王秀琴 ，錢(qián)秋玉，王東興，石 蕾，陳 軍（陸軍總醫(yī)院263臨床部藥劑科，北京 101149）

通腦液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

王秀琴 ，錢(qián)秋玉，王東興，石 蕾，陳 軍（陸軍總醫(yī)院263臨床部藥劑科，北京 101149）

目的：建立通腦液的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法（TLC）對(duì)處方中西紅花進(jìn)行定性鑒別；采用HPLC法測(cè)定西紅花中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm），甲醇-水（48∶52）為流動(dòng)相，流速1.0 mL·min-1，柱溫30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)440 nm，進(jìn)樣量10 μL。結(jié)果：薄層鑒別專屬性強(qiáng)，分離效果好。西紅花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系（r = 1），西紅花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 μg·mL-1呈良好的線性關(guān)系（r = 0.9999），平均回收率分別為98.4%（RSD = 1.21%，n = 9），99.4%（RSD = 1.70%，n = 9）。結(jié)論：該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可作為通腦液的質(zhì)量控制方法。

西紅花；西紅花苷Ⅰ；西紅花苷Ⅱ；高效液相色譜法

[KEY WORDS]Saffron; Crocin Ⅰ; Crocin Ⅱ; HPLC

通腦液由西紅花、石菖蒲、川芎、水蛭等九味藥材研制而成，主要用于治療腦梗死、腦缺血、腦卒中恢復(fù)期、腦外傷及腦炎后遺癥、腦癱等癥狀。原標(biāo)準(zhǔn)中鑒別川芎[1]、西紅花不足以控制通腦液的質(zhì)量，增加該制劑中石菖蒲、水蛭的薄層鑒別，以更好的控制本品質(zhì)量，該實(shí)驗(yàn)另文有報(bào)道。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，西紅花提取物在抗心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治糖尿病并發(fā)癥等方面有明確的生物活性[2-3]。本實(shí)驗(yàn)采用薄層色譜法（TLC）對(duì)處方中君藥西紅花進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法（HPLC）測(cè)定西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量，作為通腦液的質(zhì)量控制指標(biāo)。

1 儀器與試藥

Agilent 1100型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司）；BT125D型電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）；色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm × 4.6 mm，5μm）；LDZ5-2型離心機(jī)（北京京立離心機(jī)有限公司）；ZF-2型紫外燈（上海嘉鵬科技有限公司）；851-2型遠(yuǎn)紅外快速干燥箱（上海向陽(yáng)無(wú)線電元件廠）。甲醇（色譜純，天津市康科德科技有限公司）；純化水（自制）；西紅花苷Ⅰ對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度：91.1%，批號(hào)：111588-201202，本品需冷凍遮光保存，使用前無(wú)需處理）；西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌罚ㄖ袊?guó)食品藥品檢定研究院，純度：92.4%，批號(hào)：111589-201304，本品需冷凍遮光保存，使用前無(wú)需處理）。 通腦液（解放軍第二五五醫(yī)院配制，每支8 mL，批號(hào)：20141117、20150309、20150415）。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花TLC鑒別

取西紅花對(duì)照藥材0.02 g，加甲醇4 mL，密塞，振搖，靜置30 min，取上清液作為藥材對(duì)照溶液。再另取缺西紅花的通腦液陰性樣品10 mL，濃縮至約2 mL，作為陰性對(duì)照溶液。吸取上述三種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄板上，以醋酸乙酯-甲酸-水（5 : 1 : 0.6）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)檢視。實(shí)驗(yàn)表明，供試品溶液在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同黃色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品未見(jiàn)干擾。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-水（48 : 52）；檢測(cè)波長(zhǎng)：440 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；理論塔板數(shù)按照西紅花苷Ⅰ峰計(jì)算應(yīng)不低于3500。

2.3 溶液的制備

（1）西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤旱闹苽洌喝∥骷t花苷Ⅰ對(duì)照品10 mg，精密稱定，置50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取1 mL西紅花苷Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液置10 mL量瓶中加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅰ對(duì)照品溶液（10 ℃以下保存）。再另取西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌?2 mg，精密稱定，置100 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液。精密量取1 mL西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液置10 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌啡芤海?0 ℃以下保存）。精密量取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液各1 mL于10 mL量瓶中稀釋至刻度，搖勻，即得（10 ℃以下保存）。（2）供試品溶液的制備：精密量取本品1 mL于10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，即得。（3）陰性樣品溶液的制備：精密吸取缺西紅花的通腦液陰性樣品1 mL置10 mL量瓶中，加稀乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.4 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)

分別精密吸取“2.3”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各5 μL，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。結(jié)果顯示，在西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ[4]對(duì)照品色譜峰的保留時(shí)間處，供試品溶液具有色譜峰，且色譜峰與相鄰峰得到基線分離，而陰性樣品溶液沒(méi)有色譜峰，共存的其他藥味對(duì)測(cè)定沒(méi)有干擾，表明該方法對(duì)通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的測(cè)定具有專屬性。對(duì)照品、供試品及陰性樣品色譜見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatograms

2.5 方法學(xué)驗(yàn)證

2.5.1 線性關(guān)系考察 精密稱取西紅花苷Ⅰ對(duì)照品10.60 mg置于50 mL量瓶中加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液。再分別精密量取西紅花苷Ⅰ對(duì)照品儲(chǔ)備液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0置10 mL量瓶中；精密稱取西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌?2.80 mg置于100 mL量瓶中，加稀乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液。再分別精密量取西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液0.5、0.6、0.8、1.0、2.0、3.0分別置上述10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，即得系列濃度西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌坊旌先芤?。分別精密吸取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌废盗袧舛然旌先芤焊? μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)表明，西紅花苷Ⅰ在9.66～ 57.94 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度的關(guān)系為：A= 26.717C– 0.0693（r= 1），西紅花苷Ⅱ在5.91 ～35.48 μg·mL-1濃度范圍內(nèi)峰面積與進(jìn)樣濃度的關(guān)系為：A= 28.673C– 7.1746（r= 0.9999），表明西紅花苷Ⅰ在9.66 ～ 57.94 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，西紅花苷Ⅱ在5.91 ～ 35.48 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 精密度實(shí)驗(yàn) 按“2.3”項(xiàng)下方法配制西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌穬?chǔ)備液。分別精密吸取上述儲(chǔ)備液各1.0 mL于10 mL量瓶中，用稀乙醇定容，搖勻，即得。進(jìn)樣，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行分析，重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積的RSD。實(shí)驗(yàn)表明，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.36%（n= 6）和1.02%（n= 6），表明儀器精密度良好。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：20150415）6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備，依法測(cè)定，記錄色譜圖。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量平均值分別為131.24 μg·mL-1（RSD = 1.02%，n= 6）和50.17 μg·mL-1（RSD = 1.75%，n= 6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一批樣品（批號(hào)：20150415）制備的供試品溶液，分別于0、2、4、6、10、12 h進(jìn)樣測(cè)定。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通腦液中西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ峰面積的RSD分別為0.47%（n= 6）和1.79%（n=6），表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ?qū)φ掌废♂屩瞥蓾舛确謩e為93.29 g·mL-1和56.62 g·mL-1的加樣用西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ溶液。分別取0.8、1.0、1.2 mL加樣用西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ溶液按低（80%）、中（100%）、高（120%）三個(gè)劑量組置于10 mL量瓶再分別精密稱取同一批已知含量的樣品（批號(hào)：20150415）9份，每份0.5 mL，加稀乙醇稀釋至刻度，搖勻后依法測(cè)定，記錄色譜峰值。結(jié)果表明該法適用于西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測(cè)定，見(jiàn)表1。

表1 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果. n = 9Tab 1 Results of recovery test for crocinⅠand crocinⅡ. n = 9

2.6 含量測(cè)定

取通腦液三批樣品（批號(hào)：20141117；20150309；20150415）按供試品溶液制備方法項(xiàng)下制備，依法測(cè)定峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ的含量[5-7]。測(cè)定數(shù)據(jù)與結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測(cè)定結(jié)果. n = 3Tab 2 Contents determination of crocinⅠand crocinⅡ. n = 3

3 討論

3.1 通腦液指標(biāo)成分及含量測(cè)定方法的選擇

君藥之一西紅花為鳶尾科植物番紅花（Crocus sativus L.）的干燥柱頭，性味甘、平，歸心、肝經(jīng)，具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效[1]。國(guó)內(nèi)外大量研究表明，西紅花提取物在抗心血管系統(tǒng)疾病、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、防治糖尿病并發(fā)癥等方面有明確的生物活性[2-3]，其藥理作用明顯，開(kāi)發(fā)潛力大，頗受醫(yī)藥界青睞。2010年版《中國(guó)人民解放軍醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)范》未對(duì)通腦液進(jìn)行含量測(cè)定，及未對(duì)制劑中組成成分石菖蒲、水蛭進(jìn)行鑒別。 根據(jù)《中國(guó)藥典》[3]、參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-8]及課題專家審批建議，選定處方組成中的君藥西紅花的有效成分西紅花苷Ⅰ、Ⅱ作為指標(biāo)成分，采用HPLC法對(duì)其進(jìn)行含量測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)所建立的方法操作簡(jiǎn)便、專屬性強(qiáng)，精密度、重復(fù)性、回收率均滿足要求，可作為通腦液的質(zhì)量控制方法。

3.2 通腦液含量限度的確定

本制劑為中藥制劑，進(jìn)行含量限度測(cè)定須注意：在保證藥物成分對(duì)臨床安全和療效穩(wěn)定的情況下，并基于足夠的具有代表性的樣品實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，結(jié)合藥材含量及工藝收率綜合分析制定。我們所測(cè)成分的原料為粉末、提取物入藥，該成分的轉(zhuǎn)移率應(yīng)不低于85%，且所測(cè)成分的原料在制備工藝中經(jīng)溶劑提取時(shí)，該成分轉(zhuǎn)移率一般應(yīng)不低于30%。

3.3 HPLC法測(cè)定條件的優(yōu)化

3.3.1 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇 參考文獻(xiàn)[5,9]并采用二級(jí)管陣列檢測(cè)器（DAD）進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描顯示，西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ在440 nm波長(zhǎng)范圍處有最大吸收，因此選擇440 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3.2 流動(dòng)相的選擇 經(jīng)過(guò)多次實(shí)驗(yàn)確定了以甲醇-水（48 : 52）為西紅花苷Ⅰ和西紅花苷Ⅱ含量測(cè)定的流動(dòng)相，峰形好，西紅花苷Ⅰ理論塔板數(shù)達(dá)5000以上，可作為通腦液的質(zhì)量控制方法。由于西紅花苷Ⅰ、Ⅱ的結(jié)構(gòu)中有多個(gè)共軛雙鍵，對(duì)pH、光照、溫度、氧等影響因素十分敏感，穩(wěn)定性差[2,7]，因此在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)保持溫度不變，所以選擇柱溫與外界溫度相一致。

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Quality standard studies of Tongnaoye

WANG Xiu-qin, QIAN Qiu-yu, WANG Dong-xing, SHI Lei, CHEN Jun(Pharmacy of 263 Clinical Department of the Army General Hospital, Beijing 101149, China)

Objective:To establish the quality standard of Tongnaoye.Methods:Thin layer chromatography (TLC) was used to identify crocus sativus in the prescription. High performance liquid chromatography (HPLC) was used to determine the content of crocin Ⅰ and crocin Ⅱ. Chromatographic conditions were as follows: Agilent ZORBAX SB-C18column (250 mm × 4.6 mm,5 μm) was used, the mobile phase consisted of methanol-water (48 : 52) with the fl ow rate of 1.0 mL·min-1, the detection wavelength was set at 440 nm, the temperature was 30 ℃ and the sample volume was 10 μL.Results:The TLC method showed good specif i city and separation effect. CrocinⅠshowed a good linear relationship (r = 1) in the range of 9.66 – 57.94 μg·mL-1, while crocinⅡ showed a good linear relationship (r = 0.9999) in the range of 5.91 – 35.48 μg·mL-1. Their average recovery rates were 98.4% (RSD = 1.21%, n =9) and 99.4% (RSD = 1.70%, n = 9) respectively.Conclusion:This method was simple, accurate and reproducible, which could be used to control the quality of Tongnaoye.

R917

A

1672 – 8157(2017)05 – 0271 – 04

軍隊(duì)十二五面上項(xiàng)目（14ZJZ06-1）

王東興，男，主管藥師，研究方向：藥品分析與藥品質(zhì)量控制。E-mail：13910864566@139.com

王秀琴，女，副主任藥師，主要從事藥事管理及臨床藥學(xué)工作。E-mail：wangxq69@163.com

2017-04-10

2017-06-06）