 μl。參數(shù)設(shè)置：預(yù)變性94℃5 min，變性94 ℃ 30s，退火65℃ 30s，延伸72 ℃ 1min，循環(huán)30次，72℃延伸7 min。常規(guī)PCR外擴(kuò)增產(chǎn)物1∶2稀釋后取4 μl為模板DNA，預(yù)先加入384孔PCR板中，于干凈的培養(yǎng)箱中65℃30 min烘干水分。各孔中加入下列反應(yīng)組分：TaqMan?Master Mix 2.5 μl，引物終濃度為0.3 μmol/L，加無菌水補充體系至5 μl。反應(yīng)參數(shù)：孵化50℃ 2 min，預(yù)變性95℃ 15 min，變性95℃15 s，退火延伸60℃1 min，循環(huán)40次。PCR擴(kuò)增每個樣本設(shè)置復(fù)孔，每板設(shè)陰性（無菌水）及陽性對照（標(biāo)準(zhǔn)品）。Ct值由美國ABI公司計算，閾值設(shè)置于擴(kuò)增曲線對數(shù)增長期，樣本擴(kuò)增曲線清晰、平滑，Ct值＜40判為陽性。

5.統(tǒng)計分析：Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS 13.0軟件統(tǒng)計分析，用描述性統(tǒng)計指標(biāo)（%）統(tǒng)計各類樣本的Tp DNA陽性率，χ2檢驗統(tǒng)計不同臨床樣本Tp DNA陽性率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、樣本采集結(jié)果

200例梅毒患者采集到368份各類樣本，其中91例患者只采集了1份樣本（5例一期梅毒只有拭子，7例二期梅毒只有全血，7例三期梅毒只有血清，53例隱性梅毒只有血清，19例神經(jīng)梅毒只有腦脊液），其余109例患者分別有多份樣本合計277份。各類型梅毒樣本分布見表1。

二、NR-PCR方法學(xué)的建立

用陽性標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后一式三份對NR-PCR檢測Tp DNA的檢測能力進(jìn)行觀察，顯示檢測Tp DNA最大極限為2個Tp/ml（圖1），隨著初始DNA模板量的減少，Ct值隨之增大，兩者之間呈線性趨勢，以初始模板濃度取10為底的對數(shù)作橫軸，檢測Ct值作縱軸，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-3.3209x+37.743（縱軸y為Ct值，橫軸x為初始模板DNA濃度取10為底的對數(shù)），R2=0.991，表明兩者之間相關(guān)性較強（圖2）。

三、NR-PCR檢測梅毒感染者初診時各類樣本中Tp DNA陽性率

表1 200例初診梅毒患者各類生物樣本分布情況［例（%）］

圖1 陽性標(biāo)準(zhǔn)品各梯度巢式-實時PCR擴(kuò)增曲線 從左至右，換算Tp濃度分別為：2 × 105個Tp/μl、2 × 104個Tp/μl、2 × 103個Tp/μl、200 個 Tp/μl、20 個 Tp/μl、2 個 Tp/μl、200 個 Tp/ml、20 個 Tp/ml、2 個Tp/ml

圖2 陽性標(biāo)準(zhǔn)品巢式-實時PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線

所檢測的368份樣本中，Tp DNA總陽性率為71.7%（264/368），NR-PCR結(jié)果與血清學(xué)檢查結(jié)果的一致性為76.0%（152/200，1例患者有多種標(biāo)本陽性，只計算1次陽性）。各類型樣本陽性率從高到低依次為：耳垂血92.0%（23/25）、腦脊液90.2%（46/51）、拭子74.3%（26/35）、血清66.9%（99/148）、全血64.2%（70/109），各類樣本陽性率間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=18.55，P＜ 0.01），但進(jìn)一步分析顯示：血清和全血比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.20，P=0.66）；耳垂血和腦脊液比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（校正χ2=0.03，P=0.87）。

表2 不同類型梅毒的不同樣本Tp DNA陽性率組間比較

四、各類型梅毒中不同類型樣本間Tp DNA陽性率比較

一期梅毒中，拭子、血清、全血三者比較，Tp DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.29，P=0.12）；二期梅毒中，拭子、血清、全血三者比較，Tp DNA陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.32，P=0.12）。全血與血清陽性率比較（精確概率P=0.12）；隱性梅毒中，四類型樣本比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=4.55，P=0.21）；神經(jīng)梅毒中，四類型樣本陽性率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=8.20，P=0.04）；將耳垂血、血清、全血樣本合并，再與腦脊液比較，顯示腦脊液陽性與血液陽性率之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=0.36，P=0.54），各類型梅毒不同類型樣本組間陽性率比較結(jié)果見表2。

五、不同類型梅毒、不同RPR滴度水平血清Tp DNA陽性率比較

依據(jù)RPR滴度水平，以1∶8滴度為界分為兩組，為排除血清和全血樣本重復(fù)檢測的影響，我們僅對148份血清Tp DNA陽性率進(jìn)行單獨分析，由于二期梅毒和三期梅毒兩組RPR≤1∶4樣本數(shù)為0，二期梅毒16例均RPR≥1∶8，陽性率62.5%；三期梅毒10例均RPR≥1∶8，陽性率50%。一期、神經(jīng)梅毒未見不同滴度水平對Tp DNA陽性率有關(guān)，可能與樣本量小有關(guān)。隱性梅毒血清Tp DNA陽性率與RPR滴度水平有關(guān)，滴度越高，陽性率越高。一期、隱性梅毒、神經(jīng)梅毒不同血清RPR滴度水平的Tp DNA陽性率比較見表3。

表3 不同類型梅毒初診患者血RPR滴度水平與Tp DNA陽性率比較

討 論

本研究是國內(nèi)首次報道的NR-PCR法用于檢測梅毒臨床患者各種生物樣本中的Tp DNA，總體陽性率達(dá)到71.7%，表明該方法可行。需要注意的是，為避免DNA交叉污染，每次實驗前用70%乙醇擦拭移液器，并置于紫外線消毒30 min。在DNA提取、試劑配置及模板加樣都在生物安全柜進(jìn)行操作。

本研究提示，NR-PCR檢測Tp Nichol標(biāo)準(zhǔn)株DNA的極限為2個Tp/ml，高于既往報道的其他PCR法，如Marra等［7］用改良RT-PCR法檢測腦脊液中的Tp DNA的極限可達(dá)1～10個Tp/ml。曾鐵兵等［8］報道，常規(guī)及巢式PCR檢測Tp DNA極限分別為400 個/ml及 10 個/ml，而 Grange等［9］以 Nichol標(biāo)準(zhǔn)株DNA為參照，報道了巢式PCR檢測極限為20個Tp/ml。由于檢測系統(tǒng)封閉且污染少，實時PCR也成功用于多種體液樣本中的Tp DNA的檢測［10］，文獻(xiàn)報道，其檢測Tp的極限為10 × 103/ml［11］。NR-PCR檢測極限較高的原因可能與其通過外引物擴(kuò)增增加了Tp靶DNA模板量和高度敏感且特異的檢測探針有關(guān)。

polA基因是目前PCR方法診斷Tp感染常用的引物候選基因［3］。Sutton等［12］首次以polA為靶基因，PCR法成功檢測Tp DNA診斷Tp感染，陽性率介于27%～93%，全血樣本檢測的陽性率最低，皮損陽性最高。本研究顯示，polA為靶基因NR-PCR法檢測Tp DNA總陽性率71.7%，各類型樣本陽性率介于64.2%～92.0%，且肘靜脈全血Tp DNA陽性率最低，但皮損/組織液Tp DNA陽性率不及耳垂血和腦脊液的陽性率高，可能與本研究中不同單位技術(shù)人員樣本采集方法技術(shù)差異和皮損因素影響有關(guān)，但總體高于Castro等［13］報道的polA為靶基因PCR檢測結(jié)果（總陽性31.1%，血液樣本各成分Tp DNA陽性率介于25%～56%之間）。類似的，也高于Flasarova等［14］用巢式PCR檢測臨床樣本中Tp DNA陽性率（不同類型梅毒血液陽性率介于8.8～64.8%）。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清RPR滴度水平與Tp DNA陽性率有關(guān)，一期、神經(jīng)梅毒由于樣本量少，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在隱性梅毒患者中，血清RPR滴度≥1∶8者Tp DNA陽性率顯著高于RPR≤1∶4者，二期梅毒和三期梅毒中，RPR滴度 ≥1∶8者，Tp DNA均陽性，1∶8通常被認(rèn)為是梅毒活動的指征［15-16］。

本研究初步顯示，NR PCR在Tp DNA檢測中有應(yīng)用價值，但也存在一些不足：一是標(biāo)準(zhǔn)品中可能含有一定的兔體細(xì)胞DNA，Tp DNA陽性只具有診斷價值，并不說明傳染性問題。且未在本研究中與定量PCR進(jìn)行平行對照；二是研究中各類型梅毒及其不同樣品數(shù)量不均衡，因此結(jié)果可能有所偏倚；三是限于篇幅，未就同一患者不同樣本的檢出一致率進(jìn)行分析。作為一種新的PCR結(jié)合技術(shù)，仍需擴(kuò)大樣本量進(jìn)行深入研究，以期臨床能夠應(yīng)用。

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第三屆全國銀屑病學(xué)術(shù)會議征文通知

為了讓皮膚科醫(yī)師了解國內(nèi)外關(guān)于銀屑病研究的最新動向，分享知名專家的臨床診治經(jīng)驗，中國中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會皮膚性病專業(yè)委員會定于2018年9月21-23日在上海召開“第三屆全國銀屑病學(xué)術(shù)會議”。會議將邀請國內(nèi)外知名專家報告他們在銀屑病基礎(chǔ)與臨床的最新研究進(jìn)展，演講者報告形式多樣、內(nèi)容豐富。歡迎從事銀屑病基礎(chǔ)及臨床研究的皮膚科醫(yī)師和相關(guān)人員踴躍投稿和參會。

一、投稿要求：①投稿內(nèi)容：銀屑病基礎(chǔ)研究論文、銀屑病臨床診斷和治療等方面的論文、典型與疑難病例等；②投稿方式：中文全文和400字以內(nèi)的中文摘要，請通過電子郵件投稿，Email：pfkxh@126.com。來稿請注明第三屆全國銀屑病學(xué)術(shù)會議征文，截稿日期：2018年8月1日；③會議交流形式：特邀演講、大會發(fā)言、分會發(fā)言、書面交流。

二、聯(lián)系方式：上海市黃浦區(qū)成都北路500號峻嶺廣場19樓1908室，上海長征醫(yī)院《中國真菌學(xué)雜志》編輯部，郵編200003，Email：pfkxh@126.com，聯(lián)系人：施慧，021-81885497，手機(jī)13764560811。

Application of nested real-time PCR in detecting Treponema palladium DNA in various clinical samples from patients preliminarily diagnosed as syphilis

Ye Xingdong,Gao Fangming,Cao Wenling,Lin Hongda,Ren Zefang
Guangzhou Institute of Dermatology,Guangzhou 510095,China（Ye XD,Gao FM,Cao WL）;School of Public Health,Sun Yat-sen University,Guangzhou 510080,China（Lin HD,Ren ZF）

Ye Xingdong,Email:yxingdong@qq.com

ObjectiveTo investigate the feasibility and prospects of nested real-time PCR（NRPCR）technique forTreponema palladium（Tp）detection in various samples of different stages of syphilis from patients preliminarily diagnosed as syphilis.MethodsTargeting the Tp polA gene,NR-PCR was performed to detect Tp DNA in various samples from the patients with various stages of syphilis at the first clinic visit,including skin tissue fluid swabs,serum,whole blood,cerebrospinal fluid（CSF）and earlobe blood.Data were analyzed with SPSS software version 13.ResultsA total of 368 clinical samples were collected from 200 patients with syphilis.With a detection limit of 2 Tp/ml,NR-PCR showed that the total positiverateforTpDNAwas 71.7%（264/368）.TheTpDNApositiveratewashighestinearlobebloodsamples（92.0%,23/25）,followed by CSF samples（90.2%,46/51）,skin tissue fluid swabs（74.3%,26/35）,serum samples（66.9%,99/148）and whole blood samples（64.2%,70/109）.There was good agreement between NR-PCR results and serologic test results,with a consistency rate of 76.0%（152/200）.Furthermore,the Tp DNA positive rate did not differ between patients with primary（12/19）and secondary syphilis（14/16）in skin tissue fluid swabs（χ2=2.62,P＞ 0.05）,and was slightly but insignificantly higher in patients with secondary syphilis than those with primary syphilis in the serum samples（χ2=3.6,P=0.06）.The Tp DNA positive rate of whole blood samples was also higher in patients with secondary syphilis than those with any other types of syphilis.Among patients with neurosyphilis,no significant difference was observed in the Tp DNA positive rate between earlobe blood samples and CSF samples（P=0.06）.Among patients with latent syphilis,the Tp DNA positive rate was significantly higher in serum samples with an RPR titer of≥ 1∶8 than those with an RPR titer of≤ 1∶4.ConclusionNR-PCR is feasible for detecting Tp DNA in various kinds of samples,and the Tp DNA positive rate is influenced by stages of syphilis and types of samples,as well as RPR titers.

Syphilis;Treponema pallidum;Clinical laboratory techniques;Real-time polymerase chain reaction;Nested polymerase chain reaction

葉興東，Email：yxingdong@qq.com

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2017.05.008

廣東省科技計劃項目（2012B031800014）；廣州市科技攻關(guān)項目（201300000166）；廣州市醫(yī)藥衛(wèi)生科技項目（2012A031001）

Fund programs:Science and Technology Planning Project of Guangdong Province of China（2012B031800014）;Guangzhou Programs forScience and Technology DevelopmentofChina（201300000166）;Guangzhou Medical and Health Science and Technology Plan Project（2012A031001）

2017-02-10）

（本文編輯：吳曉初）