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        益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓細胞C/EBPα、GM—CSF、GM—CSFRα、MAFBmRNA表達的影響

        2017-10-27 16:57:11岳竹君王文娟賈富霞
        中國醫(yī)藥導報 2017年25期
        關鍵詞:小鼠

        岳竹君+王文娟+賈富霞

        [摘要] 目的 觀察益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓細胞CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、粒-單系祖細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒-單系祖細胞集落刺激因子受體α(GM-CSFRα)、轉(zhuǎn)錄因子MAFB mRNA表達的影響,探討該藥調(diào)控骨髓造血的作用機制。 方法 采用隨機數(shù)字表法將78只雄性昆明小鼠隨機分為正常組、模型組、粒系祖細胞集落刺激因子(G-CSF)組及益髓生血顆粒高、中、低劑量組。益髓生血顆粒高、中、低劑量組先預防給藥2 d,分別按12、6、3 g/(kg·d)灌胃。采用60Co-γ射線全身一次性照射造模。造模第2天,G-CSF組按30 μg/(kg·d)皮下注射G-CSF注射液,益髓生血顆粒高、中、低劑量組給藥方法同預防給藥,其余組均給予等量蒸餾水,連續(xù)14 d。進行小鼠骨髓細胞計數(shù);采用實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測骨髓細胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達。 結(jié)果 益髓生血顆粒能明顯提高輻射損傷小鼠骨髓細胞計數(shù)(均P < 0.05),上調(diào)骨髓細胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達(均P < 0.05),以低劑量組效果最佳。 結(jié)論 益髓生血顆粒可促進骨髓造血,其機制與上調(diào)骨髓細胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達有關。

        [關鍵詞] 益髓生血顆粒;輻射損傷;CCAAT增強子結(jié)合蛋白α;粒-單系祖細胞集落刺激因子;粒-單系祖細胞集落刺激因子受體α;MAFB;基因表達

        [中圖分類號] R818.02 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2017)09(a)-0017-06

        [Abstract] Objective To study the influence of Yisui Shengxue Granules on CCAAT/enhancer binding protein α (C/EBPα), granulocyte-macrophage colon stimulating factor (GM-CSF), granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha (GM-CSFRα) and transcription factor MAFB mRNA expression in bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays, and to explore its mechanism of promoting bone marrow hematopoiesis. Methods Seventy-eight male Kunming mice were randomly divided into normal control group, model group, granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) group, low-dose, middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group. Two days before modeling, mice in low-dose, middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received 12, 6, 3 g/(kg·d) Yisui Shengxue Granules ig respectively. On modeling day except normal control group, mice were established by 60Co-γ ray in other five groups. The 2nd day after modeling, mice in G-CSF group received 30 μg/(kg·d) G-CSF by injection, mice in normal control group and model group received the same volume distilled water, mice in low-dose, middle-dose and high-dose Yisui Shengxue Granules group received the same way as before modeling, the course lasted 14 days. Bone marrow cells were counted. The mRNA expression of C/EBPα, GM-CSF, GM-CSFRα and MAFB in BM cells was analyzed by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction. Results The data showed that, Yisui Shengxue Granules could increase the count of bone marrow cells of mice irradiated by 60Co-γ rays (all P < 0.05), and up-regulate the mRNA expression of GM-CSF, GM-CSFRα and MAFB in BM cells (all P < 0.05). The effect of low-dose Yisui Shengxue Granules group was the best. Conclusion These results suggest that Yisui Shengxue Granules can promote bone marrow hematopoiesis, the mechanism may have some relation to up-regulating the mRNA expression of GM-CSF, GM-CSFRα and MAFB in BM cells.endprint

        [Key words] Yisui Shengxue Granules; Radiation damage; CCAAT/enhancer binding protein α; Granulocyte-macrophage colon stimulating factor; Granulocyte-macrophage colon stimulating factor receptor alpha; MAFB; mRNA expression

        益髓生血顆粒是基于中醫(yī)“腎藏精生髓、髓生血”理論而組方的中藥復方制劑,具有補腎健脾、益髓生血的功效。前期研究已證實該藥對各類貧血均具有一定的改善作用,能明顯促進紅細胞、白細胞生成,有效提升血紅蛋白水平[1-3]。相關機制研究表明,該藥能明顯促進骨髓造血,促進紅系、粒系分化,調(diào)控細胞周期,并提升骨髓微環(huán)境中干細胞因子(SCF)、白細胞介素-3(IL-3)、粒-單系祖細胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒系祖細胞集落刺激因子(G-CSF)等造血生長因子含量[4-7]。為進一步明確益髓生血顆粒促進骨髓造血細胞向紅系、粒系分化的具體機制,本研究采用小鼠骨髓急性輻射損傷模型,以益髓生血顆粒進行干預,通過觀察各組間骨髓有核細胞計數(shù),檢測紅系、粒系分化相關因子的基因表達來明確該藥的具體作用。

        1 材料與方法

        1.1 動物

        健康雄性昆明種小鼠,體重(20±2)g(4周齡),SPF級,購自北京華阜康生物科技股份有限公司,實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK(京)2009-0007。實驗動物送達后于清潔級動物房適應性飼養(yǎng)5 d,正常飼料喂養(yǎng),自由攝食、飲水,飼養(yǎng)溫度(22±1)℃,濕度40%~70%,噪聲<60 dB,換氣次數(shù)10~20次/min,光照模擬晝夜交替,光照時間每天12 h。本研究已獲得單位倫理委員會批準。

        1.2 藥物與試劑

        益髓生血顆粒(益髓生血顆粒),由山茱萸、制何首烏、熟地、補骨脂、炙黃芪、黨參、阿膠、當歸、雞血藤、鱉甲、砂仁組成,藥物比例、制備工藝及質(zhì)量標準均參照專利No.CN200610078866.X,中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院大興制藥廠生產(chǎn),12 g/袋,生藥含量23.6 g(批號20110506);重組人粒細胞刺激因子(G-CSF)注射液,廈門特寶生物工程股份有限公司生產(chǎn),75 μg/瓶(批號201111B45);分析純氯仿、異丙醇、無水乙醇,均購自北京化學試劑公司;Trizol試劑,購自美國Invitrogen公司(批號14105);Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,購自美國MBI公司(批號00044977);SYBR Green PCR Master Mix試劑盒,購自美國應用生物公司(批號1201329)。

        1.3 儀器

        鈷-60(60Co)遠距離治療機(中國核動力院設備制造廠生產(chǎn));7900HT型熒光定量PCR儀(美國ABI公司);DU-600紫外分光光度計(BECKMAN公司);高速冷凍離心機(BECKMAN公司)。

        1.4 分組、造模與給藥

        采用隨機數(shù)字表法將78只小鼠隨機分為正常組、模型組、G-CSF組和益髓生血顆粒高、中、低劑量組,每組13只。造模前,益髓生血顆粒高、中、低劑量組先預防給藥2 d,分別按12 g/(kg·d)(藥液濃度1.2 g/mL,為臨床成人日劑量的20倍)、6 g/(kg·d)(藥液濃度0.6 g/mL,為臨床成人日劑量的10倍)、3 g/(kg·d)(藥液濃度0.3 g/mL,為臨床成人日劑量的5倍)灌胃。造模當日采用60Co-γ射線全身一次性照射造成小鼠骨髓急性損傷,照射劑量為3.5 Gy,劑量率為1.31 Gy/min。造模第2天,G-CSF組按30 μg/(kg·d)(注射容積10 mL/kg)皮下注射G-CSF注射液,益髓生血顆粒高、中、低劑量組給藥方法同預防給藥,其余各組給予等量蒸餾水,連續(xù)14 d。

        1.5 骨髓有核細胞計數(shù)

        頸椎脫臼處死小鼠,剝?nèi)⌒∈髢蓚?cè)股骨,用剪刀剪開股骨兩頭,暴露骨髓腔,用無菌注射器4號針頭吸取2 mL PBS液(0.1 mol/L,pH 7.4),反復沖洗骨髓腔,收集骨髓細胞。

        將骨髓細胞吹打成單細胞懸液,取10 μL單細胞懸液,加990 μL生理鹽水,吹打混勻。取10 μL混合液,從血細胞計數(shù)板邊緩緩滴入,使之充滿計數(shù)板和蓋片之間的空隙,注意不要出現(xiàn)氣泡。于10×10倍低倍鏡下分別計數(shù)4個大方格中細胞數(shù)。每毫升細胞數(shù)=(4大方格內(nèi)細胞數(shù)/4)×104×稀釋倍數(shù)100。

        1.6 實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測骨髓細胞CCAAT增強子結(jié)合蛋白α(C/EBPα)、GM-CSF、粒-單系祖細胞集落刺激因子受體α(GM-CSFRα)、轉(zhuǎn)錄因子MAFB mRNA表達

        1.6.1 RNA提取 將骨髓細胞懸液以2500 r/min(r = 14 cm)離心10 min去上清,分別加入1 mL Trizol裂解細胞,吹打混勻后按照Trizol試劑說明書提取骨髓細胞總RNA。以紫外分光光度計及1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的含量、純度及完整性。

        1.6.2 cDNA合成 按照Fermentas K1622 RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行cDNA合成。取總RNA樣品1~5 μg,用DEPC水稀釋成11 μL,加入OligoDT 1 μL,于65℃加熱變性5 min,快速在冰上冷卻,加入5×Reaction Buffer 4 μL、RNA Inhibitor 1 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL,反應總體積為20 μL,于42℃反應60 min,70℃加熱10 min終止反應。

        1.6.3 Q-PCR反應 按照SYBR Green PCR Master Mix試劑盒說明書,在7900HT型熒光定量PCR儀上進行Q-PCR反應。反應體系:cDNA 1 μL,10 μmol/L上游引物1 μL,10 μmol/L下游引物1 μL,2×SYBR Green PCR Mix 10 μL,加DEPC水至總體積20 μL。引物由北京賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,引物序列見表1。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內(nèi)參基因。反應條件:95℃預變性5 min;95℃變性35 s,53℃退火35 s,72℃延伸50 s,共40個循環(huán);72℃后延伸8 min。整個反應過程中收集熒光信號,反應結(jié)束后使用PCR儀自帶軟件分析PCR過程中每個反應管內(nèi)熒光信號到達設定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù),即循環(huán)閾值(Ct值)。做熔解曲線判斷PCR反應的特異性,做擴增曲線判斷PCR的擴增效果。endprint

        1.7 統(tǒng)計學方法

        采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布者,以均數(shù)±標準差(x±s)表示。多組間差異的顯著性分析,符合正態(tài)分布者采用單因素方差分析進行統(tǒng)計推斷,非正態(tài)分布者采用秩和檢驗進行統(tǒng)計推斷。組間比較,方差齊采用LSD檢驗,方差不齊采用Dunnett's T檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié)果

        2.1 骨髓有核細胞計數(shù)

        經(jīng)單因素方差分析及LSD檢驗,結(jié)果顯示:造模小鼠骨髓有核細胞數(shù)均恢復至正常組水平,但益髓生血顆粒高、中、低劑量組骨髓有核細胞計數(shù)明顯高于模型組,差異有高度統(tǒng)計學意義(均P < 0.01)。說明益髓生血顆粒能有效提高輻射損傷小鼠骨髓有核細胞數(shù),對骨髓造血具有一定的促進作用。各組小鼠骨髓有核細胞計數(shù)見表2。

        2.2 骨髓細胞C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達水平

        GAPDH、C/EBPα、MAFB的熔解曲線均為單一峰,并且沒有加寬和變形,說明為特異性片段擴增;GM-CSF、GM-CSFRα的熔解曲線主峰后面出現(xiàn)小峰,經(jīng)瓊脂糖電泳證實是引物二聚體所致,與退火溫度偏低有關。各基因的擴增曲線均指數(shù)擴增期明顯,表現(xiàn)出較為理想的擴增曲線,表明本研究數(shù)據(jù)足夠應用于基因的相對定量分析。各基因的熔解曲線及擴增曲線見圖1~5。

        采用2-ΔΔCT法進行基因的相對定量分析。經(jīng)單因素方差分析及LSD檢驗,結(jié)果顯示:各組小鼠骨髓細胞C/EBPα mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(均P > 0.05);益髓生血顆粒低劑量組小鼠骨髓細胞GM-CSF mRNA表達明顯高于正常組及模型組(均P < 0.05);益髓生血顆粒低劑量組小鼠骨髓細胞GM-CSFRα mRNA表達明顯高于正常組(P < 0.05);益髓生血顆粒高、中、低劑量組小鼠骨髓細胞MAFB mRNA表達明顯高于正常組及模型組(均P < 0.05)。見表3。

        3 討論

        骨髓是對輻射極為敏感的組織,機體短時間內(nèi)受到超過一定劑量的輻射照射可引發(fā)骨髓造血功能嚴重受損,造血細胞有絲分裂停止,細胞更新中斷,外周血中各類血細胞數(shù)量劇烈下降。其中輻射誘導的造血干、祖細胞凋亡主要引發(fā)急性骨髓抑制,而其誘導的造血干細胞衰老及分化則可引發(fā)長期骨髓抑制[8-9]。中醫(yī)根據(jù)骨髓抑制患者面色蒼白、神疲乏力、頭昏眩暈、心悸失眠、食欲不振等臨床表現(xiàn),多將該病癥歸屬于“血虛”“虛勞”等范疇[10-11]。中醫(yī)理論認為,血液的生成離不開后天之本脾和先天之本腎,其中脾為氣血化生之源,而腎藏精生髓,髓又可化血。因此要改善骨髓抑制,應當從脾腎入手,以補腎健脾、益髓生血為基本治法。

        益髓生血顆粒就是基于上述治法組方而成的中藥制劑,方中山茱萸、制何首烏、熟地、補骨脂、鱉甲補腎益精生血,炙黃芪、黨參、砂仁、阿膠、當歸、雞血藤健脾開胃養(yǎng)血活血。臨床研究證實該藥能有效改善腫瘤放化療引發(fā)的骨髓抑制[1]。實驗研究證實,益髓生血顆??娠@著升高輻射損傷小鼠外周血白細胞數(shù)、紅細胞、血小板數(shù)及血紅蛋白水平[12-13],可通過促進骨髓細胞由G0/G1期進入S期而明顯促進細胞增殖[6],還能顯著增加骨髓造血微環(huán)境中造血生長因子GM-CSF、IL-3、SCF含量[7],說明益髓生血顆粒可有效改善輻射損傷引發(fā)的急性骨髓抑制,具有促進骨髓造血的作用。

        為進一步探討益髓生血顆粒促進骨髓造血的機制,本研究采用小鼠骨髓急性輻射損傷模型,首先觀察了益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓有核細胞的影響。相關研究顯示,經(jīng)輻射照射后小鼠骨髓有核細胞數(shù)明顯下降[14]。本研究結(jié)果顯示,經(jīng)過一段時間的恢復,輻射損傷小鼠骨髓有核細胞數(shù)已恢復至正常水平,但益髓生血顆粒組小鼠骨髓有核細胞數(shù)明顯高于模型小鼠(P < 0.01),說明益髓生血顆粒能有效提高輻射損傷小鼠骨髓有核細胞數(shù),對骨髓造血具有明顯的促進作用。本研究選取了對骨髓造血細胞增殖分化具有重要作用的4個相關因子C/EBPα、GM-CSF、GM-CSFR、MAFB,對其在骨髓細胞中的基因表達水平進行研究,其中C/EBPα在造血系統(tǒng)中只表達于髓系細胞,主要在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控粒系和單核系的分化[15-16]。GM-CSF是具有廣譜效應的造血生長因子,對髓系造血祖細胞具有廣泛的促增殖活性,它通過與其高親和力受體GM-CSFR結(jié)合而發(fā)揮生物學效應,二者結(jié)合后尤其對粒-單系血細胞具有重要調(diào)控作用[17-19]。MAFB可影響髓系前體細胞的增殖和分化[20]。實驗結(jié)果顯示,益髓生血顆粒對C/EBPα mRNA表達水平無明顯作用(P > 0.05),而對GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB mRNA表達具有上調(diào)作用(均P < 0.05)。

        綜上所述,本研究提示益髓生血顆粒能顯著促進輻射損傷小鼠骨髓造血,其作用機制與上調(diào)骨髓細胞GM-CSF、GM-CSFRα、MAFB的mRNA表達和促進髓系增殖分化有密切關系。

        [參考文獻]

        [1] 吳志奎,崔京華,姜葆華,等.腎生髓理論的現(xiàn)代研究[J].中醫(yī)雜志,1999,40(10):626.

        [2] 易杰,吳志奎,黃啟福.益髓生血靈及其不同組分對溶血性貧血小鼠的影響[J].遼寧中醫(yī)學院學報,2004,6(3):227.

        [3] Fang SP,Wu ZK,Zhang XH,et al. Clinical observation on YiSuiShengXueGranule on treating 156 patients with β-thalassemia major and the molecular mechanism study [J]. Biol Pharm Bull,2007,30(11):2084-2087.

        [4] 張新華,吳志奎,黃有文,等.益髓生血靈對小鼠骨髓造血干-祖細胞的影響[J].浙江中醫(yī)雜志,2003,37(10):448.endprint

        [5] 黃有文,張新華,王榮新,等.補腎生血治療β珠蛋白生成障礙性貧血進一步臨床研究和免疫功能測定[J].臨床血液學雜志,2000,13(2):54.

        [6] 王文娟,劉莉,鄒陽,等.益髓生血顆粒對輻射損傷小鼠骨髓細胞周期的影響[J].中國實驗方劑學雜志,2013,19(6):169-172.

        [7] 王文娟,方素萍,劉詠梅,等.補腎益髓法對輻射損傷小鼠造血生長因子的影響[J].北京中醫(yī)藥大學學報,2015, 38(1):29-32.

        [8] Chang J,F(xiàn)eng W,Wang Y,et al. 28Si total body irradiation injures bone marrow hematopoietic stem cells via induction of cellular apoptosis [J]. Life Sci Space Res(Amst),2017, 13:39-44.

        [9] 方連英,王彥,徐暢,等.電離輻射誘導造血干細胞損傷的分子機制研究進展[J].基礎醫(yī)學與臨床,2017,37(2):256-260.

        [10] 吳曉勇,王云龍,陳廣雷.補腎調(diào)肝化瘀法防治化療骨髓抑制探討[J].四川中醫(yī),2017,35(1):25-27.

        [11] 余瑩,范麗麗,程健,等.改良八珍湯治療急性白血病化療后骨髓抑制臨床觀察[J].中醫(yī)藥臨床雜志,2017,29(3):377-380.

        [12] 吳志奎.地中海貧血癥的中醫(yī)病機與治則治法[J].中醫(yī)雜志,2009,50(1):73-75.

        [13] 劉莉,鄒陽,李俊麗,等.補腎益髓對輻射損傷小鼠造血功能的影響-對輻射小鼠外周血相影響的研究[J].中國實驗方劑學雜志,2012,18(19):231-234.

        [14] 董輝,侯沁蓮,姜道利,等.聯(lián)苯雙酯對小鼠骨髓細胞輻射損傷的防護作用研究[J].中國醫(yī)藥導報,2017,14(4):4-7,26.

        [15] Zjablovskaja P,Kardosova M,Danek P,et al. EVI2B is a C/EBPα target gene required for granulocytic differentiation and functionality of hematopoietic progenitors [J]. Cell Death Differ,2017,24(4):705-716.

        [16] Bararia D,Kwok HS,Welner RS,et al. Acetylation of C/EBPα inhibits its granulopoietic function [J]. Nat Commun,2016,7:10968.

        [17] Lachmann G,Kurth J,von Haefen C,et al. In vivo application of Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating Factor enhances postoperative qualitative monocytic function [J]. Int J Med Sci,2017,14(4):367-375.

        [18] Ushach I,Zlotnik A. Biological role of granulocyte macro?鄄phage colony-stimulating factor(GM-CSF)and macrophage colony-stimulating factor(M-CSF)on cells of the myeloid lineage [J]. J Leukoc Biol,2016,100(3):481-489.

        [19] Chen W,Lv X,Liu C,et al. Hematopoietic stem/progenitor cell differentiation towards myeloid lineage is modulated by LIGHT/LIGHT receptor signaling [J]. J Cell Physiol,2017. doi:10.1002/jcp.25967. [Epub ahead of print]

        [20] Daassi D,Hamada M,Jeon H,et al. Differential expression patterns of MafB and c-Maf in macrophages in vivo and in vitro [J]. Biochem Biophys Res Commun,2016,473(1):118-124.

        (收稿日期:2017-05-04 本文編輯:張瑜杰)endprint

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