曹爽，張巖，馬任，張順起，殷濤，劉志朋

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所，天津300192）

1 引 言

美國癌癥研究協(xié)會(huì)2017年癌癥進(jìn)展報(bào)告表明，癌癥已成為世界范圍內(nèi)致死率第二位的公共衛(wèi)生問題。每年大約170萬人新被診斷為癌癥，有約60萬人因?yàn)榘┌Y去世［1］。研究表明，癌癥早期治愈率高達(dá)百分之八十［2］，為了對癌癥患者進(jìn)行早期干預(yù)治療，提高長期生存率，癌癥的早期診斷和篩查成為醫(yī)學(xué)上亟需解決的問題。生物組織的電導(dǎo)率和介電常數(shù)作為與頻率相關(guān)的電特性，隨生物組織生理、病理狀態(tài)的變化而變化。已有臨床醫(yī)學(xué)研究表明，在癌變的早期階段，電特性變化早于其結(jié)構(gòu)變化［3］。因此，根據(jù)生物組織的電特性診斷早期癌癥具有可行性［4］。

目前，生物組織電特性測量的研究多數(shù)來自于離體生物組織的直接測量和在體組織電特性成像［4-7］。其中，離體生物組織的電特性數(shù)據(jù)，由于組織含水量發(fā)生了變化，與在體的真實(shí)電特性存在一定的偏差［8］。因此，建立生物組織（腫瘤組織和正常組織）在體的電特性數(shù)據(jù)庫對癌癥早期檢測和組織電特性成像尤其重要。對于生物組織電特性數(shù)據(jù)的在體測量來說，探頭的尺寸是影響測量實(shí)施的一個(gè)重要因素。傳統(tǒng)的組織電特性測量探頭尺寸較大，較難實(shí)現(xiàn)在體測量。本研究采用自制的小尺寸探頭對生物組織（乳腺癌組織和正常組織）的電導(dǎo)率及介電常數(shù)進(jìn)行在體測量（頻率范圍：0.5～5 MHz），并且對腫瘤不同發(fā)展階段的電特性數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 材料與方法

2.1 自制探頭參數(shù)

本研究采用自制的小尺寸探頭，探頭的尖端測量圓環(huán)直徑為1 mm，與被測生物組織的接觸體積僅為0.25πmm3。探頭分為測量電極、保護(hù)電極和電極支架三個(gè)部分，結(jié)構(gòu)見圖1。其中，電極（測量電極、保護(hù)電極）和電極支架均采用生物相容性良好的材料。電極板厚度約為0.5 mm，寬度為10 mm，兩測量電極板平行相對。其中，保護(hù)電極為內(nèi)徑0.51 mm，外徑1 mm的圓環(huán)，與被保護(hù)電極處于同一個(gè)電極板平面，在測量中可以消除畸變電場。

2.2 裸鼠乳腺癌模型

40只BLAC/c裸鼠，雌性，4～6周齡，體重16±1 g，在SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)一周。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在含有10%的胎牛血清和1%的抗生素中培養(yǎng)。癌細(xì)胞培養(yǎng)至濃度為1×106/mL時(shí)，注射入裸鼠右側(cè)第二對乳腺脂肪墊內(nèi)。將種植有乳腺癌的裸鼠飼養(yǎng)在SPF級的飼養(yǎng)盒中，每天觀察記錄裸鼠生命體征，分別于種植后7、14、21、28 d隨機(jī)選取10只裸鼠進(jìn)行電特性測量，分別按腫瘤生長時(shí)間依次標(biāo)記為 A、B、C、D四組（A組：7d；B組：14d；C組：21d；D組：28d）。全部實(shí)驗(yàn)完成后，處死裸鼠。

2.3 電導(dǎo)率及介電常數(shù)的測量步驟

測量前，測量記錄裸鼠體溫、體重。裸鼠腫瘤尺寸、形狀等信息由醫(yī)用超聲儀器進(jìn)行檢測，測量示意見圖2a。根據(jù)醫(yī)用超聲結(jié)果，在腫瘤表面沿2只乳腺所在直線標(biāo)記測量點(diǎn)，每隔2 mm標(biāo)記一個(gè)點(diǎn)，測量點(diǎn)標(biāo)記示意見圖2b。在醫(yī)用超聲的指引下，采用小尺寸探頭逐點(diǎn)測量裸鼠腫瘤的電特性，探頭測量示意見圖2c。自制探頭另一端連接阻抗分析儀（安捷倫4294A），測量頻率為0.5～5 MHz，測量前對阻抗分析儀及小尺寸探頭進(jìn)行校準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)液選用甲醇、乙醇及飽和NaCl溶液［9］。為了區(qū)分癌癥組織及正常組織，本研究對裸鼠肌肉組織、肝臟組織、脂肪組織進(jìn)行了在體測量。同時(shí)，本研究對離體2 h的腫瘤組織和脂肪組織進(jìn)行了測量。

2.4 組織病理學(xué)檢測

對每組乳腺癌組織進(jìn)行病理學(xué)檢測，確定腫瘤內(nèi)癌細(xì)胞發(fā)展情況。本研究選取裸鼠腫瘤的測量點(diǎn)所在縱向剖面進(jìn)行病理學(xué)檢測。

圖1 微型探頭的結(jié)構(gòu)圖示Fig 1 The structure of the microscope

圖2 電導(dǎo)率及介電常數(shù)測量示意圖a.超聲測量；b.腫瘤測量點(diǎn)標(biāo)記；c.小尺寸探頭測量腫瘤電特性Fig 2 Measurements of conductivity and permittivity a.Measurements of the ultrasound；b.Mark the cancer measure points c.EPs measurements of cancer using the microprobe

3 結(jié)果

3.1 裸鼠體重及體溫信息

40只長有乳腺癌腫瘤的裸鼠在生長過程中的體重及體溫變化見圖3。在癌癥發(fā)展過程的前三周（A、B、C組），裸鼠體重逐漸上升，在第四周（D組）體重下降；裸鼠體溫逐漸下降。

圖3 裸鼠體重及體溫變化（7～28 d）a.體重；b.體溫Fig 3 Body weight and temperature changes of mice（7～28 days）a.Body weight；b.Temperature

3.2 超聲檢測結(jié)果

四組超聲檢測的腫瘤尺寸見表1，腫瘤尺寸變化見圖4，尺寸數(shù)據(jù)由±s標(biāo)記（x為平均值，s為標(biāo)準(zhǔn)差）。其中，腫瘤尺寸由其長軸長度×短軸長度（正面、側(cè)面取平均值）標(biāo)記。在癌癥發(fā)展的過程中，腫瘤尺寸逐漸增大，前三周（A、B、C組）增速接近一致，從第四周開始，腫瘤尺寸增長速度變慢。

表1 腫瘤尺寸（±s）Table 1 Size of the tumors（±s）

表1 腫瘤尺寸（±s）Table 1 Size of the tumors（±s）

組別 長軸/mm 短軸/mm A 15.77±3.81 6.84±1.37 B 24.54±4.13 12.59±1.95 C 29.34±2.38 18.33±2.91 D 31.03±2.80 18.96±2.53

圖4 癌癥發(fā)展過程中腫瘤尺寸變化Fig 4 Tumor size changes during cancer progression

3.3 腫瘤在體-離體電特性結(jié)果

40只裸鼠乳腺腫瘤組織和脂肪組織在體、離體（2 h）電導(dǎo)率及介電常數(shù)的對比分別見圖5a、圖5b。腫瘤組織的在體與離體數(shù)據(jù)存在顯著差異（P＜0.01）；脂肪組織的在體與離體數(shù)據(jù)無差異性（圖中曲線近似重合）。

圖5 腫瘤組織和脂肪組織在體-離體電特性a.電導(dǎo)率；b.介電常數(shù)Fig 5 EPs of tumors and fats（in-vivo vs.ex-vivo）a.Conductivity；b.Permittivity

3.4 腫瘤組織與正常組織電特性結(jié)果

40只裸鼠乳腺腫瘤組織、脂肪組織、肌肉組織在頻率0.5、1、5 MHz處電導(dǎo)率及介電常數(shù)的對比分別見圖6a、圖6b。在所選取的三個(gè)特征頻率點(diǎn)處，癌癥組織的電導(dǎo)率、介電常數(shù)與肌肉組織的電導(dǎo)率、介電常數(shù)存在顯著差異（P＜0.01）；癌癥組織的電導(dǎo)率、介電常數(shù)與脂肪組織的電導(dǎo)率、介電常數(shù)存在顯著差異（P＜0.01）；肌肉組織與脂肪組織差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖6 腫瘤組織與脂肪組織、肌肉組織電特性對比（0.5、1、5 MHz）a.電導(dǎo)率；b.介電常數(shù)Fig 6 EPs comparison of tumor with adipose and muscle tissues（0.5、1、5 MHz）a.Conductivity；b.Permittivity

3.5 腫瘤發(fā)展過程中電特性變化結(jié)果

40只裸鼠種植乳腺癌腫瘤后放在相同環(huán)境（SPF級）中飼養(yǎng)，在腫瘤種植后的第7 d，隨機(jī)選取10只，進(jìn)行乳腺腫瘤的電特性測量，標(biāo)記為A組；隨后每隔7 d隨機(jī)選取10只進(jìn)行一次測量，分別標(biāo)記為 B、C、D組（14d-B組；21d-C組；28d-D組）。A-D組裸鼠乳腺癌電特性對比見圖7。在腫瘤發(fā)展的第1～4周，腫瘤的電導(dǎo)率及介電常數(shù)逐漸增大，增速逐漸變慢。腫瘤組織的電導(dǎo)率和介電常數(shù)在早期，即1～2周增長迅速，成倍數(shù)增長，第3～4周則增長緩慢。

3.6 病理結(jié)果

對40只裸鼠乳腺癌組織病理學(xué)分析。在乳腺癌發(fā)展的第1～4周（A-D組）中每周選取2只裸鼠做病理切片。每周乳腺癌組織的病理結(jié)果見圖8。在裸鼠乳腺癌發(fā)展的第1周（W1），腫瘤界限清楚，腫瘤細(xì)胞不規(guī)則，切片區(qū)域可見中性粒細(xì)胞；第2周（W2），腫瘤部分界限清楚，腫瘤細(xì)胞不規(guī)則、梭形，彌漫生長，腫瘤內(nèi)可見稀疏血管；第3周（W3），腫瘤界限不清楚，切片區(qū)域可見壞死區(qū)，腫瘤內(nèi)可見較多不規(guī)則血管，切片區(qū)域可見腫瘤內(nèi)出血；第4周（W4），腫瘤內(nèi)出現(xiàn)大片狀壞死，可見大量不規(guī)則血管，切片區(qū)域有大量內(nèi)出血。

圖7 腫瘤發(fā)展過程1～4周（A-D組）電特性變化a.電導(dǎo)率；b.介電常數(shù)Fig 7 Changes in the EPs of the tumor during the 1～4 weeks（A-D group）a.Conductivity；b.Permittivity

圖8 腫瘤發(fā)展過程1～4周（A-D組）病理切片F(xiàn)ig 8 Pathological sections of the tumor during the 1～4 weeks（A-D group）

4 討論

近年來，國內(nèi)眾多報(bào)道聚焦于生物組織真實(shí)電特性數(shù)據(jù)的研究［8，10］，但仍未得到令人滿意的結(jié)果，原因是生物組織真實(shí)電特性的測量結(jié)果受生物組織樣本狀態(tài)及測量條件等多因素的影響［11］。其中，離體測量對測量結(jié)果的影響較大，原因是組織離體后細(xì)胞的含水量、溫度等與在體相比均發(fā)生了明顯變化［12，13］。當(dāng)生物組織從生物體切下后，其組織的穩(wěn)定性與在體相比有所下降，并且這種下降隨著組織離體時(shí)間的增加而增加［14］。因此，在體測量是獲取生物組織真實(shí)電特性的最好方法。另外，組織與測量探頭接觸是否緊密對測量結(jié)果也有影響。目前已有的測量探頭普遍適用于離體組織，并且有特定的樣本制備要求，這就對生物組織的真實(shí)形態(tài)造成了破壞，從而對測量結(jié)果產(chǎn)生了影響。因此，本研究自制了小尺寸刺入式電特性測量探頭，并且采用該探頭在0.5～5 MHz頻率范圍內(nèi)對正常脂肪組織、肌肉組織及乳腺腫瘤組織的電特性進(jìn)行了在體測量，得到了該低頻率范圍內(nèi)生物組織的在體電導(dǎo)率和介電常數(shù)。通過對測量數(shù)據(jù)的分析表明，用該探頭測量所得的離體、在體生物組織電特性數(shù)據(jù)存在差異（P＜0.01）。

生物組織的電特性具有分布不均勻性及頻率-溫度依賴性。其中，分布不均勻性的原因是生物體內(nèi)細(xì)胞種類、密度、細(xì)胞膜性結(jié)構(gòu)、內(nèi)外電解液成分和濃度不同，進(jìn)而導(dǎo)致組織含水量不同，最終導(dǎo)致生物體內(nèi)各組織的電特性不同，同一組織不同部位的電特性也不相同［15］。由此，可推斷在組織癌變的早期階段，由于組織細(xì)胞含水量和細(xì)胞電解液含量發(fā)生改變，導(dǎo)致組織電特性與正常組織存在明顯差異［3，16-17］。目前，根據(jù)組織電特性變化診斷早期癌癥是一個(gè)研究熱點(diǎn)［14，18］。本研究采用小尺寸探頭對裸鼠乳腺癌組織測量的平均電導(dǎo)率比肌肉組織高出4.6倍（P＜0.01），而比脂肪組織則高出9倍（P＜0.01）；乳腺癌組織的平均介電常數(shù)比肌肉組織高出23倍（P＜0.01），而比脂肪組織高出46倍（P＜0.01）。從該結(jié)果中可以看出，癌癥組織的電特性均高于正常組織，這就為應(yīng)用電特性診斷早期乳腺癌提供了數(shù)據(jù)支持。

為了進(jìn)一步探究如何利用組織電特性數(shù)據(jù)鑒別早期癌癥，研究了組織癌變過程中電特性的變化，對裸鼠乳腺癌不同生長時(shí)期的電特性進(jìn)行分階段、分組測量，得出隨著乳腺癌的發(fā)展，乳腺組織的電導(dǎo)率和介電常數(shù)均逐漸增大，增長率則逐漸降低，說明在乳腺癌發(fā)展的早期階段，乳腺癌組織的電導(dǎo)率和介電常數(shù)變化較快，該結(jié)果與病理結(jié)果相吻合，這也為應(yīng)用電導(dǎo)率和介電常數(shù)診斷早期癌癥提供了依據(jù)。本研究自制的探頭尺寸較?。ㄓ行Ы佑|體積0.25π mm3），對組織破壞小，因此可以對組織實(shí)施微創(chuàng)檢測。本研究的局限性是實(shí)驗(yàn)中所制備的裸鼠乳腺癌模型為種植模型，其對于癌癥真實(shí)的發(fā)展過程還原度較誘導(dǎo)模型低，下一步的實(shí)驗(yàn)應(yīng)對誘導(dǎo)模型的電特性加以研究，進(jìn)而總結(jié)誘導(dǎo)乳腺癌模型和種植乳腺癌模型在電特性上的差別。

5 結(jié)論

本研究采用自制小尺寸探頭在體測量裸鼠乳腺癌的發(fā)展過程中的電特性參數(shù)。測量了裸鼠乳腺癌不同發(fā)展階段電特性的在體數(shù)據(jù)，并與離體電特性數(shù)據(jù)及正常組織的電特性數(shù)據(jù)進(jìn)行了對比，為今后應(yīng)用電特性診斷早期癌癥奠定了基礎(chǔ)。