郝志怡

摘要：試驗用單層法和同步法2種方法，用不同細胞密度及稀釋體系對同種口蹄疫病毒的毒價進行了測定。結(jié)果表明，細胞密度對口蹄疫病毒毒價的測定沒有直接影響，而病毒稀釋體系越大，結(jié)果越穩(wěn)定，測得的毒價越高，且纖維細胞較倉鼠腎細胞對口蹄疫病毒更為敏感。

關(guān)鍵詞：口蹄疫；細胞；病毒毒價；滴定

中圖分類號：S855.3 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2017）010-0009-02

口蹄疫病毒屬小RNA病毒科口蹄疫病毒屬，是RNA病毒中最小的一個，也是最早能在組織上培養(yǎng)的病毒之一。與其他小RNA病毒相似，口蹄疫病毒在感染4～6 h后，形成的感染性病毒粒子會導(dǎo)致細胞病變。在體外試驗中，通過細胞培養(yǎng)和接種殺細胞性病毒，一段時間后用顯微鏡可觀察到細胞變圓，壞死，從瓶壁脫落等現(xiàn)象，稱之細胞病變作用。利用此種病變效應(yīng)可進行病毒定量。

目前，一般用滴定法測定口蹄疫滅活疫苗的毒價。在檢驗疫苗效力時，常用細胞微量中和試驗來檢測免疫動物體內(nèi)抗體效價的高低，從而判定疫苗效果。其中，病毒毒價的準確性是中和試驗成敗的關(guān)鍵。本試驗用2種不同方法對TCID50滴定試驗中細胞密度、病毒稀釋體系2種因素進行研究，進一步確認這些因素對口蹄疫病毒TCID50的測定是否有影響，以獲得準確、穩(wěn)定的口蹄疫病毒毒價測定方法，為今后的試驗提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM培養(yǎng)基，pH 7.2的PBS緩沖液，0.25%胰酶-EDTA，小牛血清，滴定用口蹄疫病毒。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 從液氮罐中取出含BHK-21細胞（倉鼠腎細胞）或纖維細胞的冷凍管，37 ℃水浴1 min使其完全融化，取出細胞；將細胞接種到110 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加適量培養(yǎng)液及小牛血清，接種濃度1×109個/L，置37 ℃恒溫箱靜置培養(yǎng)，次日更換培養(yǎng)液，觀察生長情況。48 h后棄除舊培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗2遍，加入2 mL胰酶消化液消化2 min左右，可看到細胞像沙子一樣脫落，加10 mL含 6%的小牛血清培養(yǎng)液終止消化，用吸管吹吸細胞，制成細胞懸液，再加適量含 6%的小牛血清培養(yǎng)液，調(diào)整細胞濃度，繼續(xù)培養(yǎng)，連續(xù)傳代。

1.2.2 細胞計數(shù) 取0.1 mL細胞懸液，加到細胞計數(shù)板的蓋玻片下，顯微鏡下40倍觀察計數(shù)。當活細胞數(shù)大于95%，用含6%牛血清DMEM培養(yǎng)液將細胞稀釋成所需濃度。

1.2.3 單層法

（1）取生長良好的細胞，依細胞傳代方法，制備細胞懸浮液，用6%的DMEM調(diào)整細胞濃度，以1.5×105個/mL和3.2×105個/mL加入到96 孔微量培養(yǎng)板。每孔100 μL（1.5×104個/孔、3.2×104個/孔）。

（2）將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，溫度（36±2） ℃， 培養(yǎng)18～24 h。經(jīng)過24 h后有70%～90%細胞融合，進行單層滴定。

（3）取出樣品和滴定用口蹄疫病毒，完全解凍后，振蕩樣品2～5 s，用移液器吸取0.2 mL或0.5 mL樣品到第一只試管中，振蕩后轉(zhuǎn)移0.2 mL或0.5 mL到下一管中，以此類推，直到最后一個稀釋度。

（4）取出96孔板細胞，標記樣品批號和稀釋度，棄掉細胞培養(yǎng)液。由最稀到最濃的稀釋度順序接種，每個稀釋度接種8孔，每孔100 μL，每個稀釋度需更換槍頭。將96孔板放入（36±2） ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5～6 d，直到最后判定結(jié)果。

1.2.4 同步法 方法同“1.2.3”，區(qū)別是將培養(yǎng)板置于CO2培養(yǎng)箱，溫度（36±2） ℃， 靜置30～60 min，待細胞沉降吸附在細胞板上后進行同步滴定。

2 結(jié)果與分析

單層法（纖維細胞）試驗中當細胞密度為3.2×105個/mL時，病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為106.375TCID50/mL；病毒稀釋體系2.0 mL時測得的口蹄疫病毒毒價為105.375TCID50/mL。當細胞密度為1.5×105個/mL時，病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為106.375TCID50/mL；病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為105.5TCID50/mL。

同步法（倉鼠腎細胞）試驗中當細胞密度為3.2×105個/mL時，病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為105.625TCID50/mL；病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為104.875TCID50/mL。當細胞密度為1.5×105個/mL時，病毒稀釋體系5.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為105.25TCID50/mL；病毒稀釋體系2.0 mL測得的口蹄疫病毒毒價為104.875TCID50/mL。

3 討論

試驗中常用平行試驗來減少誤差，保證測定結(jié)果的準確性，不同細胞對口蹄疫病毒的吸附能力不同，而病毒稀釋體系的大小也會影響測定結(jié)果。本試驗用單層法和同步法2種方法，通過用不同細胞密度及稀釋體系對同種口蹄疫病毒的毒價進行測定，結(jié)果顯示，細胞密度對口蹄疫病毒毒價的測定沒有直接影響，而病毒稀釋體系越大，結(jié)果越穩(wěn)定，測得的毒價越高，且纖維細胞較倉鼠腎細胞對口蹄疫病毒更為敏感。這一結(jié)果為以后的中和試驗提供了依據(jù)，也為測定口蹄疫疫苗抗體效價奠定了基礎(chǔ)。endprint