范妙璇+董嬌嬌+王京輝+郭洪祝+陳有根+傅欣彤

[摘要] 該文建立了一種同時(shí)檢測白茅根中16種真菌毒素的QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged， Safe）超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量分析方法。白茅根以1%乙酸-乙腈超聲提取，QuEChERS方法凈化，用甲醇和含0.01%甲酸水溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，超高效液相色譜儀應(yīng)用Agilent Eclipse Plus C18色譜柱，優(yōu)化選擇在電噴霧離子源正離子模式下以多反應(yīng)監(jiān)測方式檢測。結(jié)果表明，16種真菌毒素在各自線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r在0.996 2～1.000，定量限為0.03～186.68 μg·kg-1，回收率為 60.28%～129.2%，RSD為 0.29%～11%。該方法凈化效果好、靈敏度高、重復(fù)性好，適用于基質(zhì)成分復(fù)雜的白茅根中多種真菌毒素的定量檢測。

[關(guān)鍵詞] 真菌毒素； QuEChERS法； 超高效液相-三重四級桿聯(lián)用質(zhì)譜； 白茅根

[Abstract] A method for the simultaneous determination of sixteen mycotoxins in cogon rootstalk was developed using ultra-performance liquid chromatography coupled with triple quadropole mass spectrometry（UPLC-QqQ-MS/MS）. The samples were extracted with acetonitrile contained 1% acetic acid and purified by QuEChERS method. The separation was performed on an Agilent Eclipse Plus C18 column by gradient elution using methanol and 0.01% aqueous formic acid as mobile phase. The targeted compounds were detected in MRM mode by mass spectrometry with electrospray ionization（ESI）source operated in positive ionization mode. The linear relationships of the sixteen mycotoxins were good in their respective linear ranges. The correlation coefficients（r）ranged among 0.996 2-1.000. The LOQs of the sixteen mycotoxins were between 0.03 and 186.68 μg·kg-1. The average recoveries ranged from 60.28% to 129.2% with relative standard deviations（RSDs）within 0.29%-11%. The results demonstrated that the proposed method was sensitive and accurate， and suitable for the mycotoxins quantification in cogon rootstalk.

[Key words] mycotoxin； QuEChERS； UPLC-QqQ-MS/MS； cogon rootstalk

白茅根為禾本科植物白茅Imperata cylindrical Beauv. var. major（Mees）C. E. Hubb.的新鮮或干燥根莖，具有涼血止血，清熱利尿的功效 [1]。在食品、保健食品和中藥中有廣泛的應(yīng)用。真菌毒素是真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，產(chǎn)毒菌種主要分為曲霉菌毒素（如黃曲霉毒素、赭曲霉毒素等）和鐮刀菌毒素（如T-2 毒素、HT-2 毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等）等^[2]。動物試驗(yàn)和流行病學(xué)的調(diào)查結(jié)果表明，許多真菌毒素可在體內(nèi)積累后產(chǎn)生致癌、致畸、致突變、類激素中毒，白細(xì)胞缺乏癥等，對機(jī)體造成永久性損害^[3]。隨著對真菌毒素危害的深入研究，公眾逐漸認(rèn)識到其對社會經(jīng)濟(jì)和人類健康造成的嚴(yán)重威脅，各國政府對藥品、食品中真菌毒素的分布及檢測也都予以了極大的關(guān)注，歐美等國家對此設(shè)定了嚴(yán)格的限量規(guī)定^[4]。真菌毒素檢測方法的研究與開發(fā)一直是熱點(diǎn)和難點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地同時(shí)測定多種毒素是一個(gè)長期的技術(shù)挑戰(zhàn)。QuEChERS（Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged，Safe）法是利用吸附劑填料與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達(dá)到除雜凈化的目的。QuEChERS方法回收率較高，精確度和準(zhǔn)確度高^[5]，可分析的真菌范圍廣，分析速度快，溶劑使用量少^[6]，污染小，價(jià)格低廉且不使用含氯化物溶劑，操作簡便且裝置簡單^[7]。本文采用QuEChERS-超高相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜同時(shí)測定白茅根中黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2），伏馬毒素B1，B2（FB1，F(xiàn)B2），赭曲霉毒素A（OTA），T-2毒素，HT-2毒素，ST毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-ACE），15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-ACE）等16種真菌毒素，該方法快速、準(zhǔn)確，適用于真菌毒素多成分含量測定。

1 材料

1.1 儀器

超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜儀（UHPLC-TSQ QUANTUM，美國Thermo-Fisher公司），配有二極管陣列檢測器（PDA）、電噴霧離子源（ESI）、Xcalibur工作站等。1/10萬分析天平（賽多利斯CP225D）高速離心機(jī)（TGL-16），渦旋儀（IKA-MS3），超聲波清洗器（KQ-250DB）。

1.2 試劑

甲醇和乙腈（Fisher公司，HPLC級），實(shí)驗(yàn)用水為高純水，乙酸（色譜純）；無水硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸三鈉均為分析純；檸檬酸二鈉為分析純。

1.3 對照品

黃曲霉毒素B1，B2，G1，G2，M1，M2（AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，AFM1，AFM2），伏馬毒素B1，B2（FB1，F(xiàn)B2），赭曲霉毒素A（OTA），T-2毒素，HT-2毒素，ST毒素，脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON），玉米赤霉烯酮（ZEN），3-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（3-ACE），15-乙酰脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（15-ACE），以上對照品均購自美國SUPELCO公司。

1.4 樣品信息

56份樣品采集自全國，其中海南省3份、安徽省9份、河南省10份、湖南省12份、山西省12份、四川省5份和云南省5份。經(jīng)中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心金艷博士鑒定為白茅根。

2 方法

2.1 混合對照品溶液的制備

各精密稱取各對照品適量，加甲醇制成含DON，3ACE，15ACE，HT-2，各1萬 μg·L-1；ST，T-2，ZEN，各10 μg·L-1；AFB1，AFB2，AFG1，AFG2，各30 μg·L-1；OTA為1 μg·L-1；AFM2為10.6 μg·L-1；AFM1為1 000 μg·L-1；FB1為515 μg·L-1；FB2為442.60 μg·L-1的16種真菌毒素混合對照品溶液。

2.2 樣品預(yù)處理方法

供試品溶液的制備取白茅根粉末（過40目篩）2.0 g，精密稱定，置50 mL離心管中，精密加入8 mL純凈水，渦旋30 s再精密加入1%的乙酸-乙腈溶液20 mL，密閉，超聲（500 W，40 kHz）提取30 min，期間振蕩2次，取出，再分別精密加入4.0 g無水硫酸鎂，1.0 g氯化鈉，1.0 g檸檬酸三鈉，0.5 g檸檬酸二鈉，渦旋振蕩2 min，以4 500 r·min-1離心10 min，精密取上清液5 mL，于60 ℃水浴鍋揮至近干，用2 mL流動相（起始比例）復(fù)溶，渦旋混勻后過0.22 μm微孔濾膜，即得。

2.3 色譜及質(zhì)譜條件

2.3.1 色譜條件 Agilent Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×100 mm，1.8 μm）；流動相為甲醇（A）-含0.01%甲酸水溶液（B），梯度洗脫為0～2 min，50% A；2～5 min，50%～60% A；5～10 min，60%～70% A；10～10.5 min，70%～85%A；10.5～15 min，85%～90% A；15～16.5 min，90%～100%，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧離子源；檢測方式：選擇反應(yīng)離子監(jiān)測（SRM）；毛細(xì)管電壓：4.0 kV；霧化氣流速：10.0 L·min-1；脫溶劑氣流速：30.0 L·min-1；脫溶劑管溫度：325 ℃；加熱模塊溫度：325 ℃；采集模式為正離子模式，監(jiān)測離子對（m/z）和其他參數(shù)見表1。

3 結(jié)果

3.1 方法專屬性

在上述色譜質(zhì)譜條件下，16種真菌毒素SRM定量離子圖見圖1。從圖可知，16種真菌毒素分離良好，而空白基質(zhì)加標(biāo)樣品的分析表明基質(zhì)成分不干擾被測真菌毒素的檢測。

3.2 線性關(guān)系及定量限

選取不含真菌毒素的白茅根作為空白樣品，按樣品預(yù)處理方法制備空白基質(zhì)溶液，添加1.3中16種真菌毒素混合對照品溶液分別稀釋5，10，50，100，250，500倍，制作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以待測化合物色譜峰峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣濃度（X，ng·kg-1）進(jìn)行線性回歸。線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)，見表2。以線性方程中最低添加濃度點(diǎn)的數(shù)據(jù)，根據(jù)3倍信噪比計(jì)算16種毒素的檢測限，10倍信噪比計(jì)算16種毒素的定量限，見表2。

3.3 方法回收率及精密度

取白茅根空白樣品2.0 g，共9份，按低、中、高3水平分別添加對照品儲備液 50，100，200 μL，每個(gè)加標(biāo)水平平行3份，按上述方法制備供試品溶液并測定，計(jì)算各真菌毒素的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表2。結(jié)果表明，回收率為60.28%～129.2%，RSD為0.29%～11%。

3.4 樣品的檢測

取白茅根樣品56份，按上述方法測定，結(jié)果見表3。

4 討論

在液質(zhì)聯(lián)用分析中，流動相選擇需要同時(shí)兼顧目標(biāo)成分分離度和離子化效率。本研究比較了甲醇和乙腈作為流動相A，純水、1 mmol·L-1乙酸銨、0.01%乙酸和1 mmol·L-1乙酸銨混合溶液、0.01%乙酸及0.01%甲酸為流動相B，同時(shí)啟用正負(fù)離子快速切換模式，開展選擇反應(yīng)監(jiān)測16種真菌毒素條件優(yōu)化試驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，甲醇作為流動相A時(shí)，其靈敏度明顯高于乙腈，因此選擇甲醇作為流動相A。

ZEN，OTA，F(xiàn)B1，F(xiàn)B2等化合物在負(fù)離子模式下響應(yīng)值不高，且正負(fù)離子同時(shí)掃描會降低方法的靈敏度，故選擇正離子模式。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，純水作為流動相B時(shí)，多種真菌毒素的離子化效率不高。當(dāng)流動相中存在乙酸銨時(shí)，雖然大部分對照品離子響應(yīng)加強(qiáng)，但FB1和FB2無響應(yīng)。通過優(yōu)化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，乙酸和甲酸均能使待測的16種真菌毒素在正離子模式下有較好的離子響應(yīng)，但相較而言甲酸離子化效率更好，故選擇0.01%甲酸作為流動相B。

白茅根中糖和淀粉含量高，其中糖類含量達(dá)總提取物的80%以上^[8]，大量的糖和淀粉類物質(zhì)導(dǎo)致提取液質(zhì)地黏稠，且對于所檢測的真菌毒素有明顯的基質(zhì)減弱效應(yīng)。因此，在條件優(yōu)化時(shí)，需要兼顧真菌毒素提取效率及雜質(zhì)溶解。本文考察了1%乙酸-乙腈溶液、100%乙腈、75%乙腈和50%乙腈的提取效率，結(jié)果表明，使用1%乙酸-乙腈溶液提取在滿足回收率要求的同時(shí)有著更高的檢測靈敏度。

在前處理方法上，考察了QuEChERS法和免疫親和柱法。相對免疫親和柱的特異選擇性強(qiáng)和造價(jià)高等特點(diǎn)，QuEChERS法具有更廣譜便捷且廉價(jià)等諸多優(yōu)勢。相比較QuEChERS法性價(jià)比更高，更適合于大批次量樣品的檢測和快速篩查。另外，本研究還對QuEChERS法開展了進(jìn)一步優(yōu)化，提高其回收率的方法考察正在研究進(jìn)行中。

由于白茅根樣本均為野外采集，未采取嚴(yán)格地防霉控制，除植物本身原因外，在采集、干燥、儲藏、運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)都可能會存在污染霉菌，這可能是樣品中檢出真菌毒素的直接原因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果反映出白茅根容易受到真菌毒素的污染，尤其是黃曲霉毒素類。因此，提示白茅根作為食品或藥材時(shí)，應(yīng)特別注意從采集加工到儲藏運(yùn)輸?shù)雀鱾€(gè)環(huán)節(jié)，嚴(yán)格控制。

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[責(zé)任編輯 丁廣治]