張藝凡，王悅△，劉磊，李晶晶，鄧林紅△

（1.常州大學(xué)生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院暨常州市呼吸醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，常州213164；2.常州大學(xué) 制藥與生命科學(xué)學(xué)院／護(hù)理學(xué)院，常州213164）

1 引 言

哮喘主要病理特征表現(xiàn)為氣道炎癥、氣道重構(gòu)及氣道高反應(yīng)性，氣道平滑肌細(xì)胞（ASMC）是參與氣道高反應(yīng)（AHR）的主要細(xì)胞類型［1］，舒張氣道平滑肌，減輕氣道狹窄是目前治療哮喘的主要方法。但治療哮喘的藥物存在心動(dòng)過速，骨質(zhì)疏松等諸多不良反應(yīng)，價(jià)格也相對(duì)昂貴，因此有必要尋找既經(jīng)濟(jì)又有效的治療哮喘藥物，如中草藥。近年來研究發(fā)現(xiàn)，在氣道平滑肌上存在苦味受體（Bitter taste receptors，TAS2Rs），當(dāng)苦味物質(zhì)如糖精和氯喹等與TAS2Rs結(jié)合后能舒張 ASMC，改善 AHR癥狀［2］，其支氣管舒張效果甚至強(qiáng)于已用于臨床的β2受體激動(dòng)劑［3－4］。青蒿琥酯是著名的抗瘧藥青蒿素的衍生物，也是廣為人知的苦味物質(zhì)，可抑制小鼠哮喘模型的氣道炎癥［5］，但其是否對(duì)氣道阻力及平滑肌的牽張力有影響未見報(bào)道。本研究建立了小鼠哮喘動(dòng)物模型，在體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了青蒿琥酯對(duì)小鼠氣道阻力和氣道平滑肌牽張力的效應(yīng)，并初步探討了效應(yīng)機(jī)制。

2 材料和方法

2.1 試劑與動(dòng)物

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6～8周齡雌性Balb／c小鼠，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)SCXK（蘇）－2016－0010。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及材料 青蒿琥酯，Ι型膠原（Sigma－Aldrich）；DMEM培養(yǎng)基，胎牛血清，雙抗（Gibco）；其余試劑從Fisher Scientific獲得；倒置顯微鏡（NIKON）；LSM710激光共聚焦掃描顯微鏡（Carl Zeiss）；FV－FX1.3小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀（SCIREQ）。

2.2 OVA誘導(dǎo)BALB／c小鼠急性哮喘模型

BALB／c小鼠在第1、8 d腹腔注射200μL含氫氧化鋁干粉（2%）和OVA（0.02%）致敏劑，每天用50 mg／ml的OVA激發(fā)20 min，持續(xù)2周；對(duì)照組以生理鹽水代替致敏劑［6］。所有實(shí)驗(yàn)組均在末次激發(fā)結(jié)束24 h之后，進(jìn)行肺功能及相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。

2.3 哮喘模型小鼠肺組織病理學(xué)檢測(cè)

將哮喘模型小鼠右肺取出，4%福爾馬林浸泡過夜，并在分級(jí)系列乙醇溶液中脫水。經(jīng)包埋，切片，展片，HE染色后光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行形態(tài)分析。收集小鼠支氣管肺泡灌洗液（BALF）進(jìn)行炎癥細(xì)胞分類及總細(xì)胞的計(jì)數(shù)。

2.4 小鼠氣道阻力的測(cè)定

小鼠麻醉狀態(tài)下進(jìn)行氣管插管手術(shù)，用侵入式的FlexiVent小動(dòng)物肺功能檢測(cè)儀檢測(cè)正常組和OVA組小鼠在乙酰甲膽堿（Mch）激發(fā)下氣道阻力的變化。小鼠霧化吸入 0、2、8、32、64、128 mg／ml的Mch，當(dāng)氣道阻力達(dá)到基線4～5倍時(shí)，再分別霧化吸入青蒿琥酯（30，60，120μg），沙丁胺醇（3μg）和鹽酸奎寧（150μg），通過肺功能檢測(cè)儀每30 s測(cè)量一次氣道阻力，持續(xù) 5 min［7］。

2.5 小鼠原代氣道平滑肌細(xì)胞的分離培養(yǎng)

解剖BALB／c小鼠取出肺葉組織，用無菌器械從外膜表面分離結(jié)締組織，上皮層，纖維層及粘膜層組織，縱向剖開支氣管，去除內(nèi)膜后剪成1 mm2組織塊，移至培養(yǎng)瓶中倒置6～8 h后加入適量培養(yǎng)基，待細(xì)胞爬出后生長約至90%時(shí)進(jìn)行傳代，純化，鑒定［8］。

2.6 小鼠氣道平滑肌細(xì)胞牽張力的測(cè)定

使用傅里葉變換牽引力顯微術(shù)（fourier transform tractionmicroscopy，F(xiàn)TTC）來量化ASMC的牽張力。將ASMC（2000個(gè)／皿）接種到涂有 I型膠原（0.1 mg／m l）的聚丙烯酰胺凝膠培養(yǎng)皿上培養(yǎng)24 h后，更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。通過相差顯微鏡和熒光顯微鏡分別記錄單個(gè)細(xì)胞和熒光微珠標(biāo)記物的對(duì)照?qǐng)D像，且每隔30 s采集一次微珠位置的熒光圖像［9］。

2.7 小鼠氣道平滑肌細(xì)胞的胞內(nèi)鈣離子濃度測(cè)定

將小鼠ASMC接種到共聚焦玻璃皿底中（10000個(gè)／皿），貼壁后加入5μM膜滲透性［Ca2＋］i敏感熒光染料Fluo－4乙酰氧基甲基酯（Fluo－4AM）Ca2＋指示劑，孵育60 min。用 Tyrode溶液洗滌細(xì)胞3次后再孵育20 min使細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)完全脫脂。將激發(fā)波長設(shè)定為488 nm，發(fā)射波長設(shè)定為＞505 nm進(jìn)行熒光測(cè)量［10］。以刺激前細(xì)胞內(nèi)［Ca2＋］i為基線，測(cè)定時(shí)間為20 s，再在共聚焦專用皿中分別加入各種不同濃度（0，0.375，0.75 mM）青蒿琥酯，觀察并記錄加入藥物后熒光強(qiáng)度瞬間動(dòng)態(tài)變化。

2.8 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±SD）表示，采用Origin 7.5進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組組間組內(nèi)的差異比較均用單因素方差分析，以P＜0.05作為顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)果

3.1 OVA誘導(dǎo)BALB／c小鼠哮喘模型的鑒定

正常組小鼠的肺組織中可以清楚看到開放的氣道腔，少量炎癥細(xì)胞浸潤（見圖1A）；OVA組小鼠的肺切片出現(xiàn)明顯的組織重構(gòu)，包括平滑肌明顯增厚，支氣管（Br）和血管周圍的嗜酸性細(xì)胞聚集（見圖1B）。OVA組小鼠肺泡灌洗液（BALF）中炎癥細(xì)胞總數(shù)及嗜酸性細(xì)胞均顯著增加，呈過敏性哮喘典型的嗜酸性氣道炎癥（見圖1C，Eos：嗜酸性細(xì)胞；Neu：中性粒細(xì)胞；Lym：淋巴細(xì)胞；Mac：巨噬細(xì)胞）。

圖1 正常組和OVA組Balb／c小鼠的肺組織病理學(xué)鑒定（A－B.bar＝100μm；n＝4，**P＜0.01；*P＜0.05）Fig 1 Characterization of lung histopathology of normal and OVA－treated Balb／c mice

3.2 OVA致敏小鼠氣道阻力的測(cè)定

如圖2所示，Mch誘導(dǎo)的小鼠氣道阻力增加呈現(xiàn)劑量依賴性，OVA組小鼠的響應(yīng)程度大于正常組，在OVA組和正常組小鼠中最大支氣管收縮達(dá)到基線的4～5倍時(shí)Mch劑量分別為64，128 mg／mL。這些結(jié)果同樣證實(shí)OVA組小鼠顯示過敏性哮喘表型的標(biāo)志，因此適合于評(píng)價(jià)青蒿琥酯的支氣管擴(kuò)張功效的研究。

圖2 正常組和OVA組小鼠氣道阻力的比較 （n＝4，*P＜0.05）Fig 2 Com parison of airway resistance of normal and OVA－treated Balb／c mice

3.3 青蒿琥酯對(duì)小鼠氣道阻力的影響

支氣管擴(kuò)張劑沙丁胺醇，苦味受體激動(dòng)劑奎寧鹽酸鹽能有效地將氣道阻力減少約50%，青蒿琥酯劑量從30μg增加到120μg時(shí)，正常組和OVA組小鼠氣道阻力逐漸降低。120μg青蒿琥酯使正常組小鼠氣道阻力從431.43±85.67%降至242.34±11.1%，OVA組小鼠氣道阻力從506.84±40.33%降至273.964±17.98%。青蒿琥酯（120μg）的支氣管擴(kuò)張的功效與沙丁胺醇（3μg）相當(dāng)。

圖3 青蒿琥酯對(duì)正常組和OVA組小鼠氣道阻力的影響（n＝5；**P＜0.01）Fig 3 Effect of artesunate on airway resistance of normal or OVA－treated mice

3.4 氣道平滑肌細(xì)胞的鑒定

如圖4所示，形態(tài)學(xué)上單個(gè)細(xì)胞呈梭形狀，細(xì)胞群呈現(xiàn)典型的“峰－谷”形態(tài)（圖4A），細(xì)胞骨架相對(duì)連續(xù)且具有一定的方向性（圖4B），α－actin免疫細(xì)胞免疫熒光鑒定結(jié)果顯示細(xì)胞的應(yīng)力纖維呈絲狀，90%以上的細(xì)胞為平滑肌細(xì)胞（圖4C，D）。

3.5 青蒿琥酯對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞牽張力的效應(yīng)

圖5A－C分別是粘附在涂覆有I型膠原的聚丙烯酰胺凝膠表面的單細(xì)胞相差圖，熒光微珠圖，以及使用傅立葉變換牽引技術(shù)（FTTC）從位移場(chǎng)中計(jì)算出的牽引場(chǎng)和相應(yīng)的牽引力分布圖。從表1可知，ASMC牽張力隨著青蒿琥酯濃度增加而逐漸降低。

表1 青蒿琥酯濃度對(duì)ASMC牽張力的影響（n＝4）Table 1 Effect of concentration of artesunate on traction force generated by the cultured ASM cells

圖4 體外培養(yǎng)Balb／c小鼠平滑肌細(xì)胞的鑒定A.原代培養(yǎng)（×20）；B.F－actin骨架染色（×63，油鏡）；C－D.α－actin免疫細(xì)胞免疫熒光（C：×20；D：×63，油鏡）Fig 4 Characterization of the culture ASM cells from Balb／c mice

圖5 青蒿琥酯對(duì)ASMC牽張力的效應(yīng)（n＝4）Fig 5 Effect of artesunate on traction force generated by the cultured ASM cells

3.6 青蒿琥酯對(duì)氣道平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)鈣離子濃度的影響

圖6A表示在0.75 mM鹽酸奎寧處理前后的代表性細(xì)胞熒光圖像，胞內(nèi)鈣熒光強(qiáng)度在0～75 s內(nèi)先增強(qiáng)后減弱。但0.75 mM青蒿琥酯處理后，在0～120 s內(nèi)熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，并且到150 s時(shí)一直維持在較高的水平。ASMC瞬態(tài)胞內(nèi)［Ca2＋］i以及峰值均以劑量依賴性方式響應(yīng)青蒿琥酯（見圖6C－D）。

圖6 青蒿琥酯激發(fā)Balb／c小鼠氣道平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)［Ca2＋］i變化A.加入0.75 mM奎寧后胞內(nèi)［Ca2＋］i隨時(shí)間變化的圖像；B.加入0.75 mM青蒿琥酯后胞內(nèi)［Ca2＋］i隨時(shí)間變化的圖像；C.不同濃度青蒿琥酯作用于ASMC胞內(nèi)［Ca2＋］i瞬態(tài)變化；D.不同濃度青蒿琥酯在150 s時(shí)的［Ca2＋］i值.F0.胞內(nèi)［Ca2＋］i的基底值；F.給藥后胞內(nèi)［Ca2＋］i的實(shí)時(shí)值.n＝4，**p＜0.01）Fig 6 Artesunate evoked［Ca2＋］i flux in ASM cells from Balb／c mice

4 討論

氣道高反應(yīng)性是指因炎癥氣道出現(xiàn)過度敏感及過強(qiáng)的氣道平滑肌收縮反應(yīng)，引起氣道狹窄和氣道阻力增加，從而引發(fā)咳嗽、呼吸困難、喘息等癥狀。氣道平滑肌的生物力學(xué)性質(zhì)在哮喘氣道高反應(yīng)和氣道狹窄中起了決定性的作用［11］，因此有效舒張氣道平滑肌，降低氣道阻力是治療哮喘的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)選用眾所周知的苦味物質(zhì)青蒿琥酯進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其能使哮喘模型小鼠ASMC牽張力下降，從而舒張氣道，降低氣道阻力。

本研究表明，青蒿琥酯對(duì)小鼠氣道阻力和ASMC的舒張程度呈現(xiàn)劑量依賴性。小鼠正常組和OVA哮喘模型組霧化吸入青蒿琥酯均可使Mch誘導(dǎo)的氣道阻力得到有效緩解，且呈劑量依賴性。當(dāng)青蒿琥酯劑量達(dá)到120μg，降低哮喘組小鼠氣道阻力的程度相當(dāng)于3μg沙丁胺醇（常規(guī)哮喘治療）的效果。我們還使用傅里葉變換牽張力顯微術(shù)（FTTC）來量化ASMC產(chǎn)生牽張力的能力。FTTC是近來被廣泛用于測(cè)定ASMC在受到收縮劑（組胺）或舒張劑（異丙腎上腺素）刺激時(shí)收縮／舒張效應(yīng)的技術(shù)方法［9］。FTTC研究結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)的ASMC牽張力隨著青蒿琥酯濃度（0，0.375，0.75 mM）的增加而逐漸降低。有研究報(bào)道苦味物質(zhì)鹽酸奎寧作為苦味受體激動(dòng)劑能以劑量依賴方式降低ASMC產(chǎn)生的細(xì)胞牽張力，這可能是與 ASMC中表達(dá)的TAS2R靶向結(jié)合產(chǎn)生的舒張效應(yīng)［3，12］。據(jù)調(diào)查，用于實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的苦味受體激動(dòng)劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)式是相似的，都有氧，羰基和羥基官能團(tuán)，且含有多個(gè)環(huán)，比如糖精和鹽酸奎寧都能在不同程度降低小鼠的氣道阻力，減小 ASMC牽引力，增加 ASMC的［Ca2＋］i應(yīng)答。據(jù)此，苦味物質(zhì)青蒿琥酯很可能也是靶向結(jié)合苦味受體產(chǎn)生了對(duì)氣道平滑肌的舒張作用。本研究中所用青蒿琥酯的劑量達(dá)到120μg，可能與目前采用的青蒿琥酯生物活性較低、苦味受體對(duì)青蒿琥酯的敏感性差等原因有關(guān)，將來需采用改進(jìn)劑型、藥物分子修飾等方法增強(qiáng)青蒿琥酯的活性、以及增強(qiáng)其與苦味受體的相互作用等進(jìn)一步改善青蒿琥酯對(duì)哮喘的治療作用。

本研究通過激光共聚焦掃描顯微鏡觀察到青蒿琥酯濃度從0.25 mM增加到1.0 mM時(shí)誘導(dǎo)ASMC中［Ca2＋］i增加，青蒿琥酯的［Ca2＋］i響應(yīng)趨勢(shì)與已知苦味受體激動(dòng)劑鹽酸奎寧，糖精和柚皮苷的一致［3，13］。TAS2R激動(dòng)劑如鹽酸奎寧是通過細(xì)胞膜介導(dǎo)的局部［Ca2＋］i響應(yīng)，激活大電導(dǎo)鈣離子依賴的K＋（BKCa）通道，從而導(dǎo)致膜超極化和ASMC的舒張［3，14－17］?；谶@些苦味物質(zhì)之間的相似性，青蒿琥酯誘導(dǎo)的ASMC舒張效應(yīng)也可能同樣是由于細(xì)胞膜超極化使得局部［Ca2＋］i反應(yīng)而導(dǎo)致的，這種潛在機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究證明。