鄭蘭蘭　李琛　張璟璇

摘要：考察了擬南芥野生型、hy5、pif4及hy5pif4雙突變體在22 ℃和30 ℃培養(yǎng)下的下胚軸伸長(zhǎng)表型；利用qRT-PCR監(jiān)測(cè)PIF4基因在野生型和hy5突變體30 ℃處理后持續(xù)多個(gè)時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)。結(jié)果表明，HY5通過抑制下游基因PIF4調(diào)控高溫誘導(dǎo)的下胚軸伸長(zhǎng)。PIF4：：GUS啟動(dòng)子融合報(bào)告基因株系的染色結(jié)果表明，高溫對(duì)PIF4轉(zhuǎn)錄水平的誘導(dǎo)主要發(fā)生在子葉而不是下胚軸。通過qRT-PCR檢測(cè)PIF4同源基因PIF5，生長(zhǎng)素合成基因YUC2、YUC3、YUC8和生長(zhǎng)素反應(yīng)基因IAA29在野生型和hy5突變體的動(dòng)態(tài)表達(dá)，HY5通過調(diào)控PIF4介導(dǎo)的生長(zhǎng)素通路來控制擬南芥下胚軸的伸長(zhǎng)反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：擬南芥（Arabidopsis thaliana）；HY5；PIF4；生長(zhǎng)素；高溫；下胚軸

中圖分類號(hào)：Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）18-3554-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.18.041

Abstract： Hypocotyl phenotype of wild type，hy5，pif4 and hy5pif4 were examined under 22 ℃ and 30 ℃. qRT-PCR was performed to compare PIF4 expression dynamics during the time course after heat treatment in wild type and hy5 mutant. The expression level of PIF4 was increased in hy5 mutant，suggesting that HY5 repress PIF4 to regulate hypocotyl elongation. Tissue level analysis of PIF4：：GUS promoter reporter indicates that high temperature induced expression of PIF4 occurred in cotyledon but not hypocotyl. Moreover，PIF4 homolog gene PIF5，auxin synthesis genes YUC2，YUC3，YUC8，and auxin response gene IAA29 were upregulated in hy5 mutant when compare to wild type during the time course after high temperature treatment. These suggest HY5 regulate PIF4 mediated auxin pathway to control hypocotyl elongation under high temperature condition.

Key words： Arabidopsis； HY5； PIF4； auxin； high temperature； hypocotyl

隨著全球環(huán)境溫度的升高，有必要了解和研究植物反應(yīng)和適應(yīng)環(huán)境變化的機(jī)制。光和溫度是植物生長(zhǎng)和發(fā)育中不可或缺的兩類重要的環(huán)境因子。為了應(yīng)對(duì)光和溫度環(huán)境的變化，植物表現(xiàn)出高度的可塑性。下胚軸的伸長(zhǎng)反應(yīng)是植物細(xì)胞伸長(zhǎng)和可塑性的關(guān)鍵表型[1-3]。幼苗的下胚軸在暗培養(yǎng)下顯著伸長(zhǎng)，在光照下伸長(zhǎng)被抑制?；诠?、暗兩種生長(zhǎng)條件下幼苗形態(tài)的差異，通過篩選在暗下保留光形態(tài)建成特征的擬南芥突變體，克隆CONSTITUTIVE PHOTOMORPHOGENIC/DE-ETIOLATED/FUSCA（COP/DET

/FUS）的位點(diǎn)[4，5]。相關(guān)突變體如cop/det/fus突變體在暗培養(yǎng)下都呈現(xiàn)去黃化的表型。這些位點(diǎn)編碼的蛋白大多數(shù)屬于一個(gè)大分子復(fù)合體COP9 signalosome（CSN）的某個(gè)組分[3，6-8]。CSN復(fù)合體調(diào)控光反應(yīng)激活子（通常是轉(zhuǎn)錄因子）的26S蛋白酶介導(dǎo)的降解路徑[7]。通過篩選在光下保留暗形態(tài)建成特征（主要是下胚軸伸長(zhǎng)）的突變體，鑒定了多個(gè)Long hypocotyls（HY1 to HY8）的遺傳位點(diǎn)。它們中有光信號(hào)受體（HY1、HY3/PHYB、HY8/PHYA、HY4/CRY1）以及下游信號(hào)因子（比如HY5）等[8-13]。hy5編碼bZIP轉(zhuǎn)錄因子，是第一個(gè)被克隆的光形態(tài)建成激活子[14]。hy5突變體在光照下有較長(zhǎng)的下胚軸[14]，是研究下胚軸伸長(zhǎng)反應(yīng)的重要遺傳材料。

高溫（30 ℃）可以誘導(dǎo)下胚軸的伸長(zhǎng)[1]，但是生長(zhǎng)素反應(yīng)和極性運(yùn)輸途徑缺失的突變體對(duì)高溫誘導(dǎo)不敏感，而赤霉素（GA）、乙烯等合成缺失的突變體對(duì)高溫誘導(dǎo)效應(yīng)影響不大[1]。外源施加GA合成抑制劑（Paclobutrazol，PAC）和生長(zhǎng)素極性運(yùn)輸劑（1-naphthylphthalamic acid，NPA）都可以抑制高溫誘導(dǎo)的下胚軸伸長(zhǎng)[15]，這表明生長(zhǎng)素參與高溫誘導(dǎo)的下胚軸伸長(zhǎng)。PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4（PIF4）是Phytochrome B信號(hào)通路的負(fù)調(diào)控因子并受高溫迅速誘導(dǎo)[16]。pif4缺失突變體對(duì)高溫不敏感[17]，PIF4介導(dǎo)的依賴于YUCCA8（YUC8）的生長(zhǎng)素合成途徑被發(fā)現(xiàn)是高溫誘導(dǎo)下胚軸伸長(zhǎng)的主要機(jī)制[18-20]，高溫誘導(dǎo)下胚軸伸長(zhǎng)的分子機(jī)制仍有待更深入的研究[21]。針對(duì)轉(zhuǎn)錄因子HY5的全基因組水平的染色質(zhì)免疫共沉淀芯片（CHIP-chip）鑒定出超過3 000個(gè)可能的HY5轉(zhuǎn)錄結(jié)合的下游基因[22]，這其中包括PIF4[22，23]，暗示HY5與PIF4之間存在遺傳互作。endprint

研究突變體在高溫下的表型，發(fā)現(xiàn)hy5突變體下胚軸比野生型伸長(zhǎng)更顯著，而hy5pif4雙突變體的下胚軸伸長(zhǎng)比hy5突變體短。通過qRT-PCR檢測(cè)PIF4基因的表達(dá)水平，PIF4受高溫誘導(dǎo)表達(dá)的程度在hy5突變體中比野生型高。通過對(duì)PIF4：：GUS報(bào)告基因株系組織特異性表達(dá)的研究，發(fā)現(xiàn)溫度誘導(dǎo)的PIF4轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)主要發(fā)生在子葉。PIF4的同源基因PIF5，生長(zhǎng)素合成基因YUC2、YUC3、YUC8以及生長(zhǎng)素反應(yīng)基因IAA29的表達(dá)量在hy5突變體中都比野生型高，表明HY5調(diào)控PIF4介導(dǎo)的生長(zhǎng)素合成和信號(hào)通路。

1 材料與方法

1.1 植物材料與生長(zhǎng)條件

擬南芥野生型Columbia （Col）、hy5 （SALK_05

6405）、pif4（N66043_SAIL_1288_E07）及通過雜交獲得的hy5pif4雙突變體。

擬南芥的種植條件和方法：①種子消毒，用15%漂白水稀釋液浸泡種子15～20 min，而后用無(wú)菌水漂洗3～4次。②消毒后的種子放置于4 ℃冰箱避光處理1～3 d，以實(shí)現(xiàn)低溫誘導(dǎo)種子整齊萌發(fā)。③將種子種在1/2 MS固體培養(yǎng)基，置于光照件下培養(yǎng)。培養(yǎng)溫度為22或30 ℃。

1.2 下胚軸長(zhǎng)度測(cè)量和分析

用相機(jī)拍下對(duì)應(yīng)天數(shù)的幼苗生長(zhǎng)照片，利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）進(jìn)行數(shù)據(jù)測(cè)量。

1.3 qRT-PCR基因表達(dá)分析

樣品取自生長(zhǎng)6 d的幼苗地上部分，包括子葉和下胚軸。RNA的抽提使用的是Tranzol（Transgene，北京全式金生物技術(shù)有限公司），試驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行。qRT-PCR反應(yīng)體系按照SYBR Premix Ex Taq kit（TaKaRa）提供的說明書配制。PCR反應(yīng)在公司的ABI 7500 Real-time PCR system（Applied Biosystems）上進(jìn)行。Elongation Factor 1α（EF1α）作為內(nèi)參。引物序列見表1。

1.4 質(zhì)?？寺『椭参镛D(zhuǎn)化

PIF4：：GUS是PIF4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因?yàn)镚US的轉(zhuǎn)基因植株。啟動(dòng)子選擇的區(qū)段為起始密碼子ATG往上選取至上游基因?yàn)橹沟?.8 kb序列，然后克隆到融合GUS報(bào)告基因的pGreenII-0229雙元載體上。引物序列見表1。擬南芥的轉(zhuǎn)化采用花序浸染法[24，25]。

1.5 GUS染色和強(qiáng)度分析

染色分析參考文獻(xiàn)[26]。將待測(cè)試材料浸泡在GUS染液里，37 ℃培養(yǎng)，直到充分染色即可。利用ImageJ（http：//rsb.info.nih.gov/ij/）進(jìn)行GUS染色強(qiáng)度的定量分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體在20 ℃和30 ℃的下胚軸表型

在20 ℃光照培養(yǎng)條件下，hy5突變體下胚軸比野生型長(zhǎng)[14]，而pif4下胚軸比野生型稍短[17]（圖1）。hy5pif4雙突變體表型分析發(fā)現(xiàn)雙突變體的下胚軸長(zhǎng)度介于兩個(gè)親本之間，即雙突下胚軸比hy5短，表明PIF4基因有可能位于hy5的下游。

在30 ℃光照培養(yǎng)條件下，所有材料的下胚軸都比20 ℃時(shí)長(zhǎng)，但是hy5相比野生型伸長(zhǎng)更為顯著，而hy5pif4雙突變體對(duì)高溫誘導(dǎo)反應(yīng)的敏感度降低（圖1）。表明HY5是高溫誘導(dǎo)下胚軸伸長(zhǎng)的抑制因子，而它的抑制作用一定程度上是通過PIF4作用的。

2.2 PIF4和YUC8基因表達(dá)水平的檢測(cè)

突變體表型分析表明PIF4位于hy5的下游。檢測(cè)PIF4基因在野生型和hy5突變體受高溫誘導(dǎo)后不同時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。結(jié)果表明，在野生型里PIF4的表達(dá)量被高溫持續(xù)誘導(dǎo)，但在hy5突變體里PIF4在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量都比野生型高（圖2），表明HY5是PIF4的轉(zhuǎn)錄抑制因子。

PIF4依賴的YUC8表達(dá)水平升高和生長(zhǎng)素合成的增加是高溫誘導(dǎo)下胚軸伸長(zhǎng)的一個(gè)重要分子機(jī)制[19]，檢測(cè)YUC8在高溫誘導(dǎo)中的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況。與PIF4一致，YUC8在hy5突變體里的表達(dá)持續(xù)高于同時(shí)間點(diǎn)處理的野生型（圖2）。結(jié)果表明，HY5通過影響PIF4基因依賴的YUC8表達(dá)和生長(zhǎng)素合成調(diào)控下胚軸的高溫誘導(dǎo)伸長(zhǎng)反應(yīng)。

2.3 PIF4：：GUS啟動(dòng)子融合株系在高溫誘導(dǎo)中的表達(dá)模式分析

PIF4是關(guān)鍵的高溫誘導(dǎo)促進(jìn)因子[17，19，20]，但是其在高溫誘導(dǎo)過程中的表達(dá)模式并不清楚。因此，構(gòu)建了PIF4：：GUS啟動(dòng)子融合報(bào)告基因株系，并觀察了在高溫誘導(dǎo)過程中GUS表達(dá)的強(qiáng)度變化（圖3）。高溫誘導(dǎo)4 h后，子葉的GUS染色強(qiáng)度開始顯著增強(qiáng)，并保持持續(xù)增強(qiáng)的趨勢(shì)，而下胚軸的GUS染色強(qiáng)度沒有顯著改變（圖3）。結(jié)果表明，高溫誘導(dǎo)的PIF4轉(zhuǎn)錄水平累積主要集中在下胚軸。

2.4 生長(zhǎng)素合成及響應(yīng)基因的表達(dá)變化

根據(jù)已發(fā)表的CHIP-chip結(jié)果[22]，PIF4及同源基因PIF5是可能的hy5下游基因。同時(shí)，下胚軸的伸長(zhǎng)與PIF4調(diào)控的生長(zhǎng)素合成途徑如YUC8及其同源基因YUC2和YUC3相關(guān)[27]。生長(zhǎng)素反應(yīng)因子如IAA29的表達(dá)水平反映體內(nèi)生長(zhǎng)素的分布情況。IAA29的表達(dá)也被高溫誘導(dǎo)[17]?；诖?，檢測(cè)了這些基因在高溫誘導(dǎo)過程中的表達(dá)變化，發(fā)現(xiàn)它們的表達(dá)在hy5突變體里持續(xù)升高（圖4）。

3 討論

PIF4調(diào)控高溫對(duì)下胚軸伸長(zhǎng)的誘導(dǎo)反應(yīng)主要是通過影響生長(zhǎng)素的合成和響應(yīng)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)的[19]。HY5是光形態(tài)建成的重要促進(jìn)因子，但其在高溫誘導(dǎo)下胚軸伸長(zhǎng)過程中的調(diào)控機(jī)理研究并不多。PIF4是假定的hy5下游靶基因[22]。

結(jié)果表明，HY5是擬南芥響應(yīng)光和溫度的共同調(diào)控因子。HY5位于PIF4介導(dǎo)的生長(zhǎng)素調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的上游。有研究通過正向遺傳學(xué)的方法篩選對(duì)高溫誘導(dǎo)不敏感的突變體鑒定了DE-ETIOLATED 1（DET1）的等位突變體okapi1，通過同樣的遺傳雜交分析等手段證明光和高溫都通過DET1-COP1-HY5途徑調(diào)控PIF4[28]。endprint